全 文 ：朋 O 植物生理学报 29夕0 , 16 ( 4 ) : 350一 3 56
A ct a P勿才吵匆 J勿log ica S in ica
露花叶片 PE P 按化酶的纯化及某些分子特性
王岳浩 陈景治 施教耐
(中国科学院上海植物生理研究所 , 上海 20 0 32 )
提 要
经 硫 酸 铁 分部 沉 淀 , D E A E 一 纤 维 素
( D B 52 )
,
D E A E 一 S e p h a d e x A一 5 0 , S e p h a e r y l
s
一
20 0 和二次羚基磷灰石等柱层析 , 从 露 花叶
片中分离得到纯化 63 . 9 倍 、 电泳均一的磷 酸烯
醇式丙酮酸叛化酶 。 此酶的天然分子量经聚丙烯
酞胺梯度凝胶电泳测定为 26 0 k D ,经 s e P h a d e x
G 一 2 0 0 凝胶过滤法测定 为 24 0 k D . 用 S D S一聚
丙烯酞胺梯度凝胶电泳测得酶的亚基 分 子 量为
生朽 k D , 表明此酶是个二同聚体 。 此酶 的等 电
点为 P l “ 5 . 6 。 免疫双扩散的结果表明此酶与高
粱 P E P c 的抗原决定簇呈部分同一性。
关锐周 : 露花叶片 , 兼性 C A M , 磷酸烯醇式丙
酮酸竣化酶 , 纯化
露花是一种兼性 C A M 植物 , 它在 正
常水分条件下表现 C 。 光合特性 , 在 干 早
等水分胁迫条件下 表 现 C A M 光 合特 性
(张维经等 1 9 5 7 ) 。
P E P C 〔E C 4 . 1 . 1 . 31 〕是 C A M 途径
的关键酶之一 (O s m o n d 1 9 7 8 ) 。 目前 兼
性 C A M 植物的碳同化途径转变现象引 起
了不少研究者的关注 , 其中大部分是通过
分析 P E P C 活性及蛋白量的变化 来研 究
水分胁迫对兼性 CA M 植物碳 代 谢 的 影
响 , 有的用 P E P C 作靶酶来研究环 境 因
子对其基因表达的调节 。在这种情况下 ,对
兼性 C A M 植物叶片 P E P C 的纯化及其分
子特性的研究显得十分重要 。
我们曾在露花 叶 片 中 分 离 到 三 个
r E P C 同工酶 , 其中在干早后活性占主导
性的同工酶是 P C I (陈景治等 19 89 ) 。这
里我们纯化的 P E P C 即 是 P C I (本文 称
露 花 叶 片 P E P C ) , P C I 及 P C I 已 在
D E A牙 纤维素柱层析后去除 。
材 料 与 方 法
试材为人工气候室中栽培的经二周干早的成
熟露花 (材“ 心朋石口 a n ht e m u o co r d如 li u m )叶片 .
化学试荆 D E A E一 纤维素 (D E一 52 ) , W h a t m a n
进口分装 ; D E A E 一 s e p h a d e x A 一 50 , s e p il a d e x
G 一 2 0 0 及 S e p h a e r y l S一 201) 和 S一 3 0 0 为 P h a r -
m a ic a 产品 ; 高分子量标准蛋白及凝胶过滤标准
蛋白为 P h a r m a e i a 产品 ; S D S 标准蛋白除 少
G a l a e t o s i d a s e 为 s i g m a 产品外 , 其余为东风厂
产品 ; A m Ph ol in e为 L K B产品 ;试剂均为A R级 。
P E P C活力洲定 P E P C 活性测定用苹果酸脱氢
酶作偶联酶的分光光度法 (施教耐等 197 9 ) 。 测
定系统为 : 50 m m o l / L T r i s一 H C I , p H 8 . 0 ,
4 m m
o
l / L P E P
,
10 m m
o
l / L M g C I
: ,
10 m m o l / L
N a H C O
。 , 0
.
1 m g N A D H
, 过量的猪心苹果酸
脱氢酶 , 适量的 P E P C 样品 , 总体 积 1 m l。 反
应由 P E P C 启动 , 检测 34 0 n m O D 值变化 。
测定温度巧。 O 。
蛋白质浏定 按紫外吸收法和 B r a d f o r d ( 29 7 6 )
的方法 。
P EP c 的纯化
酶的粗提 : 30 9 洗净的露花叶片 , 加 2 . 5 倍
体积的冷冻提取缓冲液 (缓冲液 A ) : 10 m m ol / L
T
r
i
s 一
H C I
,
p H 7
.
4
; 1 m m o l / L E D T A
一N a : ;
15 m m
o l / L 琉基 乙醇 ; 10 m m o l / L M g C I: ;
1% (w /
v
) p V P (
s o
lu b l
e
)
,
1 0% (
v
/
v
) 甘
油 ; 0 . 2 m m o l / L P E P ; 0 . 5 m m o l / L P M S F 。
在组织捣碎机捣碎中三次 , 每次 10 5 , 其中间陇
1 98 9年 1 2 月 2 9 日收到 。
缩写 r E P : 磷酸烯醇式丙酮 酸 , P E r C : 磷酸烯醇
式丙酮酸致化酶 , P M S F : 苯甲基磺氟 。
4 期 露花叶片 P P E敖化酶的纯化及某些分子特性 3 81
10 :
, 以防发热 。经四层纱布过滤的滤液于 4 吧 、
4 5 0 0
r
/ m i n 离心 3 0 m i n , 上清液即为粗酶提 取
液 。
硫酸按分部 沉淀 : 粗酶提取液经硫酸钱分部 沉
淀 ,离心收集 35 % ~ 5 % 硫酸铰饱和度间 的沉淀
物 , 复溶于少量缓冲液 A 中 , 再对缓冲 液 B ( 20
m m o l / L T
r i s 一H C I
,
p H 7
.
4 , 1 m m o l /L
E D T A 一N a : , 7 m m ol / L 琉基乙醇 ; 10 %甘油 )
透析除去 (N H ` ) : 5 0 。 。露花叶片 p E P C在 3 5% 一
5 5% ( N H
,
)
:
5 0 : 饱和度间 9 9% 被沉淀下来 , 这
与高梁的 P E P C 有所差别 (查静娟等 1 9 8 3 ) 。
D E A E 一 纤维 素柱层析 : 透析完全的酶液 经 高
速离心 ( 15 X() o r / m i n , 10 m i n ) 除去变性
蛋白后 , 上样到 已用缓冲液 B 平衡的 D E A E 一 纤
维 素柱 ( 1 . 8 c m x 40 c m ) 上 。 上 样 后先 用
100 m l 缓冲液 B洗脱 , 然后 用 20一 3 00 m m o l /
L T r i s 一H C I ( p H 7
.
4 )线性梯 度洗脱 (含0 . 2
m m o l / L P E P )
, 流速 4 0 m l h 一 1 , 收集 最高活
性附近的部分管子 , 去除 P C I 及 P C I 。
D E A E 一 S e P h a d e x A 一 50 柱层析 : 经 D E A E -
纤维素柱层析收集到的 P E P C 酶液用 20 % P E G
沉淀 , 经高速离心 ( 15 00 0 r / m i n , 20 m i n )
后 ,复溶于少量缓冲液 B (含 0 . 2 m m ol / L P E )P
中 , 然后上样到已用缓冲 液 B平 衡 的 D E A E -
S
二 Ph a d e x A 一 50柱 ( 1 . 8 e m x 2 5 e m )上 ,上样后
先用 10 0 m l缓冲液 B 洗脱 , 然后用缓冲 液 B 配
成的 0一 0 . 6 m ol /L K CI 线性梯度洗脱 (含 0 . 2
m m
o l / L P E P )
, 流速 30 m l h性。
s
e p h a e r y l s
一 2 00 柱层析 : 经 D E A E 一 s e p h a -
d
e x A 一 5 0 柱层析收集到的 P E P C 酶液用 20 %
P E G 沉淀 , 经高速离心将沉淀复溶于 5 m l 缓
冲液 C ( 2 0 m m o l / L T r i s 一H C I, P H 7 . 4 , 1
m m
o
l / L E D T A
一N a : , 7 m m o i / L 琉基乙醇 )中 ,
然后上样到预先用缓冲 液 C 平 衡 的 S e p h ac yr l
S
一 2 0 0 柱 ( 2 . 0 e m x 8 0 e m )上凝胶过滤 (平衡
后期及洗脱时缓冲液 C 中 均 含 0 . 2 m m ol / L
P E P )
, 每 6 m i 。 收集 2 . 5 rn l一管 。
第一次经基磷灰 石 柱 层 析 : 将 经 S eP h ac yr l
S 一 2 0 0 凝胶过滤收集到的 P E P C 酶液直接 上样
到预先用缓冲液 D ( 10 m m ol / L 磷酸钾缓冲 液 ,
P H 7
.
5 ; 1 m m o l / L E D T A
一N a : ; 0
.
5 m m o l / L
D T T ; 10 %甘油 )平衡的经基磷灰石柱 ( 1 . 6 c m
x 20
c m )上 ,然后用 2 5 m m o l / L , 5 0 m m o l / L ,
r 0 0 m m o l / L
,
2 00 m m
o ] / L
,
3 00 m m o l / L 磷
酸钾缓冲液分段洗脱 ,每个浓度 10 m l , 其中后
两个浓度的缓冲液 中 含 0 . 2 m m ol / L P E P,
P E P C用 2 0 0 m m o l /L 磷酸钾缓冲液洗下 。
第二次径基磷灰石 柱层析 : 将经第一次经基磷
灰石柱层析收集到的 P E P C酶液 , 对 缓 冲 液 D
充分透析后 , 上样到预先用缓冲液 D平衡的经基
磷灰石柱 ( 1 . 6 e m x 15 e m ) 上 , 先用 一个 柱
床体积的缓冲液 D 预 洗 一 下 , 然后 用 10 ~ 40
m m
o
l / L 磷酸钾缓冲液 (含 0 . 2 m m o l / L P E I , )
线性梯度洗脱 。 每 5 m in 收集2 m l 一管 。
以上 P E P C 的提取及分离纯化过程均在 0~
o4 C 条件下进行 。
S e P h a d e 、 G 一 20 0凝胶过 滤 S e P h a d e x G 一 2 00
柱 ( 1 . 8 e m x l l o e m ) 经 2 0 m m o l /L T r i。 -
H c l
,
p H 8
.
0 (含 7 m m o l / L 琉基乙醇 )充分平衡
后 , 用 2一 5 m g t h y r o g l o b u l i n ( 66 9 k D ) , a P o -
f e r r i t i n (4 43 k D )
, 月一 a m y l a s e ( 2 0 0 k D ) , a le o h o l
d e h y d
r o g e n a s e ( 15 0 k D )
,
A lb u m i n (6 6 k D )
分别标定柱 , 然后分析纯化 的 P E P C 样 品 。 整
个操作过程恒定流速 , 每 10 m in 收集 1 . 75 m l
一管 。
聚丙嫌醉胺梯度凝胶电泳 参照张龙翔 ( 19 8 1 )的
方法 。 采用 4% ~ 20 %线性梯度凝胶 。 电泳时间 :
2 0 m A / 板 , 15 h ( > 2 kV · h ) 。
s D s 一 聚丙烯鱿胺梯度凝胶电泳及分子 t 测定
参照 P o d u s lo 和 R o d b a r d ( 19 50 )的方法 , 采用
5 %一 2 %聚丙烯酸胺线性梯度凝胶 。 电泳时阿 :
2 0 m A / 板 , 15 h , ( > 2 k V 一 h ) 。
电泳 胶 染 色 参照 H e u k e s h o v e n 和 D e r n i e k
( 19 8 5 )的银染法 。
等电聚焦电泳 依照 L K B 电泳仪说明书 , A m -
p h
o li n e p H 范围为 3 . 5一 10 。
抗血清的制备 将电泳均一的露花叶片 P E P C 先
后分四次注射到新西兰大白兔 体 内。 第一 次用
2 m g 纯化的 P E P C 与 F r e u n d ’ s 完全佐剂研匀
后 , 在兔颈背部皮下多点注射 。 隔一周后重复一
次 。 第三次 用 2 m g 纯化 p E p C 与 F r e u n d ’ s
不完全佐剂研匀后在兔颈背部皮下多点注射 。 隔
一周后再用 5 0 群g 纯化 P E P C 经微孔滤膜过滤
后从兔耳静脉注射到体内。 经静脉注射 的 兔 子
g d 后从颈动脉取血 。 血样先在室温 放 置 l h ,
然后置 4o C直至血凝 。 倒出血清 (呈淡黄色 ) 并月
植 物 生 理 学 报 1 6卷
消毒过的安培管充氮分装 , 置 一 2 0 0保存。
双向免咬扩散 依照 L K B 产品说明书 , 采用生
理盐水 ( p H 7 . 5 )配成的 i % a g a r o s e (含0 . 0 2%
N a N a )
。 加样后 , 琼脂板在湿盒中 于 2 5’ C 保温
2 4 h
。 经在生理盐水中浸洗 24 h 后 , 将琼脂板
用滤纸吸干并风干到一片薄膜上 。 经考马斯亮蓝
R 一 2 5 0 染色液染色后 , 用 45 %乙醇一 10 % 醋酸
脱色到背景清晰 。
得到了很好的分离效果。 从第二次经基磷
灰石柱层析结果看 , P E P C 活性峰与蛋白
峰互相重叠 (图 2 ) , 表明是均一的 。
乞汾 乡止且月日甘凡à号ō妇OV巧.10`
(与。.占Oà石引出。
结 果 与 讨 论 叩卜亩~ 亩皿谕一责代矛益
F r a e it o n n 切m卜汀
圈 1 露花叶片 P E P C 在 S e Ph a e r y l S一 20 0柱
上的层析
n g
.
1 C h or m a t o g r a p h y o f P E PC 介 o o .M co 犷i-d
fo l滋“ m l ea v e s on S eP h a e ylr S一 20() co lumn
介.宜l污日它飞à扮军公。咬0理栖I10J|七
.J60八U找ù月O通工,山八Uù“ùn甘
(息05份QOà石名。占
P E P C 的纯化
露花叶片 P E P O分子量较小 , 且干早
后叶片内易使 P E P C失活的多酚类化合物
增多 , 所以我们对查静娟等的 纯 化方 法
( 1 9 8 3) 作了几点改进 :
1) 在粗酶提取缓冲液中除加 l % so l-u
b l e P V P 外还加了 0 . 2 m m o l / L P E P 。 柱
层析的洗脱缓冲液和酶液中始终含有 0 . 2
二m ol / L P E P 。 P E P 的存在 增 加 P E OP
的抗变性能力 , 提高稳定性 。
2) 鉴于 aN CI 对 P E P C 活性的抑制 作
用 ( S t i b o r o v a 和 eL b l o犯 1 9 5 7 ) , 尽量 用
K C I等钾盐代替钠盐 ,
3) 采用 2 0% P E ,沉淀的方法部分代
替酶液的透析及浓缩过程 , 相对缩短了操
作时间 , 并避免了透析过程中 P E P C 的变
性失活 。
4) 根据对露花叶片 r E P C 分 子 量 的
初步了解 , 选用了趾 p ha cr y 1 8一 2 0 凝胶
过滤柱 , 而不 用 一 般 常用 的 s eP ha de x
G 一 2 0 0 或 S e Ph a o r y l S一 3 0 0 。 我们先后试
用过这几种层析柱 , 发现都能有效地分离
r E P C
, 只是 S e Ph a e r y l S一 2 0 0 的分子 量
分离范围比较窄 , 对露 花 叶 片 P E P C 的
分离效果 (图 l )要比 s e Pha er 尹 S 一3 0 和
S eP ha de
x G 一20 0 好得多 。 其次 , 我们 连
续二次使用经基磷灰石柱层析 , 并采用不
同的洗脱方法 (分段洗脱和线性梯度洗脱 )
1 0 20 30 40 50
F r a e Uon n 切山 be r
外|“讯1n臼峨
圈 2 露花叶片 P E P C 在第二次经基磷灰 石 柱
上的层析
n g
.
2 C h r o m a tog
r
aP h y
o f P E P C fr
o m M
.
c
-o
己洒 liu m Ie a v se o n h州 r o x y laP at i t e e o l u m n
采用上述改进后的纯化方法露花叶片
P E P C 被纯化了 63 . 9 倍 (表 l ) , 达 到 电
泳均一 (图 3 ) , 最终得率在 30 % 以上 。
P E P C 的分子特性
分子量 经聚丙烯酞胺梯度凝胶电泳 , 露
花叶片 P E P C 的天然分子量测 定 为 2 6 0
k D (图 4 ) , 经 S e p ha de x 份 2 0 0 凝 胶 过
滤法测定为 2 40 k D (图 5 ) , 其亚基分子
量经 8 D 8一 聚丙烯酞胺梯度凝胶电泳测定
为 1 15 k D (图 3 ) , 这表明此酶是个二同
聚体。
4期
裹 1
T a b l
e
露花叶片 PE P 数化酶的纯化及某些分子特性
露花叶片磷酸烯醇式丙酮酸数化酶的纯化步骤
1 P u ri i f ea tio no P fE P C fr
o mM
.
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10
.
8
l牛. 6
2 3
.
9
6 3
.
9
许多专性 C A M 植物的 P E P C 亚基 分
子量 比 C 。植物的大 。 N i m m 。 等 ( 19 8 6) 从
刀卿即句夕luI m fe dts ch en ko i 中纯 化 的 P E P C
_亚基分子量均大于 1 0 k D , 与露花 叶 片
r E P C 的 n s k D 接近 。 C。 植 物 的 光 合
P E P C 亚基分子量一般小于 或 等 于 1 0
k D
, 高粱光合 P E P C 亚基分子 量 为 93
k D (查静娟等 1 9 5 3 ) , 玉米 的为 1 0 0 k D
( S t ib o r o va 等 1 0 5 6 ) , 马齿览的为 5 3 k D
(吴敏贤等 1 98 8) 。 C : 型 P E P C 亚 基 分
子量大小不等 , 菠菜的 P E P C 亚基分子量
大于 1 0 0 k D (M i z i o r ko 等 1 97 4 ) , 而玉
米 C : 型 P E P C 的亚基分子量 只有 89 k D
( S t ib or o v a 等 1 9 5 6 ) 。 一 般 从 C : 和 C -
植物中纯化的 P E P C 均呈四 聚 体 , 但 在
C A M 植物中二聚体的 P E P C 时 有 发 现 。
P E P C s u b u n i t
弘 r b o n le a l l h y d r
T M V e o a t P r o t e一伪
8欢U4c了é4月,礴.
琴芝ó。留州
0 0
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.
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.
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R e l a t一v e m o b 一1 1 t y
图 3
F i g
·
L e ft :
P E P C 亚基分子量的测定
3 D e t e r m ina t i
o n o f mo l
e e u la r w e i hg t of P E P C
s u bun i t
5% 、 2 2% gr ad i e nt SD S 一P A G E . L a n e l , 2 ,
卫E p C . 5杯9 a n d 2 0 陀 of Pur iif e d P E p C P r o et in s w er
S D S mo l
e
cu lar we i hg
t m a r k o sr
.
L a n e 3
,
4,
叩 P I湘 加 lan e 3 a n d la n e 4 , r ea p e e t ive ly ·
3 8 4植 物 生 理 学 报 6 1卷
,气、,、且gy
( le h 、 ( lr L江只叱、 : 1二一, t
一云又】!川 rl l一110 1 _」 、 )一日 4 聚丙烯酞胺梯度凝胶电泳法测定露花叶片 P E P c 的天然分子量列乡 咬 D e etr m in a t i o n o f n a t i v e m o l e e u l a r w e i g h t o f p E p C for m M ` o rd沪, l i u m b y 啥% 、 2 0%乎 a d i e n t PA G EL a n e l , P E P C ; L a n e Z , m o le e u 执 r w e i g h t m a : k e sr .
刀一 Am y l a s e
P E P C 天然分子量是否存在昼夜差别还有
待探讨 。
等电点 我们用制备性等 电聚焦 电泳测得
露花叶片 P E P C 的等电点为 P l ~ 5 . 6 (图
6 )
。
ǎ自巴诊荟
0讼d。川卜l|1匕|二150Q句f … , lA!u\n in认 !50 ` 60 70 8 0 驹F r a e t io n n u m b e r图 5 se ph aQ xe G 一 20 0凝胶过滤法测定露花叶片 P E P C 的天然分子量
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e t e r m i n
a t i o n o f n a t i ve mo
le e u la r we ig h t
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F r a e t io n
1 0 16
犷毛t-u工otuà乡ù之引。叫.
n Um b e r
而且 , 吴敏贤等 (W u 和 W e d d i n g 1 9 5 6 )
从 C A M 植物 公` “ u la a gr en t ae T ilu nb 叶
片中提取的 P E P C 天然分子量存 在 昼 夜
差别 , 白天提取的酶呈二聚体 , 分子量为
” 6 k D , 夜间的酶呈四聚体 。 但 N i m m o
等 ( 19 8 6) 未在 B . fe dl s hc en ko i 中观察到
P E P C 天然分子量的昼夜差别 。 露花叶片
图 6 露花叶片 P E P C 的等电点测定
F i g
.
6 D
e t e r m i n a t i o n o f i s o e l e e t r i e P o i n t of P E P C
for m .M co
r成斤l iu m le a ve s
兔疫特性 用纯化的露 花 叶 片 P E P C 作
抗原在新西兰大白兔中制备了 专 一 的 抗
体 , 效价 1/ 6 4 。 露花叶片 P E P C 与高 粱
叶片 P E P C的免疫双扩散表明 , 两者呈 部
分交叉反应 (图 7 ) 。 这表明两者有化学上
的相似性 , 抗原决定簇大部分相同 , 仅有
4 期 露花叶片 PE P数化酶的纯化及某些分子特性 3 85
少数差异 ( Ke e rn1 9 7 8)。 C A M植 物 的
PE rC与 C。 植物的 PE C P有相似的生 理
功能 , 但又有不同的调节特性 (A n de or 等
19 87 )
。 从免疫特性及亚基分子量等 方 面
反映出的结构差异可能正是它们调节特性
差异的物质基础 。
日 7 P E P C 的免疫双扩散
列乡 7 I n u n u n o d i月汕s i on P a t t恤 o f P E P C 仍
r E P C
a n t is
e ar
P E PC f’ ” m .M e o idr fo l玄赵m le~
w as a p p lied ot
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le a f P E P C w as a p p li e d t o
w e ll 2 i n
a ,
b
. 、 Ve l l 3 i n a co n at i en d 10 “ l 五么 c o卜
d夕云八` 脚 lea f P E P C a n t is er um
. 、 Ve l l 3 in b e o n t a i-n
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参 考 文 献
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