全 文 ：收稿日期:2009-10-09基金项目:国家 “十一五 ”科技支撑计划重点项目(2006BAI06A13);四川省科技支撑计划(2010SZ0007)作者简介:王跃华(1963-),女,教授 ,主要从事药用植物的教学 、科研工作;Tel:13980021790, Fax:028-83341003, E-mail:wangyaohua888@yahoo.com.cn。
离体培养条件对卷叶贝母鳞茎再生的影响
王跃华1 ,代　勇 2 ,何宗晟 1 ,孙雁霞1 ,闫胜杰 1 ,徐世军 2 ,王晓蓉2
(1.成都大学生物产业学院 ,四川 成都 610016;2.成都恩威集团(投资)有限公司 , 四川 成都 610041)
　　摘要　目的:筛选出卷叶贝母鳞茎再生的最佳离体培养条件。方法:通过对卷叶贝母开花期鳞茎的离体培养 ,
研究了不同光照条件 、培养温度 、激素配比以及病毒唑用量对卷叶贝母鳞茎再生的影响。结果与结论:卷叶贝母鳞
茎外植体进行适当的低温暗处理后 ,再转入光下培养 , 可明显地减轻外植体的褐化程度;鳞茎再生的最适培养温度
为(20±2)℃, 激素对鳞茎再生有明显的促进作用 , 其中以 6-BA2.0 mg/L和 NAA0.2 mg/L组合为最佳;浓度为
10 mg/L的病毒唑最适于鳞茎的再生。
　　关键词　离体培养条件;卷叶贝母;鳞茎再生
　　中图分类号:R282.2　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2010)06-0854-03
TheEffectsofinvitroCultureConditionsonRegenerationofFritilariacirrhosa
WANGYue-hua1 , DAIYong2 , HEZong-sheng1 , SUNYan-xia1 , YANSheng-jie1 , XUShi-jun2 , WANGXiao-rong2
(1.DepartmentofBiologicalEngineering, ChengduUniversity, Chengdu610160, China;2.ChengduEnweiGroupCo., Chengdu
610041, China)
Abstract　Objective:TheoptimalinvitrocultureconditionsfortheregenerationofFritilariacirrhosawerescreened.Methods:
ThroughtheinvitrocultureofthefloweringstageFritillariacirrhosa, theeffectofilumination, culturetemperature, hormonecombina-
tionandtheamountofribavirinontheregenerationofFritillariacirrhosawerestudied.ResultsandConclusion:Theexplantbrowning
levelcouldbeapparentlyreducedifthebulbwereculturedundertherayafterexposuretoproperlow-temperature.Theoptimaltemper-
aturefortheregenerationofbulbis(20 ±2)℃.Thehormonehasobviouspromotionaleffectontheregenerationofbulb, andthebest
combinationis6-BA2.0 mg/LplusNAA0.2 mg/L.Concentrationof10 mg/Lofribavirinisbestfortheregenerationofbulb.
Keywords　Invirtorcultureconditions;FritillariacirrhosaD.Don;Bulbregeneration
　　卷叶贝母(FritilariacirhosaD.Don)是百合科
多年生草本植物 ,其鳞茎主要含有贝母生物碱和甾
体皂甙类〔1〕等有效成分 ,为名贵的川产道地药材 。
自然界中卷叶贝母大约需要生长 4 ～ 5年的时间才
能收获鳞茎入药 ,并且存在药材产量和有效成分含
量低的问题 。因此如何能缩短药材生长周期 、提高
药材生产的产量和质量是当前卷叶贝母生产中亟待
解决的问题 。组织培养技术具有生长周期短 ,繁殖
率高 ,能摆脱大自然中四季 、昼夜的变化以及灾害性
气候对植物的不利影响 ,并可以根据人们的需求 ,大
量生产出药用植物的特定入药部位。
　　本文研究了不同离体培养条件对卷叶贝母鳞茎
再生的各种影响 ,旨在大规模地快速生产绿色无污
染的卷叶贝母药材鳞茎 ,以缓解卷叶贝母药材的紧
缺和更有效地保护卷叶贝母野生植物资源 。
1 　材料和方法
1.1 　材料　实验材料卷叶贝母由成都恩威集团提
供(采于四川康定),并由成都大学中药鉴定室张浩
教授鉴定为卷叶贝母 FritilariacirhosaD.Don。
1.2　方法　选取生长状况良好的卷叶贝母植株 ,
切取鳞茎 ,用水将其表面泥土洗净 ,掰开鳞片叶 ,用
2%次氯酸钠溶液漂洗 15min,用流水冲洗后吸干水
分 ,放在超净工作台上 ,用 0.1%升汞溶液消毒 9
min,并用无菌水冲洗 3次 ,将鳞片叶切成小块 ,接种
于鳞茎诱导培养基上。
1.2.1 　不同激素配比对鳞茎再生的影响:选择 MS
培养基为基本培养基 ,其中蔗糖浓度为 4%, pH
6.0,培养温度为(20 ±2)℃,光照条件设定为前 3
周暗培养 ,后 3周光培养 ,光强为 1 600Lx。培养基
中添加细胞分裂素 6-BA的浓度范围设定为 1 ～ 2
mg/L,生长素 NAA的浓度范围设定为 0.1 ～ 1.0
mg/L,共配制 15种培养基 ,见表 1。
1.2.2 　光暗条件对鳞茎再生的影响:将接种好的
鳞片叶置于以下条件培养:①6周光培养(LC);②
前 3周光培养 ,后 3周暗培养(LDC);③前 3周暗培
养 ,后 3周光培养(DLC);④6周暗培养(DC)。光
强为 1 600Lx。其鳞茎诱导培养基为 MS+6-BA2.0
mg/L+NAA0.2 mg/L,培养温度为(20±2)℃。
·854· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 6期 2010年 6月DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2010.06.002
1.2.3　温度对鳞茎再生的影响:将接种的鳞片叶
置于 5、10、15、20、25、30℃温度条件下培养 ,其它培
养条件同 “1.2.2”项下方法。
1.2.4　生长调节物质病毒唑对鳞茎再生的影响:
将鳞片叶分别接入加有 0、5、10、30、50mg/L五种不
同浓度病毒唑的培养基中 ,其它条件同 “1.2.2”项
下方法 。
1.2.5　实验数据统计:将鳞片叶接入培养基中 ,在
不同培养条件下培养 6周后 ,观察鳞片叶再生鳞茎
的生长情况 ,并统计出鳞茎诱导率和褐化率 。鳞茎
诱导率 =产生鳞茎的鳞片叶数 /接种鳞片叶数 ×
100%;鳞茎褐化率 =出现褐化的鳞片叶数 /接种鳞
片叶数 ×100%。
2 　结果与分析
2.1 　不同激素配比对卷叶贝母鳞茎再生的影响　
不同种类激素配比对卷叶贝母鳞茎再生有显著的影
响 ,结果见表 1。在没有附加任何激素的 A1培养基
中 ,在培养 6周时间内鳞片叶的平均鳞茎诱导率仅
为 6.4%,是 15种培养基中最低的;在只添加了激
素 NAA的 A2 ～A5的四种培养基上 ,尽管鳞片叶上
能够诱导产生出鳞茎 ,但其鳞茎诱导率较低 ,平均为
15.63%;而在培养基中只添加激素 6-BA1.0、2.0
mg/L的培养基中 ,鳞茎的诱导率分别为 32.5%和
30.0%,均高于单独使用激素 NAA的培养基。而在
培养基中加入 6-BA和 NAA两种激素组合的 A7 ～
A10、A12 ～ A15的八种培养基中 ,其平均鳞茎诱导
率为 59.06%,明显高于单独添加 6-BA或 NAA的
培养基 ,其中以激素配比为 6-BA2.0 mg/L+NAA
0.2mg/L的培养基中鳞茎诱导率最高为 85%,由此
可见在卷叶贝母鳞茎再生中 ,以 6-BA和 NAA两种
激素组合更有利于卷叶贝母鳞茎再生 。
2.2 　光照条件对卷叶贝母鳞茎再生的影响　不同
光照条件对卷叶贝母鳞茎再生的影响结果见表 2。
在连续进行 6周光照条件(LC)下培养 ,其鳞茎诱导
率最低仅为 27.5%,并且外植体的褐化情况也非常
严重 ,多数鳞片叶外植体从接种第 4 d就可以观察
到在其伤口处开始出现褐变 ,且随着连续光照培养
时间的延长 ,外植体褐化情况越严重 ,死亡率也越
高 。可能是由于持续光照能促进外植体的伤口处细
胞酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质 ,这种褐色醌
类物质不断向外扩散致使培养基逐渐变成褐色 ,而
且还会抑制其他酶的活性 〔2〕 ,最终影响了鳞茎的诱
导率降低。在 LDC条件下培养 ,其鳞片叶外植体褐
化率和鳞茎诱导率与 LC培养条件下相差不大 。在
DLC条件下培养 ,其鳞片叶外植体的褐化率明显下
降而诱导率却有着显著的增加 ,其鳞茎的诱导率最
高达到 85.0%,这可能与在 DLC条件下可以明显减
轻外植体的褐化程度有关。在 DC条件下培养 ,虽
然鳞片叶外植体的褐化率比 DLC条件下要低 ,但其
诱导率也比较低。由此说明 ,在鳞片叶再生鳞茎的
过程中 ,适宜的光照条件是有利于鳞茎再生的。所
以 ,在 DLC条件下最适合卷叶贝母鳞茎的再生。
　表 1　　　　不同激素种类和浓度对卷叶
贝母鳞茎再生的影响
培养基编号
激素浓度配比/(mg/L)
6-BA NAA
接种量/个
鳞茎诱导率/%
A1 0 0 40 6.4
A2 0 0.1 40 17.5
A3 0 0.2 40 10.0
A4 0 0.5 40 15.0
A5 0 1.0 40 20.0
A6 1.0 0 40 32.5
A7 1.0 0.1 40 47.5
A8 1.0 0.2 40 67.5
A9 1.0 0.5 40 55.0
A10 1.0 1.0 40 42.5
A11 2.0 0 40 30.0
A12 2.0 0.1 40 67.5
A13 2.0 0.2 40 85.0
A14 2.0 0.5 40 57.5
A15 2.0 1.0 40 50.0
　表 2　　不同光照条件对卷叶贝母鳞茎再生的影响
光照条件 接种外植体数 /个 外植体褐化率 /% 鳞茎诱导率 /%
LC 40 82.5 27.5
LDC 40 67.5 37.5
DLC 40 22.5 85.0
DC 40 17.5 52.5
2.3　温度对卷叶贝母鳞茎再生的影响　将接有卷
叶贝母鳞片叶的外植体置于不同温度条件下进行培
养 ,培养 6周后统计外植体的生长情况列于表 3中。
卷叶贝母鳞片叶外植体对温度的变化是比较敏感
的。在 5 ℃条件下培养 ,鳞片叶外植体的褐化率和
诱导率均较低;但随着温度的升高 ,鳞片叶外植体的
褐化率和鳞茎诱导率也随之增加 ,当培养温度增加
到 20 ℃时 , 鳞片叶外植体的诱导率达到最高为
75.0%;此后随着温度的继续上升 ,鳞片叶外植体的
诱导率逐渐下降 ,当温度为 30 ℃时 ,鳞片叶外植体
的诱导率为最低仅为 12.0%,且外植体的褐化率也
随之增加到最高为 85.0%,并出现大量鳞片叶外植
·855·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 6期 2010年 6月
体褐化死亡的情况 ,这主要是与一定程度的高温能
促进细胞内氧化酶的活性 ,从而促进细胞内酚类物
质的氧化〔3〕 ,从而使得鳞片叶外植体更容易褐化致
死 。结果显示 ,在卷叶贝母鳞片叶再生鳞茎的过程
中 , 10 ～ 25 ℃的培养温度有利于鳞片叶的再生 。这
主要与卷叶贝母植物喜低温 、阴湿的生长特性相一
致的。
　表 3　　不同温度条件对卷叶贝母鳞茎再生的影响
温度条件/℃ 接种量/个 外植体褐化率/% 鳞茎诱导率/%
5 40 5.0 10.0
10 40 12.5 30.0
15 40 17.5 42.5
20 40 27.5 75.0
25 40 50.0 47.5
30 40 85.0 12.0
2.4 　病毒唑对卷叶贝母鳞茎再生的影响　病毒唑
是一种强的单磷酸次黄嘌呤核苷(IMP)脱氢酶抑制
剂 ,它不仅作为一种抗生素在植物组织培养的除菌
方面应用较为广泛 ,而且病毒唑对植物组织培养中
丛生芽的诱导也有较好的促进作用〔4〕 ,高山林等利
用病毒唑有效的促进了暗紫贝母小鳞茎的诱导生
长 〔5〕。不同浓度病毒唑对卷叶贝母鳞片叶再生鳞
茎的影响 ,结果见表 4。当病毒唑的浓度在 5 ～ 10
mg/L,均能明显地诱导卷叶贝母鳞片叶外植体产生
鳞茎 ,但当病毒唑的浓度增加到 30 mg/L时 ,其鳞茎
诱导率开始下降 ,低于对照组(CK)的鳞茎诱导率 ,
并且随着病毒唑浓度的进一步增加到 50 mg/L时 ,
其鳞茎诱导率也下降到最低为 50.5%。其原因主
要是由于病毒唑结构与核苷类相似 ,具有与核苷类
细胞分裂素类似的活性;在高浓度时 ,病毒唑药剂会
对鳞片叶外植体细胞的生长产生一定的抑制作用 ,
从而影响了鳞茎的诱导率。通过研究结果可知 ,在
培养基中加入浓度为 10 mg/L的病毒唑最有利于卷
叶贝母鳞茎的再生。
　表 4　不同浓度病毒唑对卷叶贝母鳞茎再生的影响
病毒唑浓度 /(mg/L) 接种数 /个 鳞茎诱导率 /%
0(CK) 40 75.0
5 40 80.0
10 40 95.0
30 40 72.5
50 40 50.5
3　讨论
在植物组织培养过程中 ,光照和温度条件是非
常重要的环境因子 ,不仅影响细胞增殖和器官分化 ,
而且对培养细胞中次级代谢产物的形成和含量的增
加也有很大的促进作用 ,适宜的光照时间和温度条
件是有利于外植体的分化和生长的〔6〕。通过本实
验的研究发现 ,卷叶贝母鳞片叶外植体在 DLC光照
和(20±2)℃培养温度条件下最有利于鳞茎再生;
另外不同植物激素组合也是影响外植体生长最重要
的因素。在本实验的研究中笔者还筛选出了诱导鳞
茎产生的最佳培养基配方为 MS+6-BA2.0 mg/L+
NAA0.2 mg/L,并且进一步证实了在培养基中添加
一定浓度的病毒唑是有利于卷叶贝母鳞片叶诱导产
生小鳞茎的。
　　另外国内外学者已在农杆菌介导单子叶植物遗
传转化上取得了一定的突破 ,如用发根农杆菌转化
露水草细胞〔7〕取得成功 ,在百合科中洋葱细胞的转
化〔8〕也取得了成功 ,这说明只要能筛选出合适的基
因型和感受态细胞 〔9〕 ,进行单子叶植物的遗传转化
也是可行的。
参 考 文 献
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·856· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 6期 2010年 6月