全 文 :第14卷第2期
2014年6月
浙江树人大学学报
JOURNAL OF ZHEJIANG SHUREN UNIVERSITY
Vol.14,No.2
Jun.2014
收稿日期:2014-01-09
作者简介:方林娜,女,浙江海盐人,浙江树人大学生物与环境工程学院环境工程专业2010级本科生.指导教师:徐冬梅.
全氟辛烷磺酰基化合物对斜生栅藻的毒性作用
方林娜1,陈 波2,盛 琼1,周惠莉1,董友娣1,徐冬梅1
(1.浙江树人大学 生物与环境工程学院,浙江 杭州310015;2.杭州市余杭区环保局,浙江 杭州311100)
摘 要:PFOS是全氟化合物的代表性物质,也是其前驱体和衍生物类产品在环境中最稳定的转化产
物.PFOS的亨利常数很低,具有难挥发性,水体是环境中PFOS的主要汇聚地,对水生生物PFOS生态
毒性进行研究具有重要意义.该文以处于对数生长期的斜生栅藻为受试生物,考察PFOS对水生生态系
统的初级生产者的毒性作用.结果表明:PFOS暴露96h后,叶绿素浓度的变化与藻细胞的生长趋势基
本一致,PFOS对斜生栅藻96h-EC50为104.80mg/L;在整个试验浓度范围内,PFOS对藻细胞通透性
的影响并不显著;CAT活性和 MDA含量的变化表明PFOS暴露可能影响藻细胞的抗氧化防御系统,导
致细胞造成氧化损伤.
关键词:全氟辛烷磺酰基化合物;斜生栅藻;毒性作用
中图分类号:X171.5 文献标识码:A 文章编号:1671-2714(2014)02-0030-05
0 引 言
全氟辛烷磺酰基化合物(Perfluorooctanoic sulfonate,PFOS)是全氟化合物的代表性物质,也是其
前驱体和衍生物类产品在环境中最稳定的转化产物.PFOS的大量使用使其进入全球范围内的各种环
境介质,水体、大气、土壤甚至人体中都能检测到PFOS的存在.[1-3]相关研究证实,PFOS具有生物积累
性和多种毒性,如肝脏毒性、神经毒性、生长发育毒性、免疫毒性及潜在的致癌作用.[4-6]PFOS具备
POPS的共同特性,被认为是21世纪新型持久性有机污染物.相对于其他典型POPS,PFOS毒性和作
用机制研究还相当有限.
PFOS的亨利常数很低,具有难挥发性,水体是环境中PFOS的主要汇聚地.因此,对水生生物进行
PFOS生态毒性具有重要意义.绿藻是水体中的初级生产者,其对毒物敏感、易获得、个体小、繁殖快,在
较短时间内可得到化学物质对藻类许多世代及种群水平的影响评价,在生物技术和毒理研究中有广泛
的应用.[7]外源污染物对绿藻的作用将影响水生食物链的能量传递,进而影响高营养级生物和整个水生
生态系统.但是,当前PFOS对绿藻的研究多见于其对于绿藻的种群水平影响,而PFOS对绿藻毒性机
制的研究还有待于深入探讨.本文以斜生栅藻为目标生物,考察PFOS对其急性毒性、叶绿素含量、细胞
膜通透性及抗氧化防御反应的影响,据此探讨PFOS对斜生栅藻毒性作用的潜在机制,为全面评价
PFOS的生态毒性提供依据.
1 材料与方法
1.1 实验材料
斜生栅藻,购自中国科学院水生生物研究所.PFOS(纯度>98%),日本东京化成工业株式会社;荧
光素二乙酸酯(FDA,纯度>97%),美国Alfa公司;其余试剂均为分析纯,水为二次亚沸蒸馏水.
1.2 藻细胞预培养
无菌条件下将藻种接种至水生4号培养液,于PRX-350B型智能人工气候箱中恒温光照培养至对
数生长期,并进一步扩大培养.培养条件:25℃,光暗比12h∶12h,光照3 000~4 000lx,静置培养,每
天定时摇动5~6次以减少藻细胞贴壁现象.预培养3代,镜检细胞正常,进入对数生长期进行试验.
1.3 藻类毒性试验及相关指标测定
将处于对数生长期的斜生栅藻接种至100mL锥形瓶中,实验初始藻细胞密度约7.0×105 个/mL,
总体积50mL,PFOS浓度设置为0,20,40,80,120,160mg/L;分别于24,48,72,96h测定藻细胞
680nm处光密度值,求得EC50值;于96h测定叶绿素浓度、藻细胞膜通透性,每个浓度均设3个平行;
同时考察20,40,80,120mg/L PFOS暴露96h对藻细胞过氧化氢酶活性及丙二醛含量的影响,每浓度
设置1个平行.
PFOS暴露结束后,丙酮提取法测定叶绿素含量;[8]参照Cai等的方法,用测得的由FDA水解生成
荧光素的荧光强度与对照水藻荧光强度的比值,考察 PFOS对藻细胞通透性的影响;[9]取4 ℃
6 000rpm下离心10min后的藻细胞,经细胞破碎提取后参照Bergmeyer等的方法测定过氧化氢酶
(CAT)活性;[10]可溶性蛋白含量用Bradford法[11]测定.
1.4 统计分析
用Origin 8.0进行实验数据处理,进行统计分析并和绘制图形.数据结果采用 means±SD的形式
表示,处理组和对照组之间的差异性进行t检验.
图1 PFOS对斜生栅藻96h急性毒性
剂量效应的拟合曲线
2 结果分析与讨论
2.1 PFOS对斜生栅藻的急性毒性及EC50
图1为利用 Origin 8.0软件中非线性最小二乘拟合
(NLSF)模块下的非线性函数模型DseResp对斜生栅藻96
h生长抑制作用的剂量效应拟合曲线.应用该函数拟合计算
出PFOS对斜生栅藻的EC50-96h值及相关参数(见表1).由
表1数据可见,PFOS对斜生栅藻的96h-EC20、EC50、EC80
分别为89.24、104.80和123.08mg/L.
表1 DseResp模型参数和预测的EC50值
拟合模型参数
A1 A2 logx0 p Span
R
EC20-96h
(mg/L)
EC50-96h
(mg/L)
EC80-96h
(mg/L)
-0.78 79.93 2.02 8.62 80.71 0.999 89.24 104.80 123.08
注:A2,A1 分别为拟合曲线的上、下渐近线;logx0 为拟合曲线中点(平均校正死亡率=50%处)的纵坐标;p为拟合
曲线中点(平均校正死亡率=50%处)的斜率;Span=abs(A1-A2).
2.2 PFOS对斜生栅藻叶绿素浓度的影响
绿藻的光合作用色素主要是叶绿素a、叶绿素b、叶黄素和胡萝卜素.其中叶绿素a大约占有机物干
13第2期 方林娜,陈 波,等:全氟辛烷磺酰基化合物对斜生栅藻的毒性作用
表2 PFOS作用下斜生栅藻叶绿素a和叶绿素b浓度变化
PFOS浓度
/(mg/L)
叶绿素a
/(mg/L)
叶绿素b
/(mg/L)
0 5.16±0.02 1.54±0.02
20 5.01±0.01** 1.53±0.03
40 5.64±0.03** 1.68±0.03*
80 4.34±0.09** 1.37±0.03*
120 1.28±0.03** 0.39±0.08**
160 0.19±0.05** 0.05±0.01**
注:PFOS暴露组与对照组的显著性差异*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001.
重的1%~2%,是评价环境污染物对藻类
光合作用呼吸速率影响的理想指标;而叶
绿素b的含量则可以作为测定藻类光合作
用和呼吸速率的一个补充.PFOS暴露
96h后斜生栅藻的叶绿素含量如表2所
示.由表可见,除40mg/L PFOS暴露组
外,总体上随着PFOS暴露浓度的增大,藻
细胞叶绿素浓度呈降低的趋势.其中20,
80,120,160mg/L PFOS暴露斜生栅藻叶
绿素a浓度极显著低于对照;而80,120和
160mg/L PFOS作用下藻细胞叶绿素b分别显著和极显著低于对照.
2.3 PFOS对藻细胞膜通透性的影响
图2 PFOS对斜生栅藻细胞膜通透性的影响
细胞膜的通透性即细胞膜运输物质的能力,包括主动运
输和被动运输.表征细胞通透性的底物FDA易于被细胞吸
附,进而被体内的脂酶代谢生成具有荧光活性的荧光素.[12]
研究发现FDA转化为荧光素的速率与藻类光合作用的强度
是一致的,单位时间测定的荧光强度越大,表明藻类细胞的
代谢活性越高,细胞膜的通透性能越强,体外物质通过被动
运输进入细胞内的就越多.由图2PFOS对斜生栅藻细胞透
性的影响可见,PFOS对藻细胞通透性的影响表现为先升高
后降低的趋势,但t检验结果表明,在整个试验浓度范围内,
PFOS对藻细胞通透性的影响并不显著.
2.4 PFOS对斜生栅藻抗氧化防御反应的影响
图3 PFOS对斜生栅藻CAT活性的影响
图3和图4分别为PFOS暴露96h对藻细胞过氧化氢
酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量的影响.过氧化氢是一
种代谢过程中产生的废物,它能够对机体造成损害.为了避
免这种损害,过氧化氢必须被快速地转化为其他无害或毒性
较小的物质.而过氧化氢酶就是常常被细胞用来催化过氧化
氢分解的工具.[13]MDA是氧化损伤最终形成的脂质过氧化
产物,其含量可间接提示机体自由基水平.[14]MDA从膜上
产生的位置释放后,可以与蛋白质、核酸等生物大分子发生
反应,或使之产生交联反应,从而改变生物大分子的构型,甚
图4 PFOS对斜生栅藻 MDA含量的影响
至使其丧失功能.由图3可见,PFOS暴露斜生栅藻CAT呈现
先激活再抑制的变化趋势.其中20mg/L PFOS对CAT的激
活作用最为明显,至最大暴露浓度120mg/L,CAT活性低
于对照.而由图4PFOS对 MDA的影响结果可见,除最大
120mg/L暴露组以外,PFOS作用使藻细胞 MDA含量显
著升高.表明PFOS暴露可能影响藻细胞的抗氧化防御系
统,导致细胞造成氧化损伤.[15]
2.5 讨 论
单细胞藻类对有毒化学品的反应表现为生理、生化、形
态、亚显微结构和细胞遗传以及藻类生长繁殖等各个方面.而具有选择性通透性的细胞膜是细胞自我保
23 浙江树人大学学报 2014年
护的第一道屏障,有毒污染物特别是表面活性物质对细胞膜通透性的影响会介导这类物质的很多其他
毒.PFOS由于具有疏水疏油的高表面活性,其对于绿藻的毒性作用可能主要源于对细胞膜功能的干
扰,[16]即PFOS可能通过引起膜蛋白和膜脂质的变化而改变细胞膜的通透性.本文PFOS暴露96h,斜
生栅藻叶绿素浓度的变化与藻细胞的生长趋势基本一致.就单细胞藻类而言,它的生长和繁殖都体现在
细胞分裂上.藻细胞分裂增殖的前提是积累有机物,细胞密度增加,其所含有的有机物也必然增加,而有
机物的增加又是通过光合作用合成的.叶绿素a作为光合作用光反应的主要承担者,其含量在很大程度
上能表现藻的繁殖和生长情况;而叶绿素b作为绿藻光合作用的主要辅助色素,其浓度变化亦与藻细胞
密度有较好的相关性.Liu等研究表明手性农药异丙甲草胺及其S型对映体暴露的蛋白核小球藻叶绿
素含量随农药浓度的升高而显著降低;同时通过TEM观察到农药会抑制藻细胞分裂、造成叶绿体片层
结构的破坏和淀粉粒的积累.[17]光合作用与细胞分裂过程都是藻类生长的重要环节,对于光合作用的
干扰和破坏必将导致藻类生长受阻.
较低剂量长时间暴露下,PFOS的胁迫作用使得藻细胞CAT活性出现“低促高抑”的变化趋势,而
除最大暴露浓度120mg/kg处理组外,MDA含量总体上随PFOS浓度的增大而增大.这可能是PFOS
致藻细胞产生如过氧化离子或超氧化离子等活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)的结果.为
了防止ROS损伤机体,藻细胞CAT等能够在一定程度上被诱导激活,这可能是藻细胞用以增强自身
对活性氧的清除能力,以防止PFOS破坏作用的一种自我保护机制.而在较高浓度PFOS的逆境胁迫
下,CAT活性又会急剧下降,这种现象可以用传统的胁迫效应解释.PFOS对藻体造成的外界胁迫效应
太大,藻体自身抗氧化系统再无能力清除细胞衰老过程中产生的过量活性氧自由基,即可能引起膜脂质
过氧化及细胞膜伤害.有研究表明PFOS能增加罗非鱼原代培养细胞SOD和CAT的活性,导致氧化损
伤,如脂质过氧化和DNA损伤,从而诱导肿瘤发生.[18]
3 结 论
(1)PFOS暴露下斜生栅藻96h-EC20、EC50、EC80分别为89.24、104.80和123.08mg/L;斜生栅藻
叶绿素浓度的变化与藻细胞的生长趋势基本一致.
(2)在整个试验浓度范围内,PFOS对藻细胞通透性的影响并不显著.
(3)PFOS暴露斜生栅藻CAT呈现先激活再抑制的变化趋势;PFOS作用总体上使藻细胞MDA含
量显著升高.表明PFOS暴露可能影响藻细胞的抗氧化防御系统,导致细胞造成氧化损伤.
参考文献:
[1] Noorlander C,van Leeuwen S,Biesebeek J,et al.Levels of Perfluorinated Compounds in Food and Dietary Intake of PFOS and
PFOA in the Netherlands[J].J Agric Food Chem,2011(59):7496-7505.
[2] Kannan K,Tao L,Sinclair E,et al.Perfluorinated Compounds in Aquatic Organisms at Various Trophic Levels in a Great Lakes
Food Chain[J].Arch Environ Contam Toxicol,2005(48):559-566.
[3] So M,Miyake Y,Yeung W,et al.Perfluorinated Compounds in the Pearl River and Yangtze River of China[J].Chemosphere,
2007,68(11):2085-2095.
[4] Lau C,Anitole K,Hodes C,et al.Perfluoroalkyl Acids:a Review of Monitoring and Toxicological Findings[J].Toxicol Sci,2007
(99):366-394.
[5] Andersen M,Butenhoff J,Chang S,et al.Perfluoroalkyl Acids and Related Chemistries-toxicokinetics and Modes of Action[J].
Toxicol Sci,2008(102):3-14.
[6] Kennedy J,Butenhoff J,Olsen G,et al.The Toxicology of Perfluorooctanoate[J].Crit RevToxicol,2004(34):351-384.
[7] Lin KC,Lee YL,Chen CY.Metal Toxicity to Chlorela Pyrenoidosa Assessed by a Short-term Continuous Test[J].J Hazard Ma-
ter,2007(142):236-241.
[8] 周永欣,章宗涉.水生生物毒性试验方法[M].北京:农业出版社,1989.
[9] Cai Xiyun,Liu Weiping,Sheng Guangyao.Enantioselective Degradation and Ecotoxicity of the Chiral Herbicide Diclofop in Three
33第2期 方林娜,陈 波,等:全氟辛烷磺酰基化合物对斜生栅藻的毒性作用
Freshwater Alga Cultures[J].J Agric Food Chem,2008(56):2139-2146.
[10] Bergmeyer H U,Grassl M.Methods of Enzymatic Analysis,Enzymes 1:Oxidoreductases,Transferases[M].third Ed,Wein-
heim,Germany,1983:273-287.
[11] Bradford M M.A Rapid and Sensitive Method for the Quantification of Microgram Quantities of Protein Using the Principle of
Protein-dye Binding[J].Analytical Biochemistry,1976,72(1-2):248-254.
[12] Regel R H,Ferris J M,Ganf G G,et al.Algal Esterase Activity as a Biomeasure of Environmental Degradation in a Freshwater
Creek[J].Aquatic Toxicology,2002(59),209-223.
[13] Choo K,Snoeijs P,Pedersén M.Oxidative Stress Tolerance in the Filamentous Green Algae Cladophora glomerata and Entero-
morpha ahlneriana[J].Journal of Experimental Marine Biology and Ecology,2004,298(1):111-123.
[14] Box A,Sureda A,Terrados J,et al.Antioxidant Response and Caulerpenyne Production of the Alien Caulerpa taxifolia(Vahl)
epiphytized by the Invasive Algae Lophocladia lalemandi(Montagne)[J].Journal of Experimental Marine Biology and Ecology,
2008(364):24-28.
[15] 段炼,杜耀,陆秋琳,等.离子液体1-丁基-3-甲基咪唑氯盐对斜生栅藻的毒性效应[J].中国环境科学,2012,31(5):886-891.
[16] Harada K,Xu F,Ono K,et al.Effects of PFOS and PFOA on L-type Ca2+ Currents in Guinea-pigventricular Myocytes[J].Bio-
chemical and Biophysical Research Communications,2005,329(2):487-494.
[17] Liu Huijun,Xiong Mingyu.Comparative Toxicity of Racemic Metolachlor and S-metolachlor to Chlorela pyrenoidosa[J].Aquatic
Toxicology,2009(93):100-106.
[18] Liu C,Yu K,Shi X,et al.Induction of Oxidative Stress and Apoptosisby PFOS and PFOA in Primary Cultured Hepatocytes of
Freshwater Tilapia(Oreochromis niloticus)[J].Aquatic Toxicology,2007,82(2):135-143.
Toxic Effect of Perfluorooctane Sulfonate on Scenedesmus obliquus
FANG Linna1,CHEN Bo2,SHENG Qiong1,
ZHOU Huili 1,DONG Youdi 1,XU Dongmei 1
(1.Biology and Environmental Engineering School of Zhejiang Shuren University,Hangzhou,Zhejiang,310015,China;
2.Environmental Protection Bureau of Yuhang District,Hangzhou,Zhejiang,311100,China)
Abstract:Perfluorooctanoic sulfonate(PFOS)is a typical perfluorinated compounds and is the most stable transformation
products of their precursor and derivative products in the environment.PFOSs Henrys constant is very low and it is ex-
tremely difficult to volatilize into the atmosphere.Water is the main convergence of PFOS in the environment.Therefore
the study on the ecotoxicity of PFOS on aquatic organisms is very important.Using Scenedesmus obliquus at the logarith-
mic growth stage as the test organisms,the toxic effects of PFOS on primary producers in freshwater aquatic ecosystems
green algae is studied.After 96hof PFOA exposure,the chlorophyl concentration mirrors the trends of algal growth.
The 96h-EC50values of PFOS for Scenedesmus obliquus is 104.80mg/L.At al tested concentrations,the effects of
PFOS on algal cel permeability are not significant.The changes of CAT activity and MDA content show that long term
exposure to PFOS may induce excessive generation of reactive oxygen species in algalcels,causing oxidative damage to
cels.
Key words:PFOS;Scenedesmus obliquus;Toxic effect
(责任编辑 陈维君)
43 浙江树人大学学报 2014年