全 文 ：卡那霉素和潮霉素对芦竹不定芽诱导与生长的影响
彭金库，徐青青，周莉凡，韩志萍，杨志红* (湖州师范学院，浙江湖州 313000)
摘要 ［目的］研究组培条件下芦竹(Arundo donax Linn．)对植物基因工程常用抗生素卡那霉素和潮霉素的敏感性，为芦竹基因工程载
体构建及转基因植株筛选奠定基础。［方法］芦竹外植体预培养 3 d后接种于添加不同浓度卡那霉素或潮霉素的不定芽诱导培养基中
培养，研究 2种抗生素对芦竹外植体不定芽诱导及生长的影响。［结果］2种抗生素在一定浓度下对芦竹外植体不定芽诱导和生长都有
影响。潮霉素浓度在 5 ～50 mg /L时，随着浓度增大，对芦竹不定芽诱导及生长的抑制作用均增强;浓度达到 50 ～100 mg /L时，外植体生
长、分化逐渐停止直至死亡。卡那霉素浓度在 5 ～100 mg /L时，对不定芽诱导产生促进作用。［结论］潮霉素在较低浓度下对芦竹外植
体不定芽诱导和生长产生抑制作用，适合作为芦竹转基因选择标记。
关键词 芦竹;抗生素;卡那霉素;潮霉素
中图分类号 X131． 2 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2011)15 －08858 －03
The Influence of Kanamycin and Hygromacyin on Adventitious Buds Induction and Growth of Arundo donax Linn．
PENG Jin-ku et al (Huzhou Normal University，Huzhou，Zhejiang 313000)
Abstract ［Objective］The sensitivity of Arundo donax Linn． to kancymycin and hygromycin under tissue culture were studied in this re-
search，which provided basis for the construction of Arundo donax Linn． gene project construction and screening of transgenic plants． ［Meth-
od］Explants of Arundo donax Linn． were cultured for three days and then transferred to adventitious buds induction and growth medium adding
with different concentration of kancymycin and hygromycin． ［Result］The result showed that both of the two kinds of antibiotics had influences
on adventitious buds induction and growth． In 5 － 50 mg /L hygromycin medium，both of the induction rates and growth of adventitious bud
were restrained． Hygromycin caused the death of explants in 50 － 100 mg /L concentration． For kanamycin，the concentration of 5 － 50 mg /L
can improve the induction rate of adventitious bud． The results showed that hygromycin was prefect for transformation of Arundo donax linn．
［Conclusion］Hygromycin restrained the induction and growth of adventitious bud under low concentration，and was suitable for the mark of
transgenic choice of Arundo donax Linn．
Key words Arundo donax Linn．;Antibiotic;Kanamycin;Hygromycin
基金项目 浙江省大学生科技创新项目;浙江省钱江人才计划项目
(2009R10016)。
作者简介 彭金库(1990 －) ，男，浙江瑞安人，本科生，专业:生物工程。
* 通讯作者，E-mail:yangzhihong@ hutc． zj． cn。
收稿日期 2011-03-02
水体富营养化问题，是我国近年来面临的比较严重的
一个环境问题。经过多年的研究，污染水体的植物修复技术
作为一项绿色污染治理技术已经取得很大进展，为污染水体
的修复作出了重要的贡献，但是该技术仍有许多不完善的地
方［1］。芦竹(Arundo donax Linn．)又称荻芦竹、江苇，是一种
多年生草本植物，在我国分布很广，北起辽宁，南至广西都有
生长。芦竹的生物量大，适应性强，生长于河堤两旁及池塘
边［2］。芦竹种植既可固土护堤，又可美化和保护湿地生态环
境，是一种理想的湿地污染修复植物［3］。
芦竹虽然对于污染修复具有一定的作用，但是效果比较
缓慢。如果能够用现代生物技术将芦竹改造成为一种超级
污染修复植物，对于污染治理将起到很好的作用。在生物技
术中，应用基因工程改造植物是一种常用的方法，可以将植
物材料加以改造使之符合需要。其中，抗生素经常被用作植
物转化过程中的筛选标记。因此，了解某种外植体对抗生素
的敏感性，将有助于确定遗传转化中所采用的抗生素种类与
浓度。这对于使用抗生素抗性基因作为选择标记进行抗性
植株的有效筛选十分重要［4］。因此，抗生素种类及其使用浓
度的筛选是建立转化体系的重要内容［5］。为此，笔者研究了
芦竹外植体在组培条件下转化过程中常用的 2 种抗生素对
芦竹外植体不定芽诱导及生长的影响，以期为今后深入开展
芦竹转化工作奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料 芦竹外植体来源于太湖实生芦竹建立的组培
体系。卡那霉素，由 Duchefa 公司生产;潮霉素，由 Roche 公
司生产;母液质量浓度卡那霉素和潮霉素各为 50 mg /ml，配
制参考 Sambrook等的方法［6］。不定芽诱导培养基:MS + 6-
BA 5． 0 mg /L + IBA 0． 5 mg /L +30 g /L蔗糖 +6 g /L琼脂，pH
为 5． 8。
1． 2 方法
1． 2． 1 抗生素及浓度设置。2种抗生素浓度梯度分别设置
为:①潮霉素 0、5、10、20、50、100 mg /L;②卡那霉素 0、5、10、
20、50、100、500 mg /L。
1． 2． 2 抗生素对芦竹不定芽诱导及生长的影响。挑取大
小、质地、生长状况相近的芦竹组培无菌芽体为外植体，分别
接种入添加不同浓度梯度 2 种抗生素的不定芽诱导培养基
中进行培养。每个浓度梯度接种 12 个外植体，设 3 次重复，
以不添加抗生素为对照。培养条件:培养温度 25 ℃，光照强
度 2 500 lx，光照时间 16 h /d。观察不同抗生素种类及浓度
对外植体不定芽诱导和生长的影响，30 d后统计不定芽的数
目及其生长状况。
1． 3 数据分析。使用 SPSS 11． 5 软件对数据进行单因素方
差分析。
2 结果与分析
2． 1 潮霉素对芦竹外植体不定芽诱导及生长的影响 潮
霉素是植物细胞转化过程中常用的一种抗生素，对许多种植
物都产生很高的毒性。因为它是一种很强的细胞生长抑制
剂，它抑制核糖体上肽链的延长，从而导致细胞死亡［7］。由
图 1可知，芦竹外植体对潮霉素比较敏感，在不同浓度的潮
霉素中外植体的生长状况有很大差异。由表 1 可知，添加 5
～100 mg /L潮霉素的培养基中外植体生长 30 d后，不定芽
诱导个数和对照相比有极显著差异，说明潮霉素对不定芽的
分化和生长有抑制作用，而且抑制作用随着浓度增大而增
强。添加 5 mg /L潮霉素培养基中观察到部分不定芽褐化现
责任编辑 姜丽 责任校对 况玲玲安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2011，39(15):8858 － 8860
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.15.017
象;当浓度达到 10 mg /L时，培养 18 d后嫩芽便开始出现失
绿、褐化现象，30 d后完全褐化;浓度在 20 mg /L 时，不定芽
诱导量与对照和 5、10 mg /L 相比有极显著差异，而且不定芽
的生长量也明显受到抑制;浓度达到 50 ～ 100 mg /L时，外植
体生长 30 d后没有不定芽诱导产生，并且外植体全部褐化死
亡，说明潮霉素已经完全抑制了芦竹不定芽的诱导及生长。
注:A．对照;B．培养基中添加 5 mg /L潮霉素;C．培养基中添加 10 mg /L潮霉素;D．培养基中添加 20 mg /L潮霉素;E．培养基中添加 50 mg /L潮
霉素;F．培养基中添加 100 mg /L潮霉素。
Note:A，Control;B，5 mg /L hygromycin in medium;C，10 mg /L hygromycin in medium;D，20 mg /L hygromycin in medium;E，50 mg /L hygromycin
in medium;F，100 mg /L hygromycin in medium．
图 1 不同浓度潮霉素培养基中芦竹外植体生长状态
Fig． 1 Grow condition of Arundo donax Linn． on different concentration of hygromycin containing medium
表 1 潮霉素对芦竹外植体不定芽诱导及生长的影响
Table 1 The influence of hygromycin on adventation buds induction
and growth of Arundo donax Linn． explants
潮霉素浓度∥mg /L
Concentration
of hygromycin
不定芽数∥个
No． of adventitious
buds
生长状况
Condition after
one month
0 16． 89 A 生长良好
5 5． 56 B 部分芽褐化且生长受抑制
10 2． 36 C 全部芽褐化且生长受抑制
20 0． 78 D 褐化死亡
50 0 D 褐化死亡
100 0 D 褐化死亡
注:数据后同列不同大写字母表示在 0． 01 水平上有差异(P ＜ 0． 01)。
Note:Different capital letter in the same row after the data suggested difference at
0． 01 level (P ＜0． 01)．
2． 2 卡那霉素对芦竹嫩芽分化及生长的影响 卡那霉素
是目前转化报道中用得最多的一种抗生素。由图 2 可知，不
同浓度的卡那霉素对芦竹不定芽诱导及生长状况有不同程
度的影响。由表 2可知，与对照相比，5 ～100 mg /L卡那霉素
对芦竹外植体不定芽的诱导有极显著促进作用;但卡那霉素
浓度达到 500 mg /L时，芦竹外植体不定芽的诱导受到完全
抑制，与对照和其他处理相比有极显著差异，同时外植体逐
渐褐化死亡。试验中，10 ～100 mg /L卡那霉素虽然对芦竹外
植体不定芽的诱导有极显著促进作用，但是诱导产生的不定
芽随着卡那霉素浓度的升高出现了白化现象，并且浓度在 50
和 100 mg /L时诱导出的不定芽生长矮小，表明卡那霉素对
于不定芽的诱导和生长有不同的影响，只有在极高的浓度下
才能抑制外植体不定芽的诱导，并杀灭外植体。卡那霉素对
芦竹外植体生长的影响总体表现为，随着卡那霉素浓度增
大，外植体中黄化比例逐渐增高，较高浓度条件下外植体生
长高度下降，极高浓度条件下引起褐化、死亡。
注:A．培养基中添加 5 mg /L卡那霉素;B．培养基中添加10 mg /L卡那霉素;C．培养基中添加20 mg /L卡那霉素;D．培养基中添加50 mg /L卡那
霉素;E．培养基中添加 100 mg /L卡那霉素;F．培养基中添加 500 mg /L卡那霉素。
Note:A，5 mg /L kancymycin in medium;B，10 mg /L kancymycin in medium;C，20 mg /L kancymycin in medium;D，50 mg /L kancymycin in medi-
um;E，100 mg /L kancymycin in medium;F，500 mg /L kancymycin in medium．
图 2 不同浓度卡那霉素培养基中芦竹外植体生长状态
Fig． 2 Grow condition of Arundo donax Linn． on different concentration of kancymycin containing medium
3 结论与讨论
(1)农杆菌介导的植物基因工程是外源基因导入植物常
用的方法之一。这种方法成功的关键之一就是要有合适的
转基因体系，其中转基因载体的构建是很关键的步骤，直接
涉及到后续工作的顺利进行。为了构建适合芦竹转基因用
的载体，除了考虑基因的表达以外，另外一个重要的因素就
是要有合适的选择标记基因。常用的方法中抗生素选择具
有很多优点，因此采用抗生素抗性基因构建载体，在后续工
作中实现采用抗生素选择转化子是一种最常用的方法。其
中，潮霉素和卡那霉素是最常用的 2 种抗生素。对于芦竹，
这 2种抗生素的适应性是很重要的一个选择依据。抗生素
培养基中选择的目标是转化子能生长、分化，而非转化子生
长、分化受到抑制或者死亡。该研究对潮霉素和卡那霉素培
养基中非转基因芦竹的表现进行了观察，从而确定了非转基
958839 卷 15 期 彭金库等 卡那霉素和潮霉素对芦竹不定芽诱导与生长的影响
因芦竹在这 2种抗生素中的死亡浓度。潮霉素浓度达到 20
mg /L以上，卡那霉素浓度达到 500 mg /L 时，芦竹外植体的
分化和生长被完全抑制，30 d后死亡。这 2 个浓度极限值对
于转基因过程中抗生素浓度的选择是一个很重要的依据。
表 2 卡那霉素对芦竹外植体不定芽诱导及生长的影响
Table 2 The influence of kancymycin on adventation buds induction
and growth of Arundo donax linn． explants
卡那霉素浓度∥mg /L
Concentration
of Kanamycin
不定芽数∥个
No． of
adventitious buds
生长状况
Condition after
one month
0 16． 86 A 生长良好
5 21． 17 B 生长良好
10 22． 33 B 出现日化芽
20 18． 75 C 几乎全部日化
50 27． 28 D 白化且矮小
100 22． 11 B 白化且矮小
500 0 E 褐化死亡
注:数据后同列不同大写字母表示在 0． 01水平上有差异(P ＜0． 01)。
Note:Different capital letter in the same row after the data suggested difference
at 0． 01 level (P ＜0． 01)．
(2)潮霉素、卡那霉素为常用转化子筛选抗生素，这 2种
抗生素对芦竹外植体不定芽的诱导和生长影响不同。在该
研究中发现，潮霉素对芦竹外植体不定芽的诱导和生长的影
响随着浓度的增大而增强。10、20 mg /L潮霉素对芦竹不定
芽的诱导已经达到了极显著抑制，诱导出的不定芽生长也受
到很大影响。理论上，在转化过程中，转基因外植体完全可
以在该浓度下筛选出来。卡那霉素对不定芽的诱导表现为:
在 5 ～100 mg /L时出现极显著的促进作用，只有在极高浓度
(500 mg /L)下才出现抑制作用。但如果使用极高浓度作为
转化子的筛选，转化子有可能同时被杀灭。目前，国内外没
有研究报道用 500 mg /L浓度作为转化子筛选浓度。适宜的
筛选抗生素应能准确地区分转化子与非转化子［8］。该试验
中，10 ～20 mg /L潮霉素对非转基因植株表现出较强的抑制
作用，而且该浓度在非转基因植株致死浓度阀值附近。理论
上，该浓度附近，转基因植株可以分化、生长，而非转基因植
株分化、生长受到抑制。因此，在转基因过程中，可以使用其
作为转化子筛选浓度。
参考文献
［1］刘音，张升堂．被污染水体的植物修复技术研究进展［J］．安徽农业科
学，2009，37(15):7147 －7149．
［2］马文奎．芦竹的栽培和综合利用［J］．中国野生植物资源，2006，25(2):
64 －65．
［3］韩志平，杨志红，吴湘，等．铅胁迫对芦竹抗氧化酶活性的影响［J］．核
农学报，2010，24(4):846 －850．
［4］孙琮晗，李滨胜，崔杰．两种抗生素对甜菜离体叶柄分化的影响［J］．中
国甜菜糖业，2006(3):18 －20．
［5］BLANC G，BAPTISTE C，OLIVER G，et al． Efficient Agrobacterium tumefa-
ciens-mediated transformation of embryogenic calli and regeneration of Hev-
ea brasiliensis Mull Arg． plants［J］． Plant Cell Rep，2006，24(12):724 －
733．
［6］SAMBROOK J，FRITSCH E F，MANLAITS T．分子克隆实验指南［M］． 2
版．金冬雁，译．北京:科学出版社，1998:912 －913．
［7］陆万香．玉米几丁质酶基因导入甘蓝型油菜的研究［J］．西南农业大学
学报，2001，23(2):130 －133．
［8］陈慧勤，赵淑清．植物抗病反应及系统获得抗性研究进展［J］．山西农
业大学学报，2003，23(3):
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
286 －291．
(上接第 8849 页)
茎直径也较大，后代植株长势也较旺。
表 5 不同类型慈姑植株抽生匍匐茎的差异
Table 5 Difference of creeping stems of different kinds plants of Sagit-
taria trifolia L．
类型
Types
数量∥条
Number(piece)
直径∥cm
Diameter
母株 Maternal strain 9． 2 b 3． 1 a
1 代匍匐茎形成的植株 Strain
formed by first generation of decum-
bent stem
9． 5 a 3． 0 a
2 代匍匐茎形成的植株 Strain
formed by second generation of de-
cumbent stem
9． 0 c 3． 1 a
注:同列不同小写字母表示各处理在 0． 05水平上差异显著。
Note:Different small letters in the same row suggested differences of each
treatment at 0． 05 levels．
(2)试验以慈姑试管苗匍匐茎为分割单位，进行了 2 代
的继代培养，结果显示，每增殖一代其平均繁殖系数约为
9． 24，每代培养时间约为 70 d。由于时间关系，笔者未能进
行第 2代以后的继代培养试验。如第 2 代以后的繁殖系数
和培养时间与第 1、2代相似，可测算出采用该方法进行慈姑
快繁的年繁殖系数约为 105 073，该繁殖系数远高于常规的
繁殖系数，这有待进一步试验证实。
(3)在诱导匍匐茎的试验过程中发现，经过多代培养之
后，慈姑匍匐茎所形成的植株中畸形苗所占的比例逐渐上
升，对于一些畸变的植株，通过不加激素的 1 /2MS + 30 g /L
蔗糖培养基复壮后仍能形成正常植株，但是大部分试管苗都
在复壮培养过程中死亡，有必要对其产生的原因及克服的方
法进行研究。
参考文献
［1］陈家宽．中国慈姑属的系统与进化植物学研究［M］．武汉:武汉大学出
版社，1989．
［2］陈家宽，杜光伟，易清明．运用 AP-PCR对中国慈姑属内亲缘关系的研
究［J］．植物分类学报，1998，36(3):216 －221．
［3］熊范孙．慈姑［J］．食品与生活，2001(5):15．
［4］赵有为．中国水生蔬菜［M］．北京:中国农业出版社，1999．
［5］程智慧．蔬菜栽培学各论［M］．北京:科学出版社，2010．
［6］邢湘臣．慈姑的食疗［J］．蔬菜，2002(8):40．
［7］肖汝松．慈姑优质高产栽培技术［J］．云南农业，1998(3):13．
［8］朱红莲，柯卫东，汪李平．慈姑茎尖组织培养与快速繁殖［J］．中国蔬
菜，2006(3):17 －19．
［9］牛玉璐，曹永胜．绶草的组织培养与快速繁殖研究［J］．畜牧与饲料科
学，2009，30(10):183．
［10］ZHAO X J，ZHANG H X． Study on Tissue Culture and Radiation Mutation
of Astragalus membranaceus Bge． var． mongholicus(Bge．)Hsiao［J］． Ag-
ricultural Science ＆ Technology，2009，10(2):37 －40．
［11］ZHANG W，GUO X D，WANG Y，et al． Study on tissue culture and effec-
tive clone establishment of Hemistepta lyrata Bunge［J］． Agricultural Sci-
ence ＆ Technology，2009，10(1):47 －50，104．
［12］MENG D Q，YUAN D B，ZHANG Y F，et al． Reproduction of the three －
line genic male sterile line parent Mian 7MB －1(Brasscia napus L．)and
seed production of F1 based on somatic tissue culture［J］． Agricultural
Science ＆ Technology，2009，10(1):22 － 25，114．
0688 安徽农业科学 2011年