全 文 ：第 01 卷第 6 期
1 9 9 4 年 1 2 月
生 物 化 学 杂 志
C h in e s e B i o e h e m i e a l J o u r n a l
V o l
.
1 0
,
N o
.
6
D e e
. ,
19 9 4
①
红花菜豆凝集素的荧光光谱学研究
阮康成 施炜星 郑 乐 孙 册
( 中国科学院上海生物化学研 究所 , 上海 2 0 0 0 3 1 )
摘要 利 用 关光光语方 法研 究 了红 花莱豆凝 集素 ( hP ase ol us ~ ~ : va r
.
ru b
r 记刀Za n
us lce t in
, 简称
P C L )
, 结果表明 P C L 分 子各亚墓 中的两个 色氮酸 ( T pr )残基分 别位于 P C L 分子表面 和分子 内 。 标记
了 D N S 的 P C L 荧光偏振研究担出 , 致使 P C L 在 10 m m ol / L SDS 条件下失 活的主要 原 因可能是亚基
解离 。 关光偏振研究还表明 , 甲状腺球蛋 白 、 甘霉聚糖 、 海参多糖硫酸醋可 与 P C L 结合 。 关光探针 ib s -
A N S 与 P C L 的结合可 引起 明显的 关光猎 强和发射语蓝移 , 表明 P C L 分 子中存有疏水 区域 。 结合 了的
b is
一
A N S 还可 和 P C L 中的 T r p 发 生能圣传递 。
关键词 : 红花菜豆凝集素 ; 荧光光谱学 ; 荧光偏振
红花菜豆凝集素 (P C L )具有较强的的凝集红血球的能力 ,其分子量为 1 2 k8 D , 由 4 个相 同
亚基组成 , 每个亚基中含有 1 个酪氨酸残基 、 2 个色氨酸残基和 16 个苯丙氨酸残基 。 我们已对
P C L 分子的基本理化特性作了一些研究 1j[ ,本文进一步用荧光光谱学法研究 P C L 的结构 。
材 料 和 方 法
一 、 样品制备
红花菜豆凝集素 ( P C L ) 按施炜星等的方法纯化 , 纯化后的 P C L 经圆盘聚丙烯酞胺电泳
和 S D S 一聚丙烯酞胺凝胶电泳 均显示为一条蛋 白质带 1j[ 。 在本文中 , 除特别指出外 , P C L 样品
均溶解在 0 . 05 m ol / L T isr 一 H CI p H 7 . 5 缓冲液中 , P C L 的浓度通过测定其在 2 80n m 处 的光吸
收 由玛能m m 一 12 . 9 计算得之 lj[ 。
二 、 P C L 血凝活力测定
在微量 v 型板上按孙册方法进行 2j[ 。
三 、 N B s ( N 一澳代丁二酞亚胺 ) 对色氮酸残的修饰
采用 S p a n d 。 方法 巨3〕 。
四 、 l , 5一 n a n s y l e h l o r i d e ( n N s ) 和 f l u o r e s e e i n 一 5一 i s o t h ioc y a n a t e ( F I T C ) 对 p C L 的标记
采用 R u a n 和 w e b e r 方法进行 [` 〕 , 标记后剩余的荧光探针 D N S 和 F I T C 均通过 S e p h a d e x
G
一
25 柱除去 。 标记了 D N S 和 IF T C 的 P C L 的分别用 D N S 一P C L 和 IF T C 一 P C L 表示 。
① 收稿 日期 : 1 9 9 3一 0 9一 1 1 ;修 回日期 : 1 9 94 一 0 3一 14
6 7 6
DOI : 10. 13865 /j . cnki . cj bmb. 1994. 06. 008
五 、 试剂
D N S
、
F I T C 以及 bis一 A N S (1 . 1 ’ 一 bi(4一 a ni li no) nap ht ha le ne一 5, 5 ’ 一d is u lf o n ic a e id ) 购 自
美国 M ol ec ul ar rP ob e 公司 , 脉和肌购 自 lF u k a 公司 , 海参多糖硫酸醋为天津药物所樊绘曾同
志赠予 , 其余试剂均为国产分析纯 。
六 、 仪器和装置
样品的荧光光谱用 H it ac hi F 一 4 0 1。 荧光分光光度计测定 ; 荧光偏振在我们自制的光子计
数荧光偏振仪上测定川 。 在测定 D N S 一 P CI J 的偏振时 , 激发光波长经单色仪选定为 3 4 0n m , 并
用滤光片 o 一 54 除去光栅产生的二级光谱 , 发射光经滤光片 3一 73 后检测 ; 测定 IF T C 一 P C L 偏振
时 , 激发光波长为 4 90 n m ; 发射光经滤光片 3一 70 检测 ; 光吸收在 iH t ac hi U 一 2 0 0 0 分光光度计
上测定 , 所有测定均在 20 ℃进行 。
结 果 和 讨 论
一 、 P c L 的内源荧光
iF g
.
1 中的曲线 1是用波长为 2 80n m 的紫外光激发 P c L 产生的荧光发射谱 , 曲线 2 是游
离酪氨酸和色氨酸混合样品 (比例为 1 : 2 , 与 P C L 各亚基中的酪氨酸与色氨酸残基数之 比相
同 ) 在同样缓冲液 中的发射谱 。 从图中可知 , P C L 的荧光主要来自色氨酸残基的贡献 , 与自
由色氨酸相 比较 , P C L 的最大发射波长蓝移近 20 n m , 说明 P C L 中的色氨酸残基处在较疏水
的环境中 。 另外在 P C L 的荧光谱中 , 基本上观察不到酪氨酸残基的荧光 , 这很可能是由于酩
氨酸和色氨酸之间的能量传递所致 , 在激素 L H一 R H 中亦观察到这样的现象 s[] 。 在 N a A c 一 H A c
p H 4 条件下用 N B S 修饰 P C L 中的 T r p , 观察到 2 8 o n m 处的光 吸收从 0 . 7 4 2 下降到 0 . 5 6 3
(样品 P C L 的摩尔浓度为 7 . 8拜m ol / L ) 。 根据 S aP n d e 光吸收方法计算 , 可知每 个 P C L 分子有
4
.
6 个色氨酸残基 . 即每个亚基约有 1 . 1个色氨酸被 N B S 氧化 ; 而在 6m ol / L 肌或 sm ol / L 脉
中 , N B S 可使 P C L 分子中 8 个色氨酸残基被修饰 , 说明在天然状态下 , 每个亚基含有两个色
氨酸残基 , 其 中一个位于分子表面易于被 N B S 修饰 , 另一个则在 P C L 分子内部 , 在天然状态
下不易被 N B S 修饰 。 F i g . 2 是在 0 . o s m o l / L T r i s 一 H C I p H 7 . 5 条件下用 N BS 修饰 P C L 时其荧
光发射谱的变化 。 从图上可以清楚地看到 , 随着 N B S 量的增加 、 色氨酸残基的被修饰 , P C L
荧光强度不断下降 , 但发射谱形状和最大发射波长并无明显变化 , 提示上述位于 P C L 分子表
面的 T rP 残基的侧链叫噪基团并未直接和溶剂分子接触 , 亦是处在较疏水的环境中 , 否则随
着这一色氨酸残基被 N B S 修饰 , P C L 荧光谱应该有明显的蓝移 。
二 、 低浓度 SD S 对 P C L 的影响
在凝血实验中我们曾发现 , 10 m m ol / L 的 S D S 可使 P C L 失去原有血凝活力的 8 % 。 在此
条件下的圆二色性研究表 明其 a 螺旋略有增加 , 而 各折迭有所减少 , 在此条件下的 P C L 的荧
光谱列在 iF g . 3 中 。 从图中可以观察到 10 m m ol / L S D S 对 P C L 的内源荧光特性影响不大 , 最
大发射波长仅有 4n m 的红移 , 荧光强度仅略有下降 。 说明 P C L 中的 T rP 残基周围的构象发生
了一些变化 , 但程度较小 。 这些现象提 出了一个有意思的问题 , 即在此条件下 P C L 的明显失
活是否由于上述构象的变化引起的? 我们用 1 , 5一 D N S 标记 P C L (标记后的 P C L 用 D N S 一 P C L
表示 ) , 通过测量其荧光偏振的变化进一步研究了这一问题 。 经测定在 10 m m ol L/ S D S 存在
时 , D N S 一 P C L 的荧光偏振为 0 . 1 1 9 , 较之无 S D S 时的 。 . 21 0 下降了近一倍 。 标记在蛋白质分
子
6 7 7
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F呛 . 1 F lu o r e s e e n e e s p e e t r a o f P C L
1
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.
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T恤 m i x t u r e o f f r e e T r p ( 6 · 2 4拜m o l/ L ) a n d T y r
( 3
.
1 2拜m o l / L ) in t h e s a m e b u f f e r a s i n e u r v e 1 .
E x e i t a t i o n w a v e l e n g t h
:
2 8 o n m
F论. 2 F l u o r e s e e n e e e m is s i o n s p e e t r a o f P C L m o d i fi e d b y
N B S
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: 0
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7 8 拜m o l / L , i n o
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0 5 m o l / L p H 7
·
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e o n e e n t r a t io n s ( f r o m t h e t o p e u r
v e t o t h e b o t t o m )
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,
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,
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, 2 4 0 , 3 60 m m o l / L
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v e le n g t h
: 2 8 o n m
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a v e l e n g t h (nm )
F论. 3 F lu o r e s e e n e e e m i s s i o n s p e e t r a o f P C L i n t h e p r e s e n e e
o f 1 0m m o l / L S D S
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e e u r v e : i n t h e a bs e n e e o f S D S ;
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.
P C L e o n e e n t r a t i o n
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.
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PH 7
.
5 b u f f
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.
E x e i t a t i o n w a
v e l e n g t h
: 2 8 0 n m
上的 D N S 的荧光偏振是与蛋 白质分子的大小
直接相关的 , 这样幅度的荧光偏振变化很自然
地被推断为是 由于四聚体 的 P C L 解离成亚基
所致 。 我们进一步按照 P e r r i n 一W e b e r 公式 r =
( 1 / P Z
一
l / P O ) / ( 1 / P l
一
l / P O ) 估算出相应于
0
·
1 1 9 ( P I ) 和 0 . 2 1 0 ( P Z ) 偏振值的转动弛豫
时间比 r 一 0 . 38 (其中 P o 是 D N S 的极限偏振
值 , P O~ 0 . 4 ) 。 考虑到亚基解离前后水合体积
的变化 , 以及在 此条件 下还 有 12 %左右的
P C L 的活 力 , 从这 一估算结 果 可 以认为 10
m m ol / L 浓度的 S D S 促使大部分 P C L 四 聚体
解离成亚基 。 P C L 亚基没有凝血活力是不难理
解的 , 因此我们可以认为在此条件下 PC L 的
失活主要是由 P C L 分子解离造成的 。 有意思
的是 , 在 l om m ol / L S D S 存在时用 N BS 修饰
P C L
, 结果发现 , 此时每个 P C L 分子有 7 . 6 个
T rP 残基被修饰 , 结合前面的结果可知 , 在此
条件下原来埋在 P C L 分子内部的 3 个 T rP 残
扮一巨巴旧
印巴口
。,犯`0,国
基也被修饰了 。 由上述 10 m m ol / L S D S 存在时大部分 P C L 分子解离成亚基的结论可以推断 ,
所谓埋在分子 内部的 3 个 T rP 残基 (每个亚基 0 . 75 个 ) 实际上分别位于亚基间结合表面的附
近 区域 , 随着亚基从 P C L 分子上解离下来 , 这些 T rP 残基从 “ 内部 ” 变成位于分子 “ 表面 ” ,
6 7 8
从而 可被 N B S 修饰 。 根据 P C L 的氨基酸组成 , 每个亚基的 int er fac e 区域应有 1 个 T印 残基 ,
实验 只得到 0 . 75 个 , 这很可能是 由于在 10 m m ol / L S D S 条件下 12 %左右未解离的 P C L 分子
内部的 T rP 不能被 N B S 修饰所致 。 顺便应该提及的是 , 在 10 m m ol / L S D S 条件下 , P C L 的荧
光谱 只有 4n m 的红移 , 提示位于亚基内表面的 T rP 残基所处的环境并无大的改变 。
三 、 甲状腺球蛋 白 、 甘露聚糖及海参多糖硫酸醋和 P C L 的结合
将欲研究的蛋白质标记上合适的荧光探针 , 通过测定荧光标 i己物的荧光偏振来研究其它
分子与该蛋 白质分子的相互作用是一个十分成功的技术 。 为了研究甲状腺球蛋白 、 甘露聚糖 、
海参多糖硫酸酷与 P C L 的结合 , 我们观察了 FI T C 一 P C L 和 D N S 一 P C L 在甲状腺球蛋 白 、 甘露
聚糖 、 海参多糖硫酸酷等存在时荧光偏振的变化 , 见 T ab l e l 。 从表中数据可以看到 , 在 甲状
腺球蛋白 、 甘露聚糖和海参多糖硫酸酷存在时 , IF T C一 P C L 和 D N S 一 P C L 的荧光偏振均有不同
程度 的增加 , 说明此条件下的 P C L 的转动弛豫时间增大 , 意味着这些分子与 P C L 分子结合 ,
从而使得 P c L 的总体积增大 。 甲状腺球蛋 白可与 P c L 分子结合的结论与在血凝实验中甲状
腺球蛋白能抑制 P C L 的凝血作用一致 , 提示甲状腺球蛋 白在 P C L 分子上的结合位置很可能
与红血球的是同一位置 ; 或两者的结合位置不是同一个 , 但却相邻近 。 由于 甲状腺球蛋白本
身具有较大的分子量 , 因而占有相当大的空间体积 , 当其与 P C L 结合 , 空间效应使得 P C L 分
子无法接近红血球的结合位置 , 故而抑制了凝血作用 。 甘露聚糖和海参多糖硫酸醋与 P C L 的
结合并不影响 P C L 的凝血作用 , 说明它们在 P C L 分子上的结合位置可能与红血球的不同 , 这
一问题还有待于进一步证实 。 我们还发现 , N 一乙酞半乳糖胺 , N 一乙酞葡萄糖胺以及 a 一 甲基甘
露糖昔对 F’I T C 一 P C L 和 D N S 一P C L 的荧光偏振不发生影响 , 对 P C L 的内源荧光也没有影响 ,
说明它们并未和 P C L 结合 , 这与它们对 P C L 的凝血活力无抑制作用的实验结果相符 。
T a b l e 1 T h e P o l a r i z a t i o n s o f F仃 C 一 P C L a n d D N S 一 P C L
T h y r o g l o b u li n
( 0
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6 m g / m l )
M a n n a
( 1
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7 m g /m l )
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P C L ( 0
.
6 m g / m l ) 0
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2 2 4 0
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1 8 3 0
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1 7 7
D N S
一
P C L ( 0
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3 1 m g / m l ) 0
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四 、 hi s 一 A N S 与 P C L 的相互作用
iF g
.
4 是 ib s 一 A N s 单独存在及与 P c L 共同存在时的荧光发射谱 。 从 图上可以看到 , 有
P C I
, 存在时 , ib s 一 A N S 的荧光最大发射波长由 5 5 0n m 移到 4 9 0n m , 蓝移达 60 n m , 荧光强度增
加近 5 倍 , 表明 ib s 一 A N S 能结合到 P C L 分子上 。 根据 ib s 一 A N S 的荧光特性 8[, 9〕 , 上述现象说
明 P C L 分子存有疏水 区域 , 这一现象在其他凝集素中也多有发现 。 当用仅能激发色氨酸残基
的 2 9 5 n m 波长的光激发 P C L , 观察 b is 一 A N S 对 P C L 中 T r p 荧光的影响时发现 , 随着 b i s 一 A N S
的加入 , P C L 原有的 T rP 在 3 3 0n m 处的荧光强度明显减弱 , 而在 s o on m 处出现 ib s 一 A N S 的特
征荧光峰 , 这说 明 P C L 分子中的 T 印 残基与结合的 ib s 一 A N S 之间发生了能量转移川 。 有意思
的是凝血实验表 明 : ib s 一 A N S 与 P C L 的结合并不影响凝血活力 。 这意味着 ib s 一 A N S 和红血球
与 P C L 分子的结合可能不在同一位置 。
6 7 9
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F 馆. 4 F lu o r e sc e n e e 印e e t r a o f b is 一A N S in t h e p r e se n e e a n d a b se n e e o f P C L
A
:
i n t h e p r e se n e e o f P C L ( 0
.
78 ” m o l/ L ) ;
B
:
in t h e a b se n e e o f P C L ; b is
一
A N S 。 o nc e n t r a t i o n i n A a n d B
: 9
.
6拌m o l/ L .
E x e i t a t i o n w a v e le n g t h
: 3 9 0 n m
参 考 文 献
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nI
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H i r s C
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阮康成 , 等 . 生物化学和生物物理学报 , 1 9 9 2 , 24 : “ 一 69
S ih W X
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P r a s a d A R
, et 以 . B 应丫h翻说砂 , 1 98 6 , 2 5 : 3 5 3 6一 3 5 4 2
阮康成 , 生物物理学报 , 1 9 9 2 , 8 : 5 63 一 5 68
6 8 0
AS t ud yo f P ha s e 耐 s c o c uo n e us va r . R ub ro na n us Lec tni b yFl uo r e s e e n c e S Pe c tr o s c o P y
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A b st r a e t T h e fl u o r e s e e n e e o f P h as
e o l u s c co c l n e u s v ar
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T h e r e s u lt s i n d i e a t e d t h a t o n e o f t h e t w o t r y P t o Ph a n r e s id u e s i n e a e h s u b u n i t w a s 1-0
e a t e d n e a r t h e s u r f a e e o f P C L m o le e u le
, a n d t h e o t h e r on
e w a s i n t h e i n t e r n a l r e g i o n ( a e t u a l ly i n
t h e i n t e r f a e e r e g i o n b e t w e e n t h e s u b u n it s )
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i n d u e e d b y t h e d i s s oc i a t io n o f P C L m o l e e u le
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T h e fl u o er sc e n e e p lo a r i z a t io n s t u d y a ls o i n d i e a t e d
t h a t t h y r o g l o b u li n
,
m a n n a n a n d t r e p a n g p o l y s a e e h a r id e s u lf a t e e o u ld b i n d t o P C L m o le e u l e
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6 8 1