全 文 ：植物生理学报 , 19 9 1 , 17 ( 2 ) : 2 07一2 13
A ` at P勺otP 妙痴 log ica S in ,’ca
2 07
干旱过程中露花叶片 P EPCa se 酶蛋白量的变化
王岳浩 陈景治 施教耐
戈中国科学院上海植物生理研究所 , 上海 20 0 0 3 2 )
提 要
干旱和盐胁迫使露花叶片中 P E P C as e 活性
水平提高数倍 。 经双相电 泳 和 蛋 白免疫 印 渍
(w
e s t e r n im m u n o b l o t ) 发现干旱后露花叶片中
P E P C as
e 蛋白量有明显增多。 火箭免疫电泳定
量分析结果表明 , 干旱过程中 , P E P G as e 活性水
平的提高主要基于其酶蛋白量的增加 。 千旱引起
的这些变化是可逆的 , 在恢复供水一定时间后可
以完全恢复 。 R ub is C O 蛋白量在干旱处理的露
花叶片中明显减少 , 恢复供水后又回复到原初水
平 。 p E P C a s e 蛋白量增多 , R u b is C O 蛋白量减
少可能是露花叶片 C A M 途径诱导的生化特征之
一 。 露花叶片中 P E P C as e 活性水平及蛋白量受
到叶片发育状况的控制 , 干旱引起的这两者的变
化在中部成熟叶片中最明显 ,在幼嫩叶片中最小。
关锐词 : 露花 , 兼性 C A M , 干旱 , 磷酸烯醇式
丙酮酸叛化酶
P E P C a s e ( E C 4
.
1
.
1
.
3 1 ) 是 C A M 途
径的关键酶之一 (O s m o dn 1 9 78 ) , 它催化
P E P 梭化形成草酸 乙酸 ,后者进而被转化
成苹果酸在夜间积累 。 C A M 植物按 其 代
谢特点可分为专性 C A M 植物和兼性 C A M
植物两大类 。 一般认为专性 C A M 植物始
终拥有与 C A M 途径有关的代谢机构 , 而
兼性 C A M 植物在正常水分条件下 , 呈 C 3
植物光合特征 , 只在环境因素 (如干早 ,盐
胁迫等 ) 诱导下才呈现 CA M 植物光合特
征 。 露花是一种兼性 C A M 植物 , 干旱是
其 C A M 途径的诱导因素之一 (张维经等
19 87 )
, 本文报道了露花在 C A M 途径诱导
过程中 P E P C韶“ 活性水平 、 蛋白 量 和
只而认e o 蛋白量变化的规律。
材 料 与 方 法
人工气候室中栽培的成熟露花 (人儿 J。 石少 :-
nht e m um co
r d沪八u m ) 植株 , 其栽培及干旱处理
参照陈景治等 ( 19 89) 方法 。 供盐胁迫的材料用
砂基培养。 营养液 组成 : 3 m m o l / L K N o s , 7
m m
o
l / L C
a
( N O
3
)
: ,
1
.
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l / L M g S O
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o l / L (N H
;
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.
2 召 m o l / L Z n S O ` , 0
.
2 5 召m o l / L C u S O `
,
0
.
2 5 召m o l / L H : M o o `
,
1 5 召m o l / L E D T A -
F e扩。 盐处理时逐步提高营养液中 N a OI 浓度 ,最
终浓度为 0 . 5 m ol / L , 此浓度保持至采样。
醉的提取 在光照后期采适量的成年叶片 (特别
指明的除外 ) ,按样品 ( g ) : 提取缓冲液 ( m幻二 :1 2
加入提取缓冲液 〔50 m m o l / L T r i s 一 H c l , p r r
8
.
0
,
10 % ( v/ v ) g l y e
e r o l
,
1 m m
o l / L D T T
,
1 % ( w / v ) p V p (
s o
l u b l e )
,
1% ( v加 ) i s o p r o p a 一
n o l
, 1 m m
o
l / L p M S F 〕 , 在 。~ 4 O C下于研钵
或匀浆器中匀浆 , 经 10 o o o r / m i n 离心 5 m i n 』,
取上清液 。
P E P C a s e 活性测定 测 定 系 统 : 50 m m ol / L
T
r
i
s 一
H C I ( p H 5
.
0 )
,
1 0 m m
o
l / L N a H C O
: ,
10 m m
o
l / L M g C I
: , 0
.
1 m g N A D H
,
4 m m
o
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`
L p E p
, 过量的 M D H , 适量的 P E p C a s e 样品 , ,
总体积 1 m l ,反应由 P E P C a s e 启动 。 检测 O D : ` : .
值变化 。
双向电泳 参照 F er l 等 ( 19 79) 的方法。 第一相采
用 7 %聚丙烯酞胺凝胶 , 第二相采用 10 % S D S一聚
丙烯酞胺凝胶 。 电泳胶染色按 H eu k es h 。化 D 和
D e r n i e k ( 1 95 5 ) 的银染法。
醉标抗体的制备 露花叶片 P E P c as e 抗血清的
制备参照王岳浩等 l( 9 90) 的方法。 抗体用 竹。 -
19 90
一0 6一 1 5收到 , 19 9 0一飞0一 2 0修回 .
缩写 PM S称 笨甲基磺氟 .
乏的 植 物 生 理 学 报 幻卷
tei n A
一
s ep h
r ao s el e
一 4B 亲和层析法从抗血清
中纯化 (参见 Phr a m aci a产品说明书 )。 纯化的
抗体按 Avr a m a es和 T er ny n e k( 19 7 1 )的戊二
醛二步法用辣根过氧化物酶 ( R z >3 .0 )标记 。 酶
标后的抗体在 Sep hc ar y 1 S一30 0 柱上层析 ,检测
O D 。 。 和 O D 40 : (过氧化物酶吸收峰 )值 , 收集酶
标的抗体 , 除去未交联的辣根过氧化物酶 。
蛋白免皮印波法 (W e s et , 七口口四 。 b l o )t 根
据 T o w b i n 等 ( 19 7 9 )和 Y a g a w a 等 ( 19 5 7 )的方
法略作修改 。具体步骤 : 在 4 0 0条件下 ,将双相电泳
胶上的蛋白在 25 m m o l / L T r i s一 H C I (p H 5 . 3 ) ,
2 50 m m
o
l / L g l y
e i n 。 , 20% ( v / v )甲醇溶液中电
泳转移至硝酸纤维素膜上 , 电压 0I 0 v , 时间 Z ho
转移后 ,硝酸纤维素膜浸入含 3% 牛血清白蛋白的
P B s ( 10 m m o l / L 磷酸 缓 冲液 , 0 . 1 5 m o l / L
N a cl
,
p H 7
.
0) 中 ,振荡 l h 后 , 将硝酸纤维素
膜与含上述酶标抗体 ( 1 / 2 00稀释 ) 的 P B S 保温
Z h
, 经常轻摇 。 接着 , 用含 0 . 1% T w e n 20
的 P B S 洗膜 3 次 , 每次 2 0 m笼n 。 再经 P B S 浸
洗 , 膜在辣根过氧化物酶底物混合液〔用 P B S 配
制 , 0 . 5 m g /m l 4一 氯 一 , 蔡酚 (4一 e h l o r o 一 1 -
n a p h t o l, E
.
M
e r e k 产品 ) , 2 0%甲 醇 0 . 0 5%
H ZO : 〕中显色。 除特别指出外 , 以上过程在2 0 0
下进行。
火箭免咬电泳 按 L K B 电泳说明书进行 。 定量
分析样品时 , 同时用纯化的露花叶片 P E P c as e
和烟草 R u ib s C O 作标准曲线 。
蛋白质洲定 按 B r a d f o r d ( 1 976 ) 的方法。
叶绿索浦定 按 A r n o n ( 1夕49 ) 的方法 .
结 果
千旱和盐胁迫条件下露花 叶 片 P E P C 、 se
活性水平的变化
干早和盐胁迫是引起植物水分胁迫的
两大原因 , 也是影响兼性 C A M 植物代谢
转变的重要因素 。 将发育成年的露花干旱
处理 21 天 ,可观察到叶片 P E P C as e 活性水
平有成倍的提高 。 经盐胁迫处理的露花 ,其
叶片 P E P C as e 活性水平的提高也非常明
显 (表 1 ) 。
千旱前后露花叶片蛋 白谱的变化
在 P A G E 一 S D S一 P A G E 双相电泳胶
上 , 我们可发现经 2 周干早处理的露花与
对照的相比 ,其叶片蛋 白谱有不少变化 。 这
种变化在低分子量区和高分子 量 区 都 存
在 , 有 3 种情况 : ( l )明显增加的 蛋 白 ,
( 2 )明显减少的蛋白 ; ( 3 )变化不明显的
蛋 白。 把双相电泳胶中的蛋白电泳转移到
硝酸纤维素膜上 , 经辣根过氧化物酶标记
的 P E p C a s e 专一抗体 W e s t e r bn lo七后 , 发
现干早处理的露花叶片硝酸纤维素 膜 上 ,
P E P c as e 蛋白被明显着色 ,而对照的着色
极微弱 (未示 ) 。 这表明干旱后 露 花 叶 片
P E P aC
s e 蛋白量与对照的相比有明 显 增
加 ( 图 i ) 。
童
表 1 干旱和盐胁迫对露花叶片磷酸烯醇式丙酮酸版化酶活性水平的影响
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2期 千旱过程中露花叶片P EP Ca se 酶蛋白量的变化0 29
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图 1 露花叶片蛋白的双向凝胶电泳
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千旱过程中婚花叶片 P E P C as e 与
R u b i s C O 蛋 白 t 的变化
从图 2 可见 , 干早过程中露 花 叶 片
P E P C as 。 蛋 白量逐渐增加。 P E P C as e 活
性变化与其蛋 白量的变化同步 (图 3) 。 干
旱过程中 R u b is CO 蛋 白量也有变化 , 干早
前期 , R u b is CO 蛋 白量略有增加 , 但此后
则明显下降。
恢复供水后璐花叶片 P E P C a s e 与
R u b i sC O 蛋白 t 的变化
经 21 天干早的露花恢复供水后 , 叶片
P E P C as e 蛋白量有明显下降 。 在解除干旱
的前期 , P E P伪阳 蛋 白量减少相对较少 ,
呈现一个滞缓期 , 此后则直线下降 , 复水
14 天 后 已完 全 恢 复 到 干 早 前 水 平 。
P E P aC se 活性变化与其蛋白量的变 化 趋
于同步 ( 图 5) 。 恢复供水后 R u b is o 蛋
白量的变化分两个阶段 , 在解除干早前期
略有减少 , 后期有明显增加 (图 4) 。
发育对公花叶片 P E P C as e 活性 、蛋白 , 及
R u M s C O 蛋白 t 的影晌
一 般从茎基部到茎顶端依次生长的叶
片代表着不同的发育程度 。 我们分析了正
常水分和干旱处理条件下发育对露花叶片
P E P Cas e 与 R ub i 8 CO 水平 的影响 。 正常
水分条件下 , 近茎顶端发育未成年的叶片
P E P C a se 活性最低 , 中部叶片次之 , 基部
叶片最高。 P E P Cas e 蛋 白量和 R u ib s CO
蛋白量的分布与此相同 ( 图 6 , A ) 。 经两
周干早的露花 ,近茎顶端叶片 P E P C as e 活
性最低 , 基部叶片次之 , 中部叶片最 高 。
P E P C a se 蛋 白量的分布与其活性分 布 相
同 。 R ub is oC 蛋 白量的分布与此 稍有 不
同 , 表现在基部叶片中它的减少 速 度 比
r E P C韶 e 活性与蛋白量的 减 少速度更快
(图 6 , B ) 。
植 物 生 理 学 报2 10 字 1 7卷
图 2
F 遥g ·
火箭免疫电泳分析干旱过程中露花叶片 PE P Cas e 和 Ru i bs CO蛋白量的变化
2 A n a lsy is of t h e c h a n g e s in Pr ot e in 心 s s of E P P Ca s e a n d Ru bis C0 in t h e 1e a ve s of M. c or成户 l iu m
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圈 3 千旱过程中露花叶片
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P E P C a s e 活性与蛋
白量变化的相互关系
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图 5 恢复供水后露花叶片 P E P C as e 活性与蛋
白量变化的相互关系
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图 4 火箭免疫电泳分析恢复供水后 露 花 叶 片 P E P C as e 和 R u ib s C O 蛋白量的变化
叭 9 . 盛 八 n a l ys i s o f th e e h a吧 e s i n p r o t e in am s s o f p E p C a s e a n d R u b i s C o in th e le a v e s o f M ·
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图 6 叶位对露花 P E P C as e 和 R u ib s C O 分布的影响
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讨 论
干早条件下露花叶片 P E P Cas e 活性
水平的提高可能是露花 C A M 途径诱导的
基础 , 因为 P E P C as e 是 C A M 植物夜间
固定 C O : 的关键酶 ( O s m o dn 1 0 7 5 ) 。 从电
泳和蛋白免疫印渍结果可看出 , P E P C as e
活性水平的提高是基于新增加的 P E P C as e
蛋 白 , 而不是由于已存在酶蛋白经修饰加
工后的活化 。 与在 M . c syr at “ in u m 中的研
究结果 ( F o s t e r 等 1 9 5 2 , H o f en r 等 1 0 5 7 )
相似 , 盐胁迫也能引起露花叶片 P E P C as e
活性水平的提高 。 盐胁迫与干早可能通过
相似的途径影响着 P E P饰 se 蛋白量的变
化 , 这方面的工作有待深入研究 。 在前一
阶段的工作中我们发现经干早处理的露花
尽管酶活性水平有数倍的变化 , 但叶片中
占主导地位的 P E P aC se 同工酶仍是正常
水分条件下叶片中主要的 P E P C a se 同工
酶 , 这与光周期对 aK la cn h oe b ot s 伦才成 d n a
C A M途径诱导中 P E P C明 e 同工酶的变化
情况不同 , 后者涉及 P E P aC se 同工酶主
次的激变 (Br u l f e r t 等 1 9 5 2 ) 。 经干早处理
的露花在恢复供水之后 , 其叶片 P E P C二 e
蛋白量减少 , 但在恢复供水的前期可观察
到一个滞缓期 , 这表明 P E P aC se 蛋白量对
复水的反应是一个长 期 反 应 ( fo n g一七e r m
er s P o sen )
, 可能涉及基因表达强度 的 减
弱 。 P E P C a se 活性和蛋 白量在恢复供水两
周后可完全恢复到处理前水平 , 这表明露
花 C AM 途径的诱导是一个可逆过程 。 这
一点是露花与 K . lb 口,价 idI an a 在 C A M 途
径诱导方面的另一重要差别 ( B r u l f e r 七等
1 9 8 2)
。这些差别表明干旱或盐胁迫对露花
C A M 途径的诱导与光周期对 K . b lo s fe l se
id an
a C A M 途径的诱导有着不 同的机理 。
干 早 过 程 中 R ub is CO 蛋 白 量 与
P E P浅 se 蛋白量的变化趋势相反 ,前者的
逐步减少与后者的逐步增加恰成对比 。 这
种变化的结果使干早处理后的露花具有较
高的 P E P C明e 蛋 白量 / R u b is o 蛋白量
比率 , 而这正是 C A M 植物与 C : 植物的
重 要 差 别 之 一 。 干 早 引 起 露花 叶 片
R ub is CO 蛋 白量的减少是植物对环境自动
适应的结果 , 但这 种 变 化 究 竟 是 由于
R ub is CO 基因表达强度减弱还是酶蛋白分
解速度加快的结果还有待于研究 。 恢复供
水之后 , 露 花 叶 片 P E P aC se 蛋 白 量 /
2 12 植 物 生 理 学 报 17卷
R bu si o 蛋白量比率 变 小 , R u ib s CO 蛋
白量有回复到处理前水平的趋势 。 这些资
料表明 , P E P C as e蛋 白量增加和 R u ib so
蛋 白量减少可能是露花叶片 C A M 途径诱
导的生化特征之一 。
发育是控制植物代谢的因素之一 。 对
照与干早露花叶片 P E P Cas e 蛋白量的分
布有着相似之处 , 也有不同之处 。 相似之
处是靠近茎顶部的叶片即未发育成年的叶
片 P E P Cas e蛋白量很低 , 叶片渐趋成年时 ,
P E P Cas e 蛋 白量与 R u b is o 蛋 白量逐步
增加 。 这表明发育是控制 P E P C as e 蛋白
量变化的因素之一 , 干早对 P E P C as e 的诱
导受到发育状况的牵制 , 在干早过程中长
成的嫩叶并不是 P E P Cas e 诱导最强烈的
部位 , 这与 W i l le r t 等 ( 1 0 7 6 )在 M · c尽 s t -
a l i n u m 中观察到的 P E P C a s e 活性变化的
结果相似 。 对照与干早露花叶片 P E P C as 。
蛋白量分布的不同之处是对照中基部叶片
P E P Cas 。 蛋白量积累最多 ,而经干早处理
的植物 P E P C as e 含量最多的部位并不是
基部而是中部 , 但基部叶片中 P E CP aS 。 蛋
白量与 R u b is CO 蛋 白量相比 , 相对含量仍
较高 , 这种差别可能与干早加速了露花叶
片衰老有关 。 关于发育与衰老究竟是怎样
控制 P E P C as e 蛋白量的变化可能在研究
了其基因表达调节机理之后才 能 有 所 理
解 。 对照露花基部叶片 P E P C a s e 蛋 白量
的积累可能使这些叶片表现一 定 程 度 的
C A M 性状 , 这种现象与某些 C A M 植物
中观察到的结果 (而 ne o 1 9 7 5) 相一致 。
参 考 文 献
王岳浩 . 陈景治 、 施教耐 。 露花叶片 P E P 叛化酶的纯
化及某些分子特性 。 植物生理学报 19 9 0 , 1` :
3 8〔夕一3 8 6
陈景洽、 王岳浩 、 施教耐 。 水分胁迫对露花叶 片 中
P E P C as
。 活性及其调节特性的影响 . 植物生理
学报 19 8 9 , 1 5 : 3 4 8一 3 5 3
张维经 、 尉亚辉 、 毛宗渊 . 水分胁迫下露花光 合型
的转变。 植物生理学报 ] 9 5 7 , 1 3 : 2 17一 2 2 1
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