全 文 ：两种抗生素对阿拉巴马花烛植株再生的影响
于 波， 刘金梅， 刘晓荣， 廖飞雄， 朱根发
（广东省农科院环境园艺研究所/广东省园林花卉种质创新综合利用重点实验室，广东 广州 510640）
摘 要：花烛（Anthurium andraeanum Lind）是世界第二大热带盆栽花卉，其转基因育种具有巨大的应用前景。 以
花烛为材料，研究不同浓度卡那霉素和潮霉素对阿拉巴马花烛植株再生的影响，结果表明：卡那霉素和潮霉素均能
促使外植体严重褐变死亡，同时，二者对愈伤组织和芽的诱导具有明显抑制作用；当以叶片或叶柄为转化受体时，选
择压以 100 mg/L 卡那霉素或 20 mg/L 潮霉素为宜；当以愈伤组织为转化受体时，选择压以 150 mg/L 卡那霉素或 40
mg/L潮霉素为宜；两种抗生素对生根亦具有抑制作用，选择压则以 150 mg/L 卡那霉素或 40 mg/L潮霉素为宜。
关键词：花烛； 卡那霉素； 潮霉素； 外植体； 植株再生
中图分类号：S682.39 文献标识码：A 文章编号：1004-874X（2014）07-0053-04
Effect of two kinds of antibiotics on plant regeneration
of Anthurium andraeanum cv. alabama
YU Bo，LIU Jin-mei，LIU Xiao-rong，LIAO Fei-xiong，ZHU Gen-fa
（Environmental Horticulture Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Key Lab
of Ornamental Plant Germplasm Innovation and Utilization，Guangzhou 510640， China）
Abstract：Anthurium andraeanum is the second tropical pot flowers in the world, and its transgenic breeding has been
shown promising application. In this study, susceptibility of A. andraeanum cv. alabama to antibiotics (hygromycin and
kanamyein) was studied． Results showed that kanamycin and hygromycin could cause seriously explant browning and dying,
and had significant inhibitory effect on the callus induction and bud differentiation. When the leaves and petioles were
used as receptors, the optimal selection pressure was 100 mg/L kanamycin or 20 mg/L hygromycin; When the calli were
used as receptors, the optimal selection pressure was 150 mg/L kanamycin or 40 mg/L hygromycin; The two antibiotics also
could inhibit rooting and the optimal selection pressure was 150 mg/L kanamycin or 40 mg/L hygromycin.
Key words：Anthurium andraeanum； kanamycin； hygromycin； explant； plant regeneration
花烛（Anthurium andraeanum Lind）别称红掌、安祖
花， 为天南星科花烛属多年生草本植物， 原产哥伦比
亚，是仅次于热带兰的第二大热带花卉，在国际花卉市
场上十分流行。 很长一段时期内花烛采用传统杂交育
种技术进行新品种选育，自从 Kuehnle 等 [1]证实根癌农
杆菌能够浸染花烛细胞以来， 国际上已经开展许多花
烛转基因的研究 [2-18]。 随着基因工程技术的发展，花烛
转基因成为一种新的花烛育种手段。
目前，在大部分植物遗传转化中，筛选培养基中需
要添加抗生素来筛选转化体，不同植物、不同外植体离
体培养对抗生素的反应存在差异。 在植物转化之前，要
对各种外植体材料进行抗生素的敏感性试验。 卡那霉
素（Kanamycin）抗性基因 nptⅡ和潮霉素（Hygromycin）
抗性基因 hptⅡ作为选择标记基因被广泛用于植物的
遗传转化[19-20]。 本研究在成功建立花烛品种“阿拉巴马”
再生体系的基础上， 进行叶片和叶柄植株再生过程对
卡那霉素和潮霉素的敏感性试验， 分析两种抗生素对
叶片和叶柄褐变、 愈伤组织诱导、 芽分化和生根的影
响，为进一步开展该品种转基因研究提供重要参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验于 2012—2013 年进行，供试材料为花烛盆栽
品种阿拉巴马的植株， 保存在广东省农科院环境园艺
研究所广东省名优花卉种质资源圃的温室中。 前期，我
们已经在该品种上建立了以叶片和叶柄为外植体的植
株再生体系。
1.2 试验方法
收稿日期：2013-11-28
基金项目：广东省农业科学院院长基金（201217）
作者简介：于波（1977-），男，博士，助理研究员，E-mail：yubo
423@163.com
广东农业科学 2014 年第 7期 53
C M Y K
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2014.07.033
小写英文字母不同者表示差异显著，图 2~图 4 同
图 1 两种抗生素对花烛外植体褐变死亡的影响
1.2.1 外植体表面消毒 从健康植株上连同叶柄一起
采下刚展开的新叶进行表面消毒：用 1%的雕牌洗涤液
水溶液浸泡 1 min，自来水清洗；转入无菌的 500 mL 三
角瓶中，在超净工作台上用 70%乙醇浸泡 30 s，乙醇要
没过外植体，无菌水清洗两次；用 0.1%的氯化汞水溶
液浸泡 10 min，然后用无菌水浸泡清洗 2 次，每次浸泡
5 min后再清洗。
1.2.2 愈伤组织诱导 消毒后的叶片放在干燥的无菌
滤纸上，用手术刀或剪刀将叶片切成面积约 1.0 cm2的
小块，将叶柄切成每段 1 cm 长，接种到诱导培养基上。
培养基成分：MS[21]+6-BA 1.0 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L +蔗
糖 30 g/L+琼脂 8.0 g/L，pH 5.8。 培养基分装于直径 4
cm、高 9 cm 的培养瓶中，每瓶分装约 20 mL，121℃、20
min高温高压灭菌， 从灭菌锅取出后立即拧紧瓶盖，以
防止吸入携带细菌和真菌的冷空气而造成污染。 培养
基在常温下冷却凝固后，及时转移至超净工作台中，用
紫外灯照射杀菌 30 min以上， 备用。 接种后在瓶盖或
培养瓶侧面做好试验处理的编号和日期。 接种后第 1
周，先在培养室的黑暗处进行培养，以尽量减少酚类氧
化造成褐化现象； 接种后第 2 周开始进行正常的光照
下培养，25（±1）℃，光照强度为 54 μmol/m2·s，每天光照
12 h。 诱导培养 4~6周后出现愈伤组织。
1.2.3 芽的分化 将获得的愈伤组织转移至与 1.2.2
相同的培养基上，在相同条件下培养 4~6 周后，愈伤组
织表面出现绿色小芽。
1.2.4 生根培养 当小芽高度 3 cm 时， 从基部切下，
接种到生根培养基上。 培养基成分：1/2MS [21]+IBA 0.1
mg/L+蔗糖 30 g/L+琼脂 8.0 g/L，pH 5.8。 光照和温度条
件同 1.2.2，培养 4~8周后，陆续长出不定根。
1.2.5 各个培养阶段的抗生素敏感性测定 在上述各
阶段培养基中加入不同浓度梯度的抗生素， 具体设置
为：（1）卡那霉素：0（对照）、50、100、150、200、250、300
mg/L；（2）潮霉素：0（对照）、20、40、60、80、100、120 mg/L。
诱导培养 6 周后， 记录各个试验处理的外植体褐变死
亡数、愈伤组织数；分化培养 6 周后记录芽分化数；生
根培养 8周后，记录各个试验处理的生根情况。 统计外
植体褐变死亡率、 愈伤组织诱导率、 芽诱导率和生根
率：
褐变死亡率(%)=（褐变死亡外植体数÷接种外植体
总数）×100
愈伤组织诱导率(%)=（形成愈伤组织外植体数÷外
植体总数)×100
芽诱导率(%)=（形成芽外植体数÷愈伤组织总数)×
100
生根率(%)=（生根的芽数÷芽总数)×100
上述试验 3 次重复，每个重复 50 个外植体、愈伤
组织或芽。 方差分析使用 SAS V8.0 软件，差异显著性
分析使用邓肯氏多重比较检验。
2 结果与分析
2.1 两种抗生素对外植体褐化死亡的影响
从图 1可以看出，在不添加抗生素的对照组的外植
体褐变死亡率最低，其中叶片只有 3.3%，叶柄为 5.0%。
卡那霉素和潮霉素均能促进花烛叶片和叶柄外植体发
生褐变死亡，随着卡那霉素浓度的增加，叶片和叶柄褐
变率分别由 20.2%和 21.7%增加到 100%；随着潮霉素浓
度的增加， 叶片和叶柄褐变率分别由 43.3%和 45.5%增
加到 100%。 当卡那霉素浓度为 100 mg/L或潮霉素浓度
为 20 mg/L时，叶片和叶柄接近半致死剂量。
2.2 两种抗生素对花烛外植体愈伤组织诱导的影响
从图 2 可以看出，培养 6 周后，在不加任何抗生素
的对照组的愈伤组织诱导率最高， 其中叶片愈伤组织
诱导率达 93.3%，叶柄愈伤组织诱导率达 91.7%，二者
差异不显著。 卡那霉素和潮霉素对花烛叶片和叶柄愈
伤组织的诱导有较强的抑制作用， 随着卡那霉素浓度
的增加， 叶片和叶柄愈伤组织诱导率分别由 74.3%和
72.6%降至 0；而随着潮霉素浓度的增加，叶片和叶柄愈
伤组织诱导率分别由 48.3%和 43.3%降至 0。 当卡那霉
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图 3 卡那霉素和潮霉素对花烛芽诱导的影响
图 2 卡那霉素和潮霉素对花烛愈伤组织诱导的影响
素浓度为 100 mg/L 或潮霉素浓度为 20 mg/L 时， 接近
50%的叶片和叶柄愈伤组织诱导被抑制。 因此，为避免
全部褐变同时又不致假阳性过高， 当以叶片或叶柄为
转基因外植体时， 选择择压应以卡那霉素 100 mg/L或
潮霉素 20 mg/L为宜。
2.3 两种抗生素对芽分化的影响
分化培养 6周后，由愈伤组织上分化出芽。 从图 3
可以看出， 在不加任何抗生素的对照组的芽分化率最
高，达 87.5%。 添加卡那霉素或潮霉素对芽的分化均有
较强的抑制作用，并且随浓度增加而增强。 当卡那霉素
浓度为 50 mg/L时芽分化率为 65.8%， 当卡那霉素浓度
升为 150 mg/L时芽分化率降为 5.85%；当潮霉素浓度为
20 mg/L 时芽分化率为 42.5%， 当潮霉素浓度升为 40
mg/L时芽分化率降为 10.8%；当卡那霉素浓度达到 200
mg/L或潮霉素浓度达到 60 mg/L时，愈伤组织芽的分化
被完全抑制。 因此，使用该品种愈伤组织作为转基因受
体时， 选择压以卡那霉素 200 mg/L或潮霉素的选择压
60 mg/L为宜。
2.4 两种抗生素对生根的影响
将长度达到 3 cm 的芽切下转移至生根培养基
上，8 周后统计生根情况。 结果（图 4）表明，在未加任
何抗生素的对照组的生根率最高，达 95.3%；添加卡那
霉素和潮霉素对生根均有较强的抑制作用，并且随浓
度增加而加强。当卡那霉素浓度达到 150 mg/L 或潮霉
素浓度达到 40 mg/L 时，生根率即降为 0（图 4）；从平
均每个芽的生根数来看，未加任何抗生素的对照组的
生根数最多、达 4.6 条；添加卡那霉素和潮霉素的培养
基中，生根数显著减少，当卡那霉素浓度达到 150 mg/
L 或潮霉素浓度达到 40 mg/L 时，生根数为 0。 上述结
果表明，在该品种转基因植株生根阶段，卡那霉素的
适宜选择压为 150 mg/L， 潮霉素的适宜选择压为 40
mg/L。
3 结论与讨论
在植物转基因研究中， 通常采用抗生素来筛选转
化细胞，抑制非转化细胞的生长，其原理是转基因细胞
中因选择标记基因所表达的蛋白质能够有效降解选择
剂， 从而使转基因细胞在含有选择剂的环境中得以存
活，并进一步获得转基因植株，而非转化细胞因不能降
解选择剂而被抑制。 目前，花烛遗传转化研究中，使用
频率最高的是卡那霉素磷酸转移酶基因（nptⅡ），其次
是潮霉素磷酸转移酶基因（hptⅡ），它们表达的酶能够
分别将卡那霉素和潮霉素转化成对植物无毒害的物
质， 使转化的细胞得以存活从而进一步获得转基因植
株。 在花烛转基因抗性筛选时，使用的抗生素浓度品种
间存在一定的差别。 在愈伤组织和芽诱导阶段，卡那霉
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图 4 卡那霉素和潮霉素对生根的影响
素在花烛品种 Red Queen 的使用浓度较低、 为 30~75
mg/L，而旭日的使用浓度则较高、达 300 mg/L，其他品
种如 Rudolph、Arizona 和 ARZ 等介于 50~200 mg/L 之
间；潮霉素在花烛品种 ARZ、KLT’和 ATL 的使用浓度
为 18~26 mg/L， 而在大哥大花烛中使用的浓度为 50
mg/L。 本研究结果表明，阿拉巴马花烛叶片或叶柄在愈
伤组织和芽诱导阶段，卡那霉素选择压为 150 mg/L，介
于前人报道的一些品种之间； 而该品种这一阶段潮霉
素选择压为 40 mg/L， 属于潮霉素耐受力比较强的品
种。 生根阶段也是转基因的重要筛选步骤，杨柳等[9]在
花烛 T×Z 和 ART 转化生根阶段中使用卡那霉素 30
mg/L，刘宝骏等 [16]在罗宾奴和粉冠军使用卡那霉素 15
mg/L、潮霉素 5 mg/L。 本研究表明，在阿拉巴马生根阶
段使用卡那霉素 150 mg/L 或潮霉素 40 mg/L， 不同基
因型的花烛对抗生素敏感性具有较大差别， 具体操作
时要根据敏感性试验来确定最适宜的选择压。 另外，本
研究中不仅生根阶段外植体对抗生素比较敏感， 生根
阶段添加抗生素后，根的发生被抑制，芽的生长也受到
极大抑制，生长极其缓慢，叶片逐渐变黄，不再长出新
叶，芽逐渐死亡。 这表明生根阶段也可根据芽和叶片的
表现来筛选适宜的选择压。
值得注意的， 本研究发现两种抗生素能够增加叶
片和叶柄外植体褐化发生，在进行转基因筛选时，如果
选择压力过大， 可能会因为严重褐化而导致转化的失
败，因为转化的细胞虽然能够抵抗抗生素的威胁，但难
以抗拒周围细胞褐化造成的毒害作用，因此，在利用叶
片或叶柄作转化受体时，根据实际情况，可以对两种抗
生素的工作浓度进行适当调整，比如适当降低选择压。
参考文献：
[1] Kuehnle A R, Sugi N. Induction of tumors in Anthurium
andraeanum by Agrobactemium tumefacien [J]. HortScience,
1991,26(10):1325-1328.
[2] Chen F C, Kuehnle A R. Obtaining transgenic Anthurium
through Agrobacterium- mediated transformation of etiolated
internodes [J]. Journal of the American Society for
Horticultural, 1996,121:47-51.
[3] Chen F C, Kuehnle A R, Sugii N. Anthurium roots for
micropropagation and Agrobacterium tumefaciens mediated
gene transfer [J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture,
1997,49:71-74.
[4] Yakandawala G, Peiris S E, Yakandawala Y L N. Transient
expression of uidA reporter gene in regenerable callus
tissues of Anthurium andraeanum Lind. by Agrobacterium
mediated transformation [J]. Tropical Agricultural Research,
2000,12:50-55.
[5] Kuehnle A R, Fujii T, Chen F C, et al. Peptide biocides
for engineering bacterial blight tolerance and susceptibility
in cutflower Anthurium[J]. HortScience, 2004,39:1327-1331.
[6] 李小军 .农杆菌介导的 NPPR1 基因转化红掌的研究 [D].上
海:上海师范大学,2005.
[7] 姚振. 类胡萝卜素合成酶基因 PSY、PDS、LycB、LycE 对安祖
花与蝴蝶兰的遗传转化[D].长春:吉林大学,2005.
[8] 梁凤龙.红掌遗传转化受体系统的建立及转化研究[D].广州:
华南农业大学,2007.
[9] 杨柳 .农杆菌介导的安祖花遗传转化研究 [D].天津 :天津大
（下转第 79页）
56
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学,2007.
[10] 周静.农杆菌介导低温诱导转录因子 CBF1 基因转化安祖花
的研究[D].长春:吉林大学,2009.
[11] 张燕,黎斌,李思锋,等.用激光微束穿刺法将双抗虫基因导入
红掌的研究[J].激光生物学报,2009,18(1):3-5.
[12] 冯圆圆. 外源开花素基因 FT 对安祖花遗传转化的研究[D].
天津:天津大学,2009.
[13] 刘炤. 杆菌介导转录激活因子 CBF3 转化安祖花的研究[D].
武汉:华中农业大学,2009.
[14] Zhao Q, Jing J, Wang G, et al.Optimization in Agrobacterium-
mediated transformation of Anthurium andraeanum using GFP as
a reporter [J]. Electronic Journal of Biotechnology, 2010,13:1-
12.
[15] 王芬.农杆菌介导的墨兰和红掌的遗传转化 [D]广州 :华南农
业大学,2009.
[16] 刘宝骏. 农杆菌介导 AtCBF3 及 PaFT 基因转化安祖花的研
究[D].武汉:华中农业大学,2011.
[17] Fitch M M M, Leong T C W, H e X L, et al. Improved
transformation of Anthurium. HortScience, 2011,46: 358 -
364.
[18] Tracie K M, Lisa M K, Roxana Y M C, et al. Screening
promoters for Anthurium transformation using transient
expression[J]. Plant Cell Rep, 2013,32:443-451.
[19] Van Den Elzen P J M, Townsend J, Lee K Y, et al. A
chimaerichygromycin resistance gene as a selectable marker
in plant cells[J].Plant Molecular Biology,1985,5:299-302.
[20] Bevan M V, Flavell R B, Chilton M D. A chimaeric
antibioticresistance gene as a selectable marker for plant
cell transformation[J].Nature,1983,294:184-187.
[21] Murashige T, Skoog F. A revised medium for rapid growth
and bioassays with tobacco tissue cultures[J]. Physiol Plant,
1962,15:473-497.
（责任编辑 邹移光）
（上接第 56页）
Zn(mg/kg)
14.48±4.08a
19.13±4.06a
B(mg/kg)
10.70±1.71b
15.73±1.21a
Mg(%)
0.10±0.04a
0.16±0.03a
Ca(%)
0.50±0.08b
0.75±0.10a
K(%)
0.77±0.05a
0.88±0.05a
P(%)
0.29±0.02b
0.36±0.01a
N(%)
1.51±0.14a
1.71±0.14a
处理
固体肥料
液体肥料
表 4 液体肥料对荔枝叶片养分含量的影响
19.4%和12.6%，磷含量显著高于对照；钙镁锌硼含量提
升效果明显高于氮磷钾， 分别比对照 32.6%、34.0%、
32.0%和 24.4%，其中钙和硼含量显著高于对照。
3 结语
相对于固体肥料，液体肥料施入土壤后，养分可直
达根系，降低其被土壤固定的数量，并且容易被作物直
接吸收，提高养分吸收速率和肥料的养分利用率 [8]。 本
试验结果表明，使用比固体肥料减量 30%的液体肥料，
可以显著提高荔枝秋稍叶片氮、磷、钾、钙、镁、硼、锌元
素的吸收，进而促进产量提高和品质改善，具有明显的
节肥增收效果， 并能减少化肥施用对作物和环境的污
染。 研究和开发各种液体化肥， 科学合理施用液体化
肥，能降低农业生产成本、提高农产品的种植效益，为
农业和化肥工业的可持续发展提供科技支撑。
参考文献:
[1] 余华荣，周灿芳，万忠，等.2011 年广东荔枝产业发展现状分
析[J].广东农业科学，2012(4):16-18.
[2] 广东省统计局 .广东农村统计年鉴-2011[M].北京 :中国统计
出版社,2011.
[3] 冼凯敏，陈菁，孙光明，等 .不同施肥水平对荔枝园土壤、叶
片磷含量及产量的影响[J].广东农业科学，2009，31(2):39-41.
[4] 鲁如坤.土壤农业化学分析方法[M].北京:中国农业科学技术
出版社,1999:308-316,430-434,458-462.
[5] 中国人民共和国国家标准 GB6195-86 水果、 蔬菜制品
维生素 C 含量的测定 [S]. 北京: 中华人民共和国农牧渔业
部,1986.
[6] 王学奎.植物生理生化实验原理和技术[M].北京:高等教育出
版社,2006.
[7] 舒肇甦,陈厚彬,袁沛元,等.妃子笑荔枝分批单果采收技术初
探[J].广东农业科学，2007(12):33-34.
[8] 黄燕，汪春，衣舒娟 .液体肥料的应用现状与发展前景 [J].农
机化研究，2006(2):198-120.
（责任编辑 杨贤智）
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