全 文 ：武汉植物学研究 2002, 20( 2) : 137～140
Journal of Wuhan Botanical Research
坛紫菜凝集素的糖结合专一性和细胞凝集作用
郑 怡1 余 萍2 刘艳如1 江红霞1
( 1.福建师范大学生物工程学院, 福州 350007; 2.福建师范大学高分子研究所; 福州 350007)
摘 要: 坛紫菜的磷酸盐缓冲液浸取液,经硫酸铵沉淀和 DEAE-Sephar ose、SephadexG-100 二步层析纯化, 获得纯
化的坛紫菜凝集素( PHL )。该凝集素能与 3 种单糖(阿拉伯糖、半乳糖、木糖)及麦芽糖专一性结合, 其中与麦芽糖
结合最强。细胞凝集实验结果显示, PHL 能凝集兔、绵羊及鸡红细胞而不能凝集鸭、鸽子及人血红细胞; PHL 还能
凝集海洋微藻——绿色巴夫藻和淡水微藻——蛋白核小球藻, 它们的凝集活性与藻细胞密度有关。不同状态的细
菌和酵母细胞对 PHL 反应不同,表明随着细胞状态的改变,细胞表面的凝集素受体也随之发生变化。
关键词: 坛紫菜凝集素; 糖结合专一性; 细胞凝集作用
中图分类号: Q946 文献标识码: A 文章编号: 1000-470X ( 2002) 02-0137-04
Specif icity of Sugar-binding and Cell Agglutination of
Porphyra haitanensis Lectin
ZHENG Yi1 , YU Ping2 , L IU Yan-Ru1 , JIANG Hong-Xia1
( 1. Bioeng ineering Col le ge, Fuj ian Teachers Univ er si ty, Fuzhou 350007, China;
2. Insti tut e of P olymer S cienc es, Fuj ian T eachers Univ ersity, Fuzhou 350007, Chin a)
Abstract: The ex tr act ion of the thallus of Porp hy ra haitanensi s by phosphate buffer w as precipi-
tated w ith ( MH4 ) 2SO 4 , purif ied fur ther by DEAE-Sephar ose column and Sephadex G-100
co lumn. T he purified lect in ( PHL) could bind mono sacchar ides ( Ara, Gal and Xy l) and maltose
to w hich PHL had the st rongest binding. In cell agg lut inat ions, PHL agg lut inated erythrocytes
fr om rabbit , sheep and chicken, but not f rom duck, pigeon and human A , B or O blood cell
groups. Furthermo re, PHL agg lut inated mar ine micro alga, Pavlova v iridis, and f resh m icro alg a,
Chlorella py renoidosa. These agglutinat ions w ere related to algal cell density. The r esult that
Bacillus subt ilis and Sacchar omycs cerev isiae in dif ferent condit ions responsed to PHL dif fer ent ly
indicated that lect in receptor s on cell changed in differ ent conditions.
Key words : Porphy ra haitanensis lect in; Sugar-binding specif icity ; Cell agglut inat ion
凝集素作为生物学和医学研究的有用工具一直
被人们广泛而深入地研究。与高等植物凝集素相比,
藻类凝集素的研究较少而且起步晚[ 1]。在藻类中,主
要是对海藻凝集素的研究, 研究结果表明, 它们在纯
化方法、理化性质及生物学活性等方面与陆生植物
凝集素有所不同, 具有独特性[ 2]。糖结合专一性和细
胞凝集作用是凝集素最基本、最重要的性质和生物
学功能。由于凝集素能够特异性地凝集不同类型的
细胞,识别并结合某些糖类,使其在分离细胞和糖蛋
白、研究细胞表面特性、临床诊断及血型鉴定等方面
具有实际应用价值[ 3]。
紫菜是世界上广泛养殖的主要海藻之一,不仅营
养丰富,而且具有药用功能。到目前为止,紫菜凝集素
的研究尚未见报道[ 4]。本文报道了从坛紫菜中分离纯
收稿日期: 2001-08-31,修回日期: 2001-11-27。
基金项目:福建省自然科学基金资助项目( B0110009)。
作者简介:郑怡( 1959- ) ,男,副教授,主要从事藻类学研究。
化的凝集素的糖结合专一性和细胞凝集作用。
1 材料与方法
1. 1样品来源和凝集素的提取纯化
紫菜干品购于福建平潭水产品批发市场,经鉴
定为坛紫菜 Porphyr a haitanensis Chang et Zheng,
样品经蒸馏水洗净后剪碎, 放入高速组织捣碎机内,
加少量磷酸盐缓冲液( PBS)捣碎成匀浆,在 4℃冰箱
内放置一夜后, 过滤, 收集的滤液经 5 000 r/ m in,
4℃离心 30 min,去掉沉淀,收集上清液, 加入固体
硫酸铵达 75%饱和度,经离心(同前)收集沉淀物,
加入 PBS溶解, 透析除盐,经凝血活性检测, 得到凝
集素粗品。粗品经 DEAE-Sepharo se离子交换层析
和 SephadexG-100分子筛层析进行纯化, 得到纯化
的坛紫菜凝集素( PHL)。蛋白质浓度测定采用 CBB-
G250法( PHL 的纯化条件、性质等另文发表)。
1. 2 糖抑制实验
先将凝集素样品( 25 L )在V 型血凝板上作倍
比稀释,后往每孔中加入 80 mmol / L 的实验用糖液
(生理盐水配制) 25 L, 摇匀后,再往各孔加入25 L
2%兔血球悬液,摇匀, 放置 1 h后,镜检结果。
1. 3 细胞凝集实验
1. 3. 1 红细胞凝集实验 血样由静脉抽血,兔子购
自福建省药品检验所, 鸡、鸭、鸽购自农贸市场, 绵羊
血取自南京军区福州总医院;人血由本校医院提供。
各种血样离心( 2 000 r/ min, 10 min)收集红细胞,加
10倍量的生理盐水离心洗涤 2遍,最后以生理盐水
配 2%压积的红细胞悬液。凝血活性测定在 V型血
凝板上进行,凝集素倍比稀释后,于每孔中加入红细
胞悬液 25 L, 1 h后镜检结果。
1. 3. 2 微藻凝集实验 试验用的海洋和淡水微藻
分别引自中国科学院海洋研究所、水生生物研究所
和武汉植物研究所。藻种采用相应的培养基培养[ 5] ,
温度 25～30℃, 光强 3 000 lx , 光暗周期 12 h∶
12 h, 取指数生长期的微藻培养物 10 mL, 离心
( 5 000 r / min, 10 min)收集微藻细胞,海产种类加
消毒海水, 淡水种类加生理盐水, 离心洗涤 2遍, 最
后以生理盐水制成藻细胞悬液并计数, 按上述凝血
测定方法测定凝集藻细胞活性, 1 h后镜检结果。
1. 3. 3 细菌和酵母凝集实验 3种微生物菌种系
本院保藏的典型实验菌株。采用牛肉膏蛋白胨培养
基经继代培养活化,以生理盐水配制成相应的活菌
悬液,另取部分菌悬液经 80℃热处理1 h 后, 再配成
菌悬液,分别测定凝集活性(测定方法同上) , 1 h 后
镜检结果。
2 实验结果
2. 1 坛紫菜凝集素( PHL)的糖结合专一性
实验结果见表 1, 在 12 种实验的糖类中, 阿拉
伯糖 ( Ara )、半乳糖 ( Gal )、木糖 ( Xyl ) 及麦芽糖
( Mal )对 PHL 的凝血活性具有抑制作用,表明 PHL
能够专一结合这些糖类, 其中麦芽糖的抑制作用最
大(凝集素的最大浓度达 50 g/ mL) , 因此它与
PHL 的结合最强。
表 1 坛紫菜凝集素的糖抑制作用
Table 1 Inhibition of ag g lutination of Porphy ra haitanensis lectin by sugar s
糖类 Sugars ( 80 mol/ mL )
凝集素浓度 Lectin concentr ation(g/ mL )
400 200 100 50 25 12. 5 6. 25 3. 13
阿拉伯糖 Ara + + + + + - - -
果糖 Fru + + + + + + - -
岩藻糖 Fuc + + + + + + - -
半乳糖 Gal + + + + + - - -
葡萄糖 Glc + + + + + + - -
麦芽糖 Mal + + + - - - - -
甘露糖 Man + + + + + + - -
山梨糖 Sor + + + + + + - -
木糖 Xyl + + + + + - - -
N-乙酰葡萄糖胺 GlcNAc + + + + + + - -
-甲基葡萄糖苷 -MeGlc + + + + + + - -
-甲基甘露糖苷 -MeMan + + + + + + - -
对照 Contro l + + + + + + - -
注: + 凝集; - 不凝集。
Notes: + Po sitiv e agg lutination; - Negative agglutination.
138 武 汉 植 物 学 研 究 第 20 卷
2. 2 坛紫菜凝集素的细胞凝集作用
2. 2. 1 红细胞凝集作用 表 2结果表明, 坛紫菜凝
集素( PHL)能凝集兔、绵羊和鸡血红细胞,其中最敏
感的绵羊红细胞, PHL 只需 6. 25 g / mL 即可发生
凝集现象。PHL 在最高浓度 400 g/ mL 以下,均不
能凝集鸭、鸽子红细胞及人的 A 型、B 型或 O 型血
红细胞。
表 2 坛紫菜凝集素对不同红细胞的凝集作用
Table 2 Agg lut ination o f var ious er yt hro cy tes by Porp hy ra haitanens is lectin
项目
I tem
动物红细胞 Animal ery thro cyte
兔 Rabbit 绵羊 Sheep 鸡 Chicken 鸭 Duck 鸽 P iggen
人红细胞 Human blood cell
A O B
凝集素浓度* ( g / mL )
Lectin concentr ation
12. 5 6. 25 100 - - - - -
* 引起凝集的最低浓度; - 不凝集。
* M inimum concentr ation causing agg lut ination; - Negat ive agg lutination.
2. 2. 2 微藻细胞的凝集作用 表 3结果表明, 在试
验的 6种微藻中, PHL 能够引起绿色巴夫藻 Pavlo-
va virid is 和蛋白核小球藻 Chlor ella p yr enoidosa凝
集,所需的 PHL 最低浓度分别为 25 g/ mL 和 100
g/ mL,前者(海产种类)比后者敏感。PHL 对其它4
种微藻不产生凝集作用。2种微藻的凝集作用与藻
细胞密度有关, 当绿色巴夫藻细胞密度少于 97. 9×
104个/ mL, 蛋白核小球细胞密度少于 57. 8×
104个/ mL时, PHL 对 2种微藻不能产生凝集作用。
2. 2. 3 细菌和酵母细胞的凝集作用 实验结果见
表 4, PHL 在浓度为 100 g/ mL 时, 只能凝集经高
温处理后的枯草杆菌和酿酒酵母细胞, 而不能凝集
它们的正常细胞; PHL 对正常的和经高温处理的大
肠杆菌均无凝集作用。
表 3 坛紫菜凝集素对微藻的凝集作用
T able 3 Agg lutination o f mir oalgae by Porphy ra haitanensis lectin
藻 种
Algal species
细 胞 密 度
Cell density (×104 cell/ mL ) 凝集素浓度
*
Lectin concentr ation (g/ mL )
金藻门 Chrysophy ta
球等鞭金藻△ I sochry sis galbana 230. 5 -
绿色巴夫藻△ Pav lova viridis 195. 8 12. 5
绿藻门 Chlor ophyt a
蛋白核小球藻 Chlor ella p y renoidosa 115. 6 100
盐生杜氏藻△ Dunaliella salina 63. 4
雨生红球藻 H aemetococcus p luv ialis 18. 6 -
亚心形扁藻△ Platymonas subcordif ormis 21. 3 -
△ 海产藻类; * 最低浓度; - 不凝集。
△ Mar ine species; * M inim um concentr ation; - Negat ive agg lutinat ion.
表 4 坛紫菜凝集素对细菌和酵母的凝集作用
T able 4 Agg lutination of bacter ia and yeast by P orphy ra haitanensis lectin
项目
I tem
大肠杆菌
E scherichia coli
N T
枯草杆菌
Bacillus subtilis
N T
酿酒酵母
S accharomyces cer evisiae
N T
凝集素浓度( g / mL )
Lectin concentrat ion
- - - 100 - 100
注: N . 未经处理; T .经加热; - 不凝集。
Notes: N . Not t reated; T . T reat ed by heating; - Negative agglutination.
139 第 2 期 郑 怡等: 坛紫菜凝集素的糖结合专一性和细胞凝集作用
3 讨论
大多数凝集素是一类糖蛋白, 每个分子至少有
一个结合糖的部位, 它们之间的相互作用类似于抗
原-抗体反应。凝集素的糖结合专一性通常用半抗原
抑制试验测定,坛紫菜凝集素的糖抑制实验结果表
明,该凝集素可专一性结合 4种糖类( 3种为单糖, 1
种为双糖)。有关海藻凝集素的糖结合专一性, 从目
前已经分离纯化的近 40种海藻凝集素的研究结果
来看,它们中大多数与陆生植物凝集素不同,不能专
一性结合单糖且分子量较低( 15～29 kD) , 只有少
数海藻凝集素可与单糖或其衍生物结合[ 6] ,但它们
的分子量在 60 kD以上。据我们测定, PHL 的分子
量为 30. 1 kD(另文发表) ,以上结果提示海藻凝集
素是否与单糖结合可能与其分子量有关。
凝集素的分类可根据其糖结合专一性[ 3] ,本实
验中的 PHL 可与 Gal(半乳糖)结合, 因此属于 Gal
类凝集素。Rogers [ 7, 8]分别从 P tilota p lumose 和 P.
serra中分离纯化的凝集素也可结合 Gal, 与PHL 同
属一类凝集素。值得注意的是这些海藻都是属于红
藻门的种类。
凝集素能够凝集各种类型的细胞,其中研究最
早和最多的是人和动物血的红细胞,并且发现它们
与供血动物的种属有关[ 9, 10] ,对植物细胞和细菌的
凝集作用则研究得很少[ 2] ,对藻类细胞的凝集作用
只有 Hori等 [ 11]报道了植物凝集素对海洋微藻的凝
集作用。在本实验中, PHL 不仅可凝集海洋微藻
——绿色巴夫藻,还可凝集淡水微藻——蛋白核小
球藻。然而凝集素引起的细胞凝集是一个比较复杂
的过程,与多种因素有关, 如凝集素的性质、细胞类
型及细胞表面特征等[ 2]。本实验中, PHL 只能凝集
经热处理的细菌或酵母细胞, 而不能凝集正常状态
的细胞,提示了细胞状态的改变,其表面凝集素受体
也随之发生变化。
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