全 文 ：第 2 7卷 第 5期
1 9 9牙年 9月
生物化学与生物物理学报 V l o.2 7, N o . 5
A C T A B工《X IH I M I O A e t B工O P H Y S I OA sI N工OA 氏 tP . , 1 9 9 5
红花菜豆凝集素的糖结合专一性
施炜星 孙 册份
(中国科学院上海生物化学研究所 ,上海 , 20 0 3 1)
摘 要
经阱解 、 B i-o G le P 一2 柱层析 、 N a B 3H ` 和 N a B H ` 还原 , 制备各种来源的 、 氖标记在还原
宋端的、 还原末端为卜乙酞氨基葡萄糖醇的混合寡糖 , 经 iB } G el P性凝胶柱分离 , 以及用塘
昔酶酶解 , 制备了各种不同类型的氖标记的寡糖。 这些寡搪在固定化的 P C L一 e p h汹 se 柱上
亲和层析 ,根据各种类型寡糖在 P O L 一 eS p h a1’ os e 柱上的层析行为 ,确定红花菜豆 (矮生红花变
种 )凝集素 ( P C L )的糖结合专一性为 :
M血 a G l o N A 。。 (V l ) > M扭 。G l e N A 。 。 ( V l l ) = M an s X y lG le y A 。 。 ( I X ) > M扭 : G l o N A o , (V )
= M an
6X y 1G l o N A 。。 F u 。 (V l l l ) > M出 、 G l o N A 。 , (1 1 1 ) = M血 6 e le N A 。 , ( I V ) 。
关键词 红花菜豆 (矮生红花变种 )凝集素 ; 糖结合专一性
细胞表面的糖复合物是细胞各个分化期 , 细胞病变时等不同细胞状态的标志物 , 它们
具有不同的功能 。 这些细胞表面的标志物在许多重要的细胞现象中控制和决定细胞与配
体 , `以及细胞与细胞间的相互作用 。 为了了解这些细胞现象以及在分化 、 病变过程中细胞
表面的特性 , 变化的分子机理 , 阐明这些糖复合物的糖链结构是必不可少的。 然而 , 用常
规方法分离制备足够量的糖复合物 , 用于糖链结构研究是极为困难的 , 再者 , 这些糖复合
物中的糖链部分通常显示微观不均一性 。
凝集素是凝集细胞或沉淀糖复合物的糖结合蛋白, 每一个凝集素分子专一地与寡糖
或糖复合物中的寡糖链结合。 凝集素的糖结合专一性 已被广泛地用于细胞表面的糖链的
定位 , 电泳分离的细胞膜糖复合物的评估和染色 , 免疫细胞亚群的分离 , 固定化凝集素作
为亲和吸 附剂分离细 胞膜糖复合物 , 分级分离结构不同的寡糖和寡糖结构分析等。 因此 ,
对一个新发现的凝集素 , 它的寡糖结合专一性的研究是一个极其重要的方面 。
红花菜豆 (hP a s e o乙二 s 。 o c 。`二 e二 s , v a r
.
, 、 b, o , a二讹 , B e o y 矮生红花变种 ) 凝集 素
(简称 卫O L )的血凝活力只被少数几种糖蛋白抑制山 , 它的若干重要的生物学作用亦与它
的糖结合专一性相关 , 如凝集野生型大肠杆菌和酵母菌 , 并抑制它们的生长。 P O L 与含
高甘露糖的糖蛋白如甲状腺球蛋白 , 在琼脂双扩散反应中能形成沉淀线闭 , 提示它与高甘
露糖型寡糖结合 。 我们用 P O-L eS p h a or 的 亲和柱和各种氛标记的寡糖 , 分析 卫O L 的寡
糖结合专一性 。
本文 1 9p 4年 6月 17 日收到 ,修改稿同年 8月 30 日收到。
. 本文联系人。
5 l 6生物 化 学 与 生物物 理 学 报 27 卷
材 料 和 方 法
一 、 材料
转铁蛋白、 胎球蛋白、 去唾液酸胎球蛋白 , “ 一甘露糖昔酶 、 , 岩藻糖普酶 、 庄木糖普
酶 、户半乳糖昔酶 、 月一 N一乙酞氨基葡萄糖昔酶均为 iS g m a 公司产品 , 猪甲状腺球蛋白为
上海生物化学研究所东风试剂公司产品 ; iB 。一el P se Z , B i。一G el r 一 凝胶为 iB o 一 R a d 公
司 产品 ; D o w e x 5 0( H +) 为 氏竹a 公司产品 ; 麦芽糖 、 乙睛为 B . D . H . 公司产品 ; 硼氢化
钠为 A l d对 c h 公司产品 ; 氮标记的硼氢化钠为 A m er 血 a m 公司产品; 水合阱为上海向阳
化工厂产品 ; 甘露聚糖按 E d w ar ds 方法 、 利马豆凝集素按 G al b ia 么h 方法由本实验室制
备 ; 其它试剂均为国产分析纯 。 试剂均用重蒸馏水配制。
二 、 方法
1
. 寡糖的制备 人 s n 一连接的寡糖采用顾新等闭 方法制 备 , 得到的 寡糖 经 B i卜
G e 1P性 柱分离 。
(1) 麟解反应 : 无水阱的制备闭 , 所得无水麟在 40 0 暗处千燥保存。 糖蛋白的麟解
反应 : 取 50 m g 糖蛋白与 3 m l 无水麟 , 在有聚四氟 乙烯盖的螺 口试管中于 10 ℃ 反应 10
小时 。 按顾新等 cs3 方法处理 。 得到不含氨基酸的还原末端为 N 一乙酞氨基葡萄糖醇的混
合的寡糖产物 。
( 2 ) 葡聚糖水解产物标定 B i o刁 e l -P 4 柱 r们 : 葡聚糖 (D e x 七ar n ) 经 0 . l m o l / L H 0 1
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于 1 0 0 0 水解后冷冻千燥。 用 1 0 m l 重蒸
水 溶解 , 加入 l m g 葡 萄糖 , 取 l m l 上
B i o
一
G e I P性 柱 ( 150 em X 1 . s om ) , 部分收
集器收集 , 每管 Z m l , 用硫酸一苯酚法检测 ,
作出相应的寡聚葡萄糖的层析图谱 (图 1 )。
(3 ) 寡糖的分离 : 麟解得到的寡糖加
至经水解葡聚糖标定 的 B i-o G le P 4 柱 ,
2 5℃ 恒温层析 , 每管收集 2 m l , 苯酚一硫酸
法测糖。 将获得的各峰与葡聚糖内标记图
谱比较 , 确定各个寡糖的大小 (相当的葡萄
糖基数 ) 。
(4) 寡糖的分析: 各个寡糖经甲醇解
反应 , 制成三甲基硅醚衍生物51E , 用 Ov-
10 1 毛细管柱 , 在岛津 M i in 3 气相色谱仪
上分析各寡糖的糖组成。 根据糖组成及寡糖在 已用寡聚葡萄糖标定的 B i。一 Ge1 P一 柱的
出峰位置 , 并对照文献报道的寡糖结构 , 确定各个寡糖的大小、 组成和结构。 各寡糖的结
构及来源列于表 o1
(句 a[ H ]寡糖的制备 : 拼解获得的寡糖 ( 0 . 5~ 1 . o m m ol ) 按 T a ka 脸 ik 和 K ob a恤
的方澎们 , 用公 a护 H . ( l m o i) 还原 , 寡糖还原的同时 , 末端的 N 一乙酞氨基葡萄糖醇被 . a
5期 红花菜豆凝集素的糖结合专一性 6炸
T ab l o 18 毛 r u et u拍 n ad o o ur e e s of 让 e. H. ol i g o出从” h面 d e
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生物 化 学 与 生 物物理学 报 佗7 卷
(续表)
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R i ~ 公 l e N A 厂月土冲 4口 I c N A句且
标记 。
(6 ) 糖昔酶水解寡糖 : 取 0 . 2 ” m o l [3 H」寡糖加至 o . s m l 含糖昔酶 ( 1 ~ 2 单位 )适
当浓度和 p R 的 乙酸 钠缓 冲 液 中 , 于 2 o5 C 温育 2 4 小 时 (月一木糖 昔酶 , 动 m m ol / L,
p H 6
.
0 ; -a 甘露糖甘酶 、 月一半乳糖昔酶、庄 N一乙酞己糖昔酶 , 10 0 m m ol / L , p H 4 . 0 ; , 岩藻
糖昔酶 , 1 0 0二m o l / L , PH 4 . 5 )
2
.
P C -L S
e p h a or s
e 柱 的 制 备 经 O N B r 活 化 的 S e Ph a r o o e 4 B I Om l 加至含
2 0 0 m g 纯化的 P O L 和 M a n ( 0 . 5 m o l / L ) 的 1 0 m l 0 . 1 m o l / L N a H C O a一 a : OOa 缓 冲液
中 , p H g . 0 , 立即搅拌均匀 , 并于 o4 C 搅拌 8 小时 , 过滤 , 用 同样缓冲液洗涤。 将偶联了
卫O L 的 eS p h ar os 。 悬浮于相同的碳酸钠缓冲液 , 加入 乙醇胺 (终浓度为 0 . 2 m ol / L ) , 室温
搅拌 2 小时 , 封闭未连接蛋 白质的活化基 团。 按下列公式计算 , 卫O L 的交联率为 26 界。
交联率一 交联前 P O L 的总 A朋 on m一 未交联的 P O L 的总 A朋 0u 。
3
. 寡糖结合试验
交联前 r O L 的总 人 28 0 nm
将 1 0 0 灿 1 [S H ]标记的寡糖 ( 5 x 1 0 3 o p m , 50 nm o l )
, 加至已用
o
.
01 m ol /L T ir
s 一H CI 预平衡的 P O-L eS p ha or 阳 柱 (8 . o m m x 2 0 m m , 1 . 0 m l) 层析 , 用
功 m l 相同的缓冲液洗脱。 结合在柱 .上的寡精 , 用溶解于同样缓 冲液的甘露聚糖 (q份
5期 红花菜豆凝集素的糖结合专一性
2 0 m g /耐 )浓度梯度洗脱 , 流速为 0 . 1 m l/ m in , 部分收集器分管收集 , 每管 0 . s iln , 测定
每管溶液的放射性 , 从洗脱体积获得各寡糖与 P O L 结合的相对活力。
结 果
各寡糖与固定化的 P O L 一 eS p五aI % 。 亲和柱的结合大致 有三 类 : ( 1) 从柱上 流出 ;
(2) 滞留于柱上可被缓冲液洗脱 , ( 3) 结合于柱上被不 同浓度的甘露聚糖洗脱 。从甲状腺球
蛋白和 P O L 制备的高甘露糖型寡糖 ( 1 1 1 , I V , V , V l , V l l 和 V l l l , IX ) 均和 r 0 L -
S e p h a or 阳 柱亲和结合 , 并可用甘露聚糖溶液洗脱 , 但所需的甘露聚糖浓度不同 。 可从甘
露聚糖浓度梯度曲线求得洗脱各寡糖所需的甘露聚糖浓度 。 由此得出它 们 与 P O L 结合
的相对活性。 利马豆凝集素寡糖 ( X )可滞留于柱上 , 被缓冲液洗脱 , 表明利马豆凝集素的
寡糖与 P O L 亲和柱有微弱结合。 从胎球蛋白制备的三天线和从人血清转铁 蛋 白制备的
二天线的复杂型寡糖 ( I 和 工)I , 以及寡糖 1 顺次经 月一半乳糖昔酶 , 尽- N 一乙酞氨基葡萄
糖昔酶水解的产物 (寡糖 X l) , 利马豆凝集素的寡糖 X 的木糖昔酶酶解产物 (寡糖 X工)I ,
寡糖 V工1 的 “ 一甘露糖昔酶酶解产物 (寡糖 X 工V )寡糖 X I V 的月一木糖昔酶酶解 产物 (寡
糖 X V )和寡糖 工X 的 “ 一甘露糖昔酶酶解产物 (寡糖 x VI )均短暂滞留于柱上 , 及易被缓
冲液洗脱 。 寡糖 X l 的 。 甘露糖昔酶水解产物 (寡糖 X l工)I 从柱上流出 。 短暂滞留于柱
上和从柱上流出的这 两类寡糖都与 P O L一 eS p h ar os 。 柱不结合 (表 2 , 图 2 ) 。 从以上结果
确定红花菜豆 (矮生红花变种 )凝集素 ( P O )L 的糖结合专一性为 :
M a n 8 G l e N A e
Z
( V l ) > M
a n oG l e N A 。 , ( V l l ) =
M a n sX y l G l e N A e : ( I x ) > M
a n 7 G l e N A e
Z
(V ) ~
M a n 6 X y l G l e N A e
Z
F u e ( V l l l ) > M
a n oG l e V A o : ( 1 1 1 ) ~
M a n 6G l c N A e Z ( I V )
。
T a bl e 2 O li g o s a e e il a瓦 d e s b in di n g w i th P C L一 e p h a or s e ol u皿
o l ig o s a倪h a r i d e s B j n汪i n g 块ha v lo u r
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,
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,
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,
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,
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口 O生 物 化学 与生物物 理学 报 27 卷
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讨 论
测定凝集素寡糖结合专一性的方法有多种 , 如寡糖或糖肤作为半抗原抑制剂 , 抑制凝
集素的血凝活力或抑制同位素标记的凝集素与细胞的结合。 也可 以用同位素标记的寡糖
与凝集素直接结合 , 从它们的结合常数比较结合能力。 用固定化凝集素也可阐明凝集素
的糖结合专一性。 对 C o n A 糖结合专一性的测定 , 最先是用单糖和糖肤作为半抗原抑制
剂进行测定的。 O g a 俪 等首次用 “ H一标记的寡糖和糖肤与 o o n A 一 a g a or se 结合 , 比较其
在柱上滞留的时间 , 由此确定与 O o n A 亲和柱的结合性质 〔切 。 B ae n : i g er 等建立了定量
的方法。匀 , 用 哪-I 标记的糖从与 o o n A 作用 , 根据结合和不结合糖肤的比例作图 , 计算
糖肤与 o o n A 的结合常数 , 对比糖肤在 C o n A一 g ar os e 柱上滞留时间和糖肤与 C o n A 的
结合常数 , 得出结合常数在 4 . 5 x l 护 /m ol ~ 2 5 x l 护 / m ol 的糖肤能在 o o n A 一 a ga or se 柱
上滞留 , 而结合常数在 o . 3 x l 沪 / m ol 、 4 . 0 x 1 0“ / m ol 的糖肤 不 与 O o n A 柱 结合 。 用
凝集素亲和层析测定凝集素结合寡糖的专一性是比较有效的方法。 利用曼陀罗凝集素亲
和层析 , 在寡糖的棍合物中 , 可区别即使只有一个糖基位置的差别的 -N 连接的各种不同
的寡糖以幻 。 我们用 P O-L 6S Ph a or 加 亲和往测定了 P O L 的糖结合专一性 , 并改进了糖溶
掖的洗脱方法 , 采用糖溶液浓度梯度洗脱 , 能区别仅一个糖基之差的寡糖与 P C L 结合活
性的差别。 结果表明 , 含甘露糖基数小于 5 个的寡糖不与 P O L 亲和柱结合。 利马豆凝集
素寡糖含有 4 个甘露糖基 , 但在户甘露糖基上结合了一个木糖基 , 可能由于寡糖的大小
或空间结构与 6个甘露糖基的寡搪较为接近 , 因此能滞留于柱上 , 与 P O L 弱结合。 寡精
V l 是含有 8 个甘露糖基的高甘露糖型寡糖 , 与 P O-L eS p h a or se 的结合最强 , 拐 m留心
6期 红花菜豆凝集素的糖结合专一性
的甘露聚糖才能将它从柱上解离下来 , 但在这一寡糖的户M a 。 上连接一个木糖基 (寡塘
I X )
, 结合活性有所下降; 而寡糖 V 与寡糖 V 工1 虽然它们所含的甘露糖基数不同 , 寡糖
V l l工比寡糖 V 多一个核心 万恤 e 和一个核心 X yl , 但它们与 P O L 的结合相同 , 由此推测
卫O L 与寡塘的结合 , 还可能与 P O L 的糖结合部位的大小以及寡糖的糖基数和寡糖的构
象也有关 , 因此 , 对 P O L 结合糖的部位的研究亦是重要的 , 我们也将对此进行探讨 。
其他植物凝集素中也发现具有结合高甘露糖型寡糖的凝集素 , C o n A 与高甘露糖型
寡糖结合并与 O e Z 上取代的甘露糖基的寡糖 , 即二天线的寡糖弱结合 ; 而二天线的寡糖不
与卫O L 结合 , 显然 P C L 的糖结合性质 与 C 。 。 A 不完全相同。 核心 F u o 不是与 卫O L 结
合所必需的 , 说明 P C L 与 P S L , L C A 和 V F L 结合寡糖的性质亦是各异的。
华东理工大学在本组实习的 93 届毕业生陆军芬参加寡糖的制备 , 特此致谢。
参 考 文 献
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r e五a i” o n t a i n i n g t h e 阮 1月l o 3 G l eN A e s e q u e n印 . B勿口he 仍括 `叼 , 1 9 8 6, 幼: 5了0 9 .
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h u m a n s e r o t r a n 昌f e r r i n . 刀 E B名 L e艺艺. , 1 9 7 5 , 苏0 : 2 96 .
[ 9 〕 T s u j i , T . 时 a 乙. , S t r u e t u r e o f e 二 r b o h y d 二 a t e 皿 i t A o f P o r以 。 e t h y I 0 g l o b u l i n . B幻 e加仍 . J . , 1 9 8 1 , 1 9 5 :
6 9 1
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l[ 叼 M isa k i , A a n d G o l且s t e i n , 1 . J . , G l y c o s y l o c i o t y o f t h e il m a 加 a n l e e t i n . J . B勿孟. G加仍 · , 1 9 7 7 , 舫 2二 6 9 9 5 -
【1 1〕 施炜星 、孙 册 : 红花菜豆凝集素与其寡糖部分分子间的聚合。 生物化学与生物物理学报 , 1 ” 4, 城 5 6 .5
[1幻 o g a t 、 , 5 . 时 a Z. , F r3 c t j o n a 七io n o f g l y e o 环p t i d e s by a if n i ty co lu m n O b加m a t og ar Ph y o n . 心 n a va il .人一eS Ph a r o , . J . B幻 e he 哪 . ( T o k y o ) , 1 9 7 5 , 7 8 : 6 8 7 .
p 3〕 B a e n z i g e r , J . U . a n d F i e et , D . , S t ru e t u r a l d e t e r m i an t io 二 o f 即 n傀n a v a l in A s eP o i五d ty of r o il g o a-
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B 幻乙. 0加仍 . , 1 9 7 9 , 2 54 : 2 4 00 .
【不习 K o加at , 人 , : n d E n d o , T . , I m四 b i l i z e d l o e t in co l u m ns 即吐 u l t o o l f o x `加 f 工a心七主o an 桩 o n a血 s t 了“ Qt 盯公
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即2 生 物 化 学 与 生物 物理学 报2 7卷
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r e d u e七so n . B y P a s s i n g i七么hr o u g h a B i o心 e l 卫一 e o l u m n 士0 s e P a ar 七e 七he m i x e d
0 119 0 : a e e h a r i d e o a n d 七h e h y dor l y o i o w i t h g l y o o s id a s e日 , v a r i o u 。 [ 3 H ] l a b e l e d
o l sg o s a e e h a r i d e o h a v e b e e n o b七a i n e d . T h e e a r b o h y d ar 七e b i n d i n g 。钾 e i if e i七y o f
S c a r l e七 ur n n e r b e a n (hP as
e o Z二 5 c o o 。落二 e二 5 v a r . : 二 b: o n a 二。 s ) l e e t i n ( P O L ) w a 。
d e t e r m i n e d b y e h r o m a 七o g r a P h y o f 出h e o e [ SH ] o l i g o s a e o h a r i d e s o n a P O L 一S e P h a or s e
a if n i么y e o l u m n . A e e o r d i n g 幻 毛h e i r b e h a v i o u r o n 七h i s o o l u m n 七h e o a r b o h y d r a 加
b i n d i n g s P e c i if c i七y o f P O L 15 :
M a n s G l e N A e : > M a n o G l e N A e , ~ M a n s X y 1G ION A
o : ) M a n : G l e N A灿 ~
M a 玛 X y 1G l o N A e , F u e ) M a n 。 G l e N A 。 : ~ M a n a G l e N A伪 .
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习叮O R D S : S e a r l e七 ur n n e r b e a n (hP a s o o不二: 0 0 0 0落、 。 5 va r . , 、 b: o n 。 二二 s )
o a r ob h y dar 七e b i n d i二 g 吕P e e i if e i勺