全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOG ICA SIN ICA　36(6):523-527(2006)
收稿日期: 2005-12-02;修回日期: 2006-02-22
基金项目:国家 “八六三 ”资助项目(2003AA207120)
通讯作者:崔崇士 ,教授 ,主要从事蔬菜抗病育种研究;E-m ail:shw k j@m ai.l neau. edu. cn
第一作者:张俊华(1973- ),男 ,山东省博兴人 ,副教授 ,在职博士研究生 ,主要从事植物抗病性及分子标记研究;E-m ail:tian zezhang2008@
yahoo. com. cn。
大白菜抗芜菁花叶病毒基因 EST-PCR-RFLP
分子标记的研究
张俊华 , 潘春清 , 张耀伟 , 崔崇士*
(东北农业大学园艺学院 , 哈尔滨 150030)
摘要:本试验以高抗芜菁花叶病毒 C3株系(TuMV-C3)的高代自交系 A156-2和感病自交系 P9805杂交后代的 F2代为群
体 , 根据大白菜的抗性相关的表达序列标签(EST)设计引物 ,利用分离群体分群分析法 (BSA), 筛选出 2个与 TuMV-C
3
株
系抗病基因紧密连锁的 EST-PCR-RFLP分子标记 BS300及 BS160, 遗传距离均为 6. 5 cM , 为大白菜分子辅助育种 、抗病基
因克隆以及研究抗病基因编码特性等奠定基础。
关键词:大白菜;抗性基因;芜菁花叶病毒 C3株系;EST-PCR-RFLP;分离群体分群分析法
EST-PCR-RFLP markers linked to Turn ip mosaic virus (TuMV) resistance gene in
Ch inese cabbage(B rassica rapa ssp. pekinensis)　ZHANG Jun-hua, PAN Chun-q ing,
ZHANG Yao-wei, CUI Chong-sh i　(Horticulture College Nor theastA gricultural Un iversity, H arbin 150030, China)
Abstract:According to the expressed tags in Ch inese cabbage, EST-PCR-RFLP technique and the me thod of
bulked segregan t ana lysis were used to study the progeny of A156-2 ×P9805. Two DNA molecularm arkers
linked to TuMV-C3 resistance gene w ith a recomb ination frequency of 6. 5 cM were identified. The identifica-
tion of EST-PCR-RFLP m arkers linked to TuMV-C3 resistance gene facilitated establishm ent of the higher den-
sity genetic m ap, Chinese cabbage m arker-assisted se lection breed ing program and eventual c lon ing and cha-
racterization of the resistance gene encoding to TuMV.
Keywords:Ch inese cabbage;resistance gene;TuMV-C3;EST-PCR-RFLP;bulked segregant analysis(BSA)
中图分类号:S436. 341. 11　　　文献标识码:A　　　文章编号:0412-0914(2006)06-0523-05
　　大白菜是最主要的蔬菜之一 ,在城乡人民日常
生活中占有举足轻重的地位。大白菜病毒病是大
白菜生产中三大病害之一 ,危害严重 。芜菁花叶病
毒 (TuMV)是大白菜病毒病的主要毒源 ,生理分化
明显 ,共分为 7个株系 。分别是 C1、C2、C3 、C4 、C5、
C6及 C7株系 [ 1] ,其中 C3株系是黑龙江省的主要
株系[ 1] 。针对白菜的抗芜菁花叶病毒 C4及 C5株
系的抗病基因分子标记曾有过报道 ,而且多是利用
AFLP和 RAPD标记技术 ,对白菜抗芜菁花叶病毒
C3株系抗病基因分子标记的研究未见报道。
EST是指通过对 cDNA文库随机挑取的克隆
进行大规模测序所获得的 cDNA 的 5′或 3′端序
列 ,它代表生物体某种组织某一时期的表达基因 。
近年来 ,各类数据库中 EST数目剧增 ,已成为建立
分子标记的有效资源。小麦[ 2 ～ 4] 、洋葱[ 5] 、葡
萄[ 6, 7]等植物中已建立了一批 EST-SSR和 EST-
PCR标记 ,并对其应用进行了探讨 。对于白菜 ,尽
管已建立了白菜 cDNA 文库 ,获得了一些表达序
列标签 (EST),但还没有利用其建立多态性标记的
报道 。本研究利用现有的抗性相关的 EST资源设
　
植物病理学报 36卷
计引物进行扩增 ,并用限制性内切酶进行酶切 ,进
行大白菜抗芜菁花叶病毒 C3株系抗病基因分子标
记的探讨 。这对于加速白菜 EST资源的开发利
用 ,丰富其分子标记类型与绘制遗传图谱 ,实现特
定性状的辅助选择和进行比较基因组研究都具有
重要的意义 。
1　材料与方法
1. 1　供试材料
以高抗 TuMV-C3的高代自交系 A156-2和感
病自交系 P9805杂交后代构建 F2代分离群体。将
种子放在铺有湿润滤纸的培养皿内 ,于 25℃催芽
24 h。然后将催芽的种子播种于塑料营养钵中置
于防虫温室内培养 , 白天保持 25℃, 夜晚保持
15℃。育苗期间按常规管理 [ 8] 。
1. 2　方法
1. 2. 1　抗病性鉴定　当幼苗长有 2 ～ 3张真叶时
进行接种 。从保存 TuMV-C3株系毒源的寄主植
物上剪取中位重病叶 ,每 1 g鲜病叶加入 pH值为
7. 0 ～ 7. 2、0. 05 mol /L磷酸缓冲液 4 mL ,在消毒
的研钵内充分研碎。采用摩擦接种法接种 , 3 d后
重复接种 1次 。接种后 18 ～ 22 d调查病情[ 8, 9] 。
结合 ELISA检测技术及症状观察对 F2代 286个
单株进行抗 TuMV-C3株系的抗性归类。
1. 2. 2　DNA的提取和检测　选取幼嫩的叶片洗
净 ,参照 Murray[ 10]的 CTAB法提取 DNA ,稍作改
进 。用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳法检测
DNA纯度和含量 。
1. 2. 3　抗感池的构建　随机选取 F2代群体中极
端抗病单株 15株及极端感病单株 15株 ,分别构建
抗感池 。
1. 2. 4　PCR-RFLP分析　
1)引物设计:根据大白菜与抗性相关的表达
序列标签(EST)设计了 20对引物。引物由上海生
工生物技术服务有限公司合成 。
2)PCR扩增反应:利用亲本及构建的抗感池
筛选引物。其反应体系包括 1×PCR buffer(M g2+
free), MgC l2 (2 mmol /L), dNTP M ixture (0. 2
mmol /L),Taq酶(1. 5U),引物 (各 0. 2μmo l/L),
模板 DNA (1 μL);加入 ddH2O 至总反应体积
达50 μL。
扩增条件为 94℃预变性 5 m in, 94℃变性 30
s, 52℃退火 30 s, 72℃延伸 60 s, 35个循环后 , 72℃
延伸 8 m in。反应在 PTC-100上进行 。
3)酶切反应:在 15μL反应体系中加入 8 μL
PCR反应产物 , 10 U 内切酶 , 1 ×buffer, 加入
ddH2O至总反应体积达 15 μL。将上述混合液置
于 37℃水浴中温育 2 ～ 3 h[ 11] 。所用的限制性内切
酶 BSMBI购自 NEB公司。
4)产物检测:使用 1×TBE缓冲液制作 2%的
琼脂糖凝胶 ,以 DNAM arker(DL2000)为分子量标
准 ,取 8 μL PCR扩增产物或酶切产物进行电泳检
测[ 12] 。在 100 V下电泳 2 h,取出凝胶 ,采用 gene
凝胶分析系统进行照相分析。
2　结果与分析
2. 1　F2代单株抗 TuMV-C3抗性鉴定结果
本实验对 F2代 286个单株进行防虫温室内苗
期人工接种鉴定及病情调查。结果表明:病级从
0、1、3、5、7级都有分布 ,出现了一定的分化 ,但病
级 9级没有出现 。其中 0级 89株 、1级 48株 、3级
84株 、5级 41株 、7级 24株。为了确保实验结果
的精确性 ,对所有 286个单株分别进行 ELISA检
测 , 0级的 89株均表现阴性 ,其余 197株均表现
阳性 , ELISA检测结果与目测病情调查结果一
致(表 1)。
Tab le 1　Resistan t evaluation of F2 generation
p lants to TuMV-C3
Trea tm en t
Leve l of disease
0 1 3 5 7
No. of each level of disease 89 48 84 41 24
ELISA tes t - + + + +
-:N ega tive reac tion for ELISA test;+:Pos itive
reaction for ELISA tes.t
2. 2　PCR扩增结果
利用亲本及抗感池筛选引物 ,结果 EST012引
物扩增出 460 bp的片段 (图 1),并且对所有的 286
个 F2代单株 DNA扩增均能扩增出 460 bp片段。
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　6期 张俊华 , 等:大白菜抗芜菁花叶病毒基因 EST-PCR-RFLP分子标记的研究
　
Fig. 1　Amp lification result from F2 popu lation w ith the prmi er EST012
M:M arker;P1:Resistan t paren t;P2:Suscep tib le paren t;1 - 7:Resistan t p lant;8 - 14:Suscep tible plan.t
2. 3　酶切结果
用多种限制性内切酶对上述扩增产物进行酶
切 。结果表明:BSMBI内切酶将抗病亲本及抗病
池的 PCR产物切成 BS300及 BS160两个特异性
片段 ,大小分别为 300及 160 bp;而对感病亲本及
感病池没有酶切位点 (图 2)。对 286个 F2代单株
EST012引物扩增产物进行酶切 ,除 17个 F2代单
株发生交换外 , 抗病单株 PCR产物均能切出
BS300及 BS160两个特异性片段 , 而感病单株
PCR 产物 没 有酶 切 位点 (图 3、 4)。 利用
MAPMAKER /EXP(Version 3. 0)作图软件统计 ,
其遗传距离均为 6. 5 cM (表 2)。
Table 2　Screen ing resu lt of PCR-RFLPm arker link to TuMV-C3
resistance gene in Ch inese cabbage
M arker
To tal number
of plan t
Number of
unexchange plant
Number of
exchange plan t
Exchange
frequency (%)
M ap distance
(cM)
BS300 286 269 17 5. 94 6. 5
BS160 286 269 17 5. 94 6. 5
　
Fig. 2　BsmB I fragments of PCR products am plified w ith prmi er EST012
M:Marke r;P1:Resistant plant;P2:Susceptible pa rent;RP:Resistant pool;SP:Susceptible poo.l
　
Fig. 3　BsmB I fragm en ts of PCR produc ts amp lifiedw ith prmi er EST012 for parts of F2 plan ts
2, 7, 11, 12, 18:Res istan t p lant;1, 3, 4, 5, 8, 9, 10, 14, 15, 16, 17:Susceptib le plant;6* , 13*:Exchanged plan t;M:M arker.
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植物病理学报 36卷
　
Fig. 4　BsmB I fragm en ts of PCR produc ts amp lifiedw ith prmi er EST012 for parts of F2 plan ts
1, 2, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15:Resistan t p lant;5, 8, 12:Susceptible plan t;M:Marke r.
3　讨论
3. 1　基因组 DNA混合池的构建与植物抗病
性鉴定
在植物分子标记研究中 ,往往采用近等基因系
(NILS)这一特殊遗传材料 ,但由于建立一套近等
基因系至少需要 7 ～ 8年的时间 ,而且经过杂交 、多
代回交和自交分离等繁琐的实验操作过程 ,存在很
多限制因素 。 F2代群体是常用的作图群体 ,迄今
大多数植物的 DNA标记连锁图谱都是用 F2代群
体构建的。不论是自花授粉植物 ,还是异花授粉植
物 ,建立 F2代群体都是容易的 。这是使用 F2代群
体进行 DNA标记的最大优点。分离群体分群分
析法(bulked segregant analysis, BSA),是从近等基
因系分析法演化而来的 。它克服了许多作物没有
或难以构建相应的 NILS的限制 ,在自交和异交物
种中均有广泛的应用前景 。 BSA法是把具有一对
相对性状的 2个 DNA池作为研究对象 ,从而在基
因组水平上寻找该性状的差异。由于建池所用的
分离群体可以在较短时间内建立 ,因此它不需要长
期的育种基础 ,被广泛应用于各种作物抗病基因及
其它质量性状基因甚至数量基因的分子标记研究
中 [ 13] 。为了弥补无 NILS的缺憾及节约获得实验
材料的时间 ,本实验采用 BSA法结合 EST-PCR-
RFLP分析来研究大白菜对芜菁花叶病毒 (TuMV)
的抗病性。
在 DNA混合池的构建过程中 ,构成抗病池和
感病池所用单株数目对于实验结果也有影响。若
混合池内所含单株数目较少 ,由于取样的随机误差
将导致抗病池 DNA与感病池 DNA出现差异的几
率增加 ,这样检测出的多态性位点并不一定是真实
的;若混合池所含单株数目较多 ,则属于同一池的
植株在目的基因邻近的共同区段因为交换增多而
变小 ,很有可能难以检测出多态性位点。通常情况
下 ,建池所需要的植株数目取决于目的基因区域内
标记位点的密度 。少则 5株 ,多则 40株 ,一般采用
10 ～ 20株 [ 14] 。结合本实验的特点 ,分别选用 15个
典型单株构建 DNA抗病池和感病池。
研究大白菜抗病性 DNA多态性的重要前提
是构建基因组 DNA抗病池和感病池 ,以有效消除
单个植株基因组背景差异 。在基因组混合池构建
过程中 ,植株抗病性鉴定是一个非常重要的环节 。
大白菜病毒病的毒源种类很多 ,除 TuMV外 ,还有
CMV、TMV等。为了确保实验结果的准确性 ,本
实验结合 EL ISA检测及症状观察对 F2代所有的
单株进行抗病性鉴定 ,结果显示 , ELISA检测与症
状观察结果基本上一致。
3. 2　EST-PCR-RFLP标记
随着分子生物学的发展 ,分子标记技术和方法
不断增多 ,常见的方法有 RAPD、AFLP、RFLP等 。
现有的从基因功能的角度研究芸薹属的分子标记
所存在的问题主要表现在:1)目前芸薹属植物基
因组作图基本上依赖于拟南芥现有的基因序列 ,未
能充分利用芸薹属植物特有 、而拟南芥没有的基因
序列;2)扩增共有遗传标记 (ACGM)技术基本上
依赖于拟南芥中的基因序列 。在目前还无从明确
哪些基因在芸薹属植物之间及其和拟南芥之间发
生了变异 ,这一技术需要逐一比较大量的功能基
因 ,目前只是比较了少数几个参与初级代谢的基
因。因此 ,需要充分利用芸薹属自身特有的基因资
源 ,发展新的 、有效的 、特别适合于芸薹属植物的分
子标记技术。本研究利用大白菜 EST资源 ,对建
立以 PCR为基础的分子标记进行了探讨 ,首先根
据大白菜抗性相关的 EST序列设计引物 ,并对样
品的基因组进行扩增 ,然后对扩增产物进行酶切并
进行电泳分析 ,以检测是否具有多态性。通过利用
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　6期 张俊华 , 等:大白菜抗芜菁花叶病毒基因 EST-PCR-RFLP分子标记的研究
亲本及抗感池对设计的 20对引物进行筛选 ,其中
引物 EST012对亲本及抗感池均能扩增出 460 bp
大小的片段 ,利用限制性内切酶 BSMBI对抗病材
料能切出 300及 160 bp两条特异性片段 ,而感病
材料没有酶切位点 。这些研究结果及作者的研究
都证明了根据大白菜 EST序列设计引物来建立分
子标记是可行的 。另外 ,本实验中扩增片段的多态
性仅仅是通过琼脂糖凝胶电泳检测的 ,而琼脂糖凝
胶电泳只能区别出数目不同和分子量相差较大的
扩增片段。因此 ,如果提高分析手段 ,如采用分辨
率较高的聚丙烯酰胺凝胶电泳或采用其它措施来
揭示扩增片段内部核苷酸的差异 ,呈现多态性引物
的比例将会更高 ,这将进一步提高建立标记工作的
效率。
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