全 文 ：应用EST-PCR技术鉴定裸燕麦远缘杂交新品系
200242
葛军勇1，田长叶2，乔月静1，曾昭海1，王俊英3，胡跃高1*
（1.中国农业大学农学与生物技术学院，北京 100193；2.张家口市农业科学院，张家口 075000；
3.中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081）
摘 要：为创新种质资源，将野燕麦草（普通野燕麦，Avena fatua L.，P1）作为父本与冀张莜4号（P2）进行
种间远缘杂交，选育出第一代远杂品系9641-6(f1)；继续将 f1作为父本与坝莜9号杂交（P3），选育出三
个200242系列苗头品系（f21，f22，f23）。以NCBI数据库中搜索到的野燕麦EST序列设计引物，提取幼
苗DNA，进行聚合酶链式反应（PCR）扩增，对PCR产物进行电泳试验并通过NTSYS2.10e计算相似性系
数、建立聚类图。对远交杂种的真实性和远缘杂交技术的可行性进行鉴定，结果表明：（1）父系遗传特
征明显：有3条引物（AF7、AF8、AF10）同时在 f1和 f2中检测到5条P1特征带；其中AF8在 f2中检测出2
条 f1没有的P1特征带。由此可以肯定 f1和 f2是野燕麦后代，引物AF7、AF8、AF10可作为鉴定普通野
燕麦后代的特异引物。（2）12对有效引物共扩增出177条带，其中135条为多态性带，占76.3%。相似性
分析结果：P1和P2：0.4565，P1和P3：0.4347，P2和P3：0.6739，f1和P1：0.5000，f1和P2：0.6522，证明野
燕麦P1与栽培燕麦P2、P3亲缘关系较远，f1是P1和P2远缘杂交的后代。f2与 f1、P3均得出类似结论。
（3）f21和 f1、P1分别是 0.8043、0.4782，f22和 f1、P1分别是 0.5435、0.6087，f23和 f1、P1分别是 0.7174、
0.5217，说明后代基因重组与分离较广泛，引入野燕麦基因是一条多性状改良途径，远缘杂交技术获得
成功。
关键词：普通野燕麦；EST-PCR；远缘杂交；父系遗传
中图分类号：S512.6 文献标识码：A 文章编号：1001-7119（2015）05-0086-06
Interspecific Hybrid Identification of Avena fatua L. × Avena nuda L. Based on
EST-PCR Markers
Ge Junyong1，Tian Changye2，Qiao Yuejing1，Zeng Zhaohai1，Wang Junying3，Hu Yuegao1*
（1.College of Agronomy and Biotechnology，China Agricultural University，Beijing 100193，China；2.Zhang jiakou
Academy of Agricultural Sciences，Zhangjiakou 075000，China；3.Biotechnology Research Institute，Chinese
Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）
Abstract：To breed new germplasm resources, made intersoecific distant hybridyzation between wild oat
(Avena fatua L., as male,P1) and naked oat (P2) ,then the f1 was used as male crossed by another naked
oat variety(P3),3 f2(f21,f22,f23) were selected as emerging varieties.In order to obtain the evidence of
hybrid, put the EST-PCR molecular markers in use. The main results show that : (1) Obvious paternal
genetic characteristics: There are three primers (AF7, AF8, AF10) simultaneously detected five P1
features bands in f1 and f2 and AF8 detected two only in f2 but no in f1 which affirmed f1 and f2 are
收稿日期：2014-04-14
基金项目：国家现代农业产业技术体系燕麦荞麦体系（CARS-08-B-1,CARS-08-A-5）。
作者简介：葛军勇，博士研究生。E-mail:gejy207@163.com。
*通讯作者：胡跃高，教授，博士生导师，主要从事农作制度研究。E-mail:lionman127@163.com。
第31卷第5期
2015年5月
科 技 通 报
BULLETIN OF SCIENCE AND TECHNOLOGY
Vol.31 No.5
May 2015
DOI:10.13774/j.cnki.kjtb.2015.05.019
第5期
descendants of wild oats , primers AF7, AF8, AF10 can be used as specific primers to identify common
wild oat offspring. (2) 12 effective primers amplified 177 bands , in which 135 were polymorphic ,
accounting for 76.3%. Similarity analysis : P1 and P2: 0.4565, P1 and P3: 0.4347, P2 and P3: 0.6739, f1
and P1: 0.5000, f1 and P2: 0.6522, declared that wild oat and cultivated oats were distantly related , f1
was the distant hybridization offspring of P1&P2. The same as f2 and f1, P3. (3) f21 and f1, P1 were
0.8043, 0.4782;f22 and f1, P1 were 0.5435,0.6087,;f23 and f1, P1 were 0.7174,0.5217 : indicating that
the offspring had wide genetic recombination and separation. The import of wild oat genes was
multicharacter breeding approaches, distant hybridization technique proved successful.
Keywords：Avena fatua L.；EST-PCR；distant hybridization；paternal inheritance
燕麦隶属于禾本科（Gramineae），早熟禾亚科
（Pooideae），燕麦族（Aveneae），燕麦属（Avena L.），
约有27个分类种，其中栽培种5个，野生种22个，
按籽粒带稃与否分为皮燕麦和裸燕麦两种类型[1]。
当今世界上主要种植的普通栽培燕麦(A.sativa L.)
属于皮燕麦，而我国主要种植的是大粒裸燕麦(A.
nuda L.)。普通野燕麦(A.fatua L.)属于野生种中的
皮燕麦，是以田间有害杂草形式广泛分布在世界
各地，根系发达，分蘖力强，具有极好的抗逆和抗
病虫性。当前我国的裸燕麦品种经过长期的栽
培种内人工选择，产量有所提高，但出现了抗逆
性降低、易倒伏等一系列问题，对燕麦在近年来
多变气候下的高产稳产构成极大威胁，亟需引入
抗性强的外部基因以获取新种质。河北省高寒
作物研究所燕麦育种专家田长叶于 1996年将普
通野燕麦（Avena fatua L.）作为父本与高产品种冀
张莜4号杂交，克服花期不遇、杂交不亲和等障碍
选育出9641-6品系。鉴定发现该品系熟相、产量
和抗性均明显优于母本，一般配合力高，但籽粒
带皮率过高（达50%，远高于0%~2%的品种标准）
且品质较母本下降。因此，田长叶等人于2002年
将 9641-6作为父本与优质裸燕麦品种坝莜 9号
杂交，系谱法选育出 200242三个姊妹系，使籽粒
带皮率达到2%~3%，品质较父本提高，产量、籽粒
商品品质、抗旱性、抗倒性、抗病性等均优于双
亲，成为重点培育的苗头品系。但200242三个姊
妹系在形态上偏母而且与第一代双亲差异巨大，
让人怀疑杂种的真实性。为此，本研究拟用EST-
PCR技术对远交杂种进行分子鉴定，夯实野燕麦
草与裸燕麦远缘杂交的育种基础。
EST（expressed sequence tags）是长约 150~
500 bp的基因表达序列片段。EST 技术是将
mRNA反转录成 cDNA并克隆到质粒或噬菌体载
体构建成 cDNA文库后，大规模随机挑选 cDNA
克隆，对其3或5端进行一步法测序，所获序列与
基因数据库中已知序列进行比较，从而获得对生
物体生长、发育、代谢、繁殖、衰老死亡等一系列
生理生化过程认识的技术[2]。由于EST来自转录
区，其保守性较高，在家族和种属间的通用性比
来源于非表达序列的标记（如SSR标记）更高，被
认为是鉴定远缘杂种的理想方法，尤其是以PCR
为基础的EST标记[3-16]。此外还具有开发简单、快
捷、费用低的优点。利用EST-PCR技术鉴定野、
裸燕麦的种间杂种还未见报道,本研究期望建立
一套快速、有效鉴定野裸燕麦远交杂种的体系。
1 材料和方法
1.1 试验材料
1.1.1供试材料
一代亲本普通野燕麦（P1）与冀张莜 4号
（P2）、直接亲本品系 9641-6（f1）与坝莜 9号（P3）
及后代 200242三个姊妹系（f21，f22，f23）种质均
由河北省高寒作物研究所提供。
1.1.2引物
在Genbank中检索普通野燕麦EST序列，得
到源自其他植物与野燕麦同源性较高的EST序
列18个，共设计出14对引物，其中12对有多态性
（表1）。所有引物由上海生工合成。
1.2 试验方法
1.2.1 DNA提取
各材料选取10颗种子培养至二叶一心时，取
3~5株幼嫩叶片液氮研磨至粉末后用QIAGEN公
司的试剂盒提取基因组DNA，经电泳检测后，条
带清晰，无降解。
1.2.2 PCR扩增
反应体积20 μL，试剂及用量为：PCR缓冲液
（10 ×）2 μL，dNTP（10mmol/L Each）0.5 μL，Taq
葛军勇等.应用EST-PCR技术鉴定裸燕麦远缘杂交新品系200242 87
第31卷科 技 通 报
DNA聚合酶（宝生）0.15 μL，模板DNA 1 μL，引物
2 μL，双蒸水 14.35 μL。反应在东胜小金刚PCR
仪上进行，反应程序如下：95℃预变性4 min，95℃
变性 30 s，53℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，30个循
环，72℃延伸7 min。
1.2.3扩增产物的检测
取 10 μL扩增产物,加样于 1.5%的琼脂糖凝
胶样品槽内，在 5 V/cm 电压下电泳分离,染色后
凝胶成像仪照相并记录。在 200~1000 bp之间，
有扩增产物DNA带者（包括强带和弱带）记为 1,
缺乏记作 0，所形成的的数据矩阵将被用来进行
遗传相似性分析。
1.2.4数据统计分析
根据扩增结果利用 Jaccard公式计算各材料
间的遗传相似性系数，应用 UPGMA（平均距离
法）进行聚类分析，对 0、1数据进行量化处理，通
过NTSYS version2.10e程序运算建立聚类图。
2 结果与分析
2.1 EST-PCR多态性
对14对引物进行PCR扩增，其中2对无扩增
产物，其余 12对的PCR产物表现出多态性，在凝
胶中共分离得到 177条大小不同的清晰条带，这
些条带的分子量在 100~2000 bp之间，其中 135
条具有遗传多态性，多态性百分率为76.3%。
2.2 遗传关系分析
2.2.1特征条带代间分析
表1 EST-PCR引物序列
Table 1 EST-PCR primer sequence
引物
AF1
AF2
AF3
AF4
AF5
AF6
AF7
AF8
AF9
AF10
AF11
AF12
正向引物
ACAATGAACCGTGGG
CTCCAATCAGCTCGC
TCCATCATTGGCGTC
TCATGTTGCACCAGC
AGCACCAACAGCTGG
ACGTTGTGTTCCCGC
GGCACAAGTTGGTCC
AGAATCCACACCCGC
AGAATCCACACCCGC
CCGAGAACACTTGCC
ATTGGTGGCGCTGAG
TCACCCGTCATCCTC
反向引物
ACAATGAACCGTGGG
TCCATAGGCTGTCGC
CAGCCCTCGTTGTTC
ATCAATCAGCCCACG
GAAGACGCTGCATGG
TCATCGCTTCCGAGC
GCCTCTGACGAAAGC
TTAGGTTGCCTCCGC
CCTCGCAGAATTCCC
TCTCAGGTCCATGCC
TGCTGGATCTTCGGG
TGAACTCGGCCTAGC
Tm
51.8
53
52
50.8
53.5
53.5
53.5
53
53
53
53.5
53.5
基因
BNLGHi9897
BP184489
BP184663
EST0362
EST1053
PU4_plate36_D18
TransId-71216
WNEL14b8
WNEL5d2
TransId-86370
PU3_plate37_A24
PU1_plate20_D22
表2 EST-PCR特征带统计
Table 2 The catalogues of the amplified DNA fragment bands
品系/种
P1
P2
f1
f1
P3
f21
f1
P3
f22
f1
P3
f23
（1）子代中出现
父本特征带
5
5
6
6
6
6
4
4
子代中出现
母本特征带
9
9
4
4
6
6
2
2
（2）父本和母本都有的
条带在子代中丢失
6
6
2
2
5
5
4
4
（3）子代中出现一条父本
或母本中均没有的条带
3
1
8
3
（4）父本独有
的特征带
5
2
2
3
母本独有
的特征带
4
3
1
5
特征带
总数
16
19
17
10
9
11
13
12
20
11
11
9
88
第5期
代间分析特征条带分为 4种类型，以杂交第
一代为例：（1）子代中出现父本或母本的特征带
（14条,图 1-a1,2-a1,3-a2）；（2）父本和母本都有
的条带在子代中丢失（6条,图 4-c，a3）；（3）子代
中出现 1条父本或母本中均没有的带（3条,图 3-
b3）；（4）父本或母本独有的特征带（父本 5条，图
5-b1；母本4条，图3-b2）。表2显示第一代杂交3
个品种/系具有特征带总数分别为:16、19、17，综
合杂交第二代结果，说明EST-PCR标记在品系间
的分布比较均匀,类似于RAPD标记在相关物种
中得出的结论。
子代中出现双亲均没有的特征带，或者在子
代中遗失了双亲都有的带，原因可能是远缘杂交
使染色体重组，改变了某些基因片段的引物结合
位点，从而导致子代中DNA条带的出现或消失。
另外，父本或母本中原本具有相同分子量而没有
分开的的条带也有可能由于在杂交中发生基因
重组，导致子代较为复杂的变化，这种情况在种
内较少发生，而在种间发生的可能性较大。
表 3是由NTSYS软件初步运算得出的相似
性系数矩阵。其中裸燕麦栽培种P2、P3与野燕麦
P1相似性系数最低（0.4565,0.4347），这是由于栽
培种和野生种亲缘较远遗传距离较大造成的。
f21与父本 f1的相似性系数最高（0.8043），可能是
所用 PCR引物是根据野燕麦EST片段设计致使
扩增结果如此，而与母本 P3 较高的相似性
（0.7391）说明得到了更多的母本遗传物质，可从
形态学方面得到进一步验证。由表中可知 f22较
直接亲本 f1、P3与一代亲本P1有更高的相似性，
说明他通过 f1、P3杂交重组使更多 P1基因得到
表达，可从近年田间抗逆性表现得到验证。通过
以上分析基本可以验证杂交育种过程，野燕麦与
栽培燕麦经多年杂交选育只能得到抗逆丰产但
皮性始终不能完全克服的 f1品系，多数杂交不亲
和或子代不育，为克服 f1皮性继续与优质裸燕麦
栽培种P3杂交，最终在 f2代中选育出既含有野燕
麦优异抗逆基因又有栽培种丰产性的优良品
系。通常杂交育种双亲在一定范围内遗传距离
越大杂种优势越强，但遗传距离过大易导致杂交
不亲和或后代不育而最终失败，在这种情况下就
需要根据育种目标改良杂交育种方法以灵活应
对。
2.2.2特征条带父系遗传分析
表4 EST-PCR特征带统计
Table 4 The catalogues of the amplified DNA fragment bands
品系/种
f2出现P1和 f1共有特征条
带数目
f2与p1共有特征条带数目
P1独有特征条带
P1
5
1
1
2
3
f1
5
f21
4
1
f22
4
1
f23
3
2
由于本研究所用引物是根据野燕麦 EST片
段设计，使得扩增结果表现一定的父系遗传特
征。特征条带统计按以下3种类型区分：（1）f1与
f2中均出现P1特征带（图 1，2-a1）；（2）f2中出现
在 f1中丢失的P1特征带（图 4，5-a3）；（3）P1、f1、
f2独有的特征带（图 5-b1；图 3-b3；图 2，6，7-
b4）。所有统计结果如表4所示。
燕麦复杂的六倍体结构和远缘杂交导致的
基因间的剧烈重组是后代出现丰富变异的主要
原因。引物AF7、AF8、AF10的 PCR产物表现出
明显的父系遗传特征，可作为鉴定普通野燕麦后
代的特征引物。
2.2.3聚类分析
从图8聚类分析可以看出：（1）P2、P3栽培种
和P1亲缘关系最远（0.45，0.43），遗传距离最大，
而 f1与P3亲缘关系已较近（0.67），遗传距离已大
表3 7个燕麦物种的相似性矩阵（根据EST-PCR结果）
Table 3 Similarity matrix for seven oat species based on EST-PCR analysis
P1
P2
f1
P3
f21
f22
f23
P1
1.0000
0.4565
0.5000
0.4347
0.4782
0.6087
0.5217
P2
1.0000
0.6522
0.6739
0.5870
0.5435
0.5435
f1
1.0000
0.6739
0.8043
0.5435
0.7174
P3
1.0000
0.7391
0.5652
0.6522
f21
1.0000
0.6087
0.6957
f22
1.0000
0.5652
f23
1.0000
葛军勇等.应用EST-PCR技术鉴定裸燕麦远缘杂交新品系200242 89
第31卷科 技 通 报
图1引物AF7扩增结果 1~7分别代表P1,P2,f1,P3,f21,f22,
f23,下同
a1: f21,f22,f1中均出现P1特征带
Fig.1 The amplified results of primer AF7 1~7 represent P1,P2,
f1,P3,f21,f22,f23,the same below
图2引物AF10扩增结果
a1：f21,f22,f23,f1中均出现P1特征带；b4：f21特征带
Fig.2 The amplified results of primer AF10
图3引物AF2与AF5扩增结果
a2：f21,f22,f1中均出现P2特征带；b2：P2特征带；b3:f1特征带
Fig.3 The amplified results of primers AF2 & AF5
图4引物AF6扩增结果
a3：f22中出现f1丢失的P1和P2特征带；c：P1和P2共有特征带
Fig.4 The amplified results of primer AF6
图5引物AF8扩增结果
a1：f23,f1中出现P1特征带；a3：f23中出现 f1丢失的P1特征
带；b1：P1特征带
Fig.5 The amplified results of primer AF8
图6引物AF4扩增结果
a4：f21,f22,f23中出现的P3特征带；b4：f22,f23特征带
Fig.6 The amplified results of primer AF4
图7引物AF11扩增结果
b4：f22特征带
Fig.7 The amplified results of primer AF1
图8各亲本及其杂交后代EST-PCR标记聚类图
Fig.8 UPGMA dendrogram for parents and hybrids based on
EST-PCR analysis
90
第5期
为缩小，一定程度上说明了杂种优势与遗传距离
之间的正相关性。（2）f22与P1聚到一起，f21与 f1
聚到一起，表现出明显的父系遗传特征，这也是
EST-PCR标记最显著的特点，据此筛选出的引物
可快速有效检测杂交后代。
3 讨论
裸燕麦边抽穗边开花,授粉在花内外稃开始
开放时或开放前开始,所以天然杂交率很低,仅为
万分之一，造成收获的杂交种子容易出现假杂
种。常规育种结实率很低，在5%左右，远缘杂交
更低，不到1%。野、裸燕麦杂交除了受杂交不亲
和的影响，还存在杂种不育，杂种胚早期败育等
现象，很难获得真杂种。因此，对远缘杂交后代
进行早期鉴定显得尤为重要。本研究采用的
EST-PCR分子鉴定技术较好的解决了这一问
题。结合田间形态学鉴定已能确认成功获得种
间杂种，为野×裸燕麦远缘杂交技术提供了科学
依据。近年来，EST分子标记技术随着EST数据
库的不断扩充得到越来越广泛的应用，而在燕麦
上的应用尚属首次，在远交杂种鉴定方面的研究
也不多见。随着人民生活水平不断提高，“三高”
病的多发，使燕麦的保健作用（含β葡聚糖）越来
越受到重视。由于国内对燕麦的科学研究开展
较晚，分子技术的应用不多，亟需加强燕麦分子
生物学的基础研究。EST技术在基因差异表达、
分离和鉴定新基因、功能基因组学研究等方面应
用前景广阔[17,18]。
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