全 文 ：　　表 1　志愿者口服曲司氯铵试验制剂(片或胶囊)40 mg 后平
均药动学参数( x±s , n=18)
Tab 1　Pharmacokine tic par ameters of t rospium chloride af-
te r a single or al dose of 40 mg domestic tro spium chlo ride
tablets(t1), capsules(t2)o r impo rt capsule s(r)( x±s , n=18)
参数 试验制剂 1 试验制剂 2 参比制剂
Cmax/μg·L -1 9.8±4.1 9.0±4.1 9.6±4.2
tmax/ h 3.4±0.6 3.2±0.5 3.3±0.6
t1/2/ h 7.3±1.5 7.3±1.5 7.2±1.2
AUC0※24/μg·L -1·h 72.5±39.6 69.0±32.2 71.1±35.4
AUC0※∞/μg·L -1·h 81.4±44.8 78.0±38.3 79.2±39.1
间也未发现差异有显著性(P >0.05),见表 2。双单
侧 t检验结果表明两种试验制剂与参比制剂为生物
等效制剂 。非参数检验未发现试验制剂 I 和试验制
剂 II的 tmax与参比制剂的 tmax之间有差异。
表 2　A UC0※24 , Cmax方差分析结果
Tab 2 　 Results o f statistics analy sis(ANOVA)fo r ln
(AUC0※24)and ln(Cmax)
Source Dependent V ariable SS df MS F Sig.
SUB ln(Cmax) 8.079 17 0.475 55.92 0
ln(AUC0※24) 9.178 17 0.540 52.83 0
DRUG ln(Cmax) 1.702E-02 2 8.508E-03 1.00 0.38
ln(AUC0※24) 8.632E-03 2 4.316E-03 0.42 0.66
PHASE ln(Cmax) 9.496E-04 2 4.748E-04 0.056 0.95
ln(AUC0※24) 4.561E-03 2 2.280E-03 0.22 0.80
Error ln(Cmax) 0.272 32 8.498E-03
ln(AUC0※24) 0.327 32 1.022E-02
T ot al ln(Cmax) 269.178 54
ln(AUC0※24) 945.465 54
　　与参比制剂相比 ,试验制剂 I 的相对生物利用
度为(101.8±14.9)%;试验制剂 II 的相对生物利
用度为(98.0±6.0)%。试验制剂 I 的 Cmax的均值
落在参比制剂的97.3%～ 108.3%之间(高 、低侧 P
值均大于0.05), AUC0※24的均值落在参比制剂的
99.0%～ 110.2%之间(高 、低侧 P 值均大于0.05);
试验制剂 II 的 Cmax的均值落在参比制剂的95.0%
～ 106.9%之间(高低侧 P 值均大于0.05), AUC0※24
的均值落在参比制剂的92.2%～ 103.7%之间(高 、
低侧 P值均大于0.05)。
4　讨论
曲司氯铵的生物利用度差且容易受到食物等因
素的影响 ,因此该药物体内的吸收容易出现个体差
异。同时本品剂量小 ,血药浓度低 ,化合物结构中没
有共轭系统 ,紫外吸收特征不明显 ,采用荧光方法检
测时需要衍生化 ,定量下限为1.0 μg·L-1 。GC-MS
的方法检测条件苛刻 ,样品处理仍未能简化。 RIA
的方法可以快速简化 ,但该方法测定的为总标记物
放射量 ,不能判定是原型药物还是代谢产物。本试
验建立的 HPLC-MS/MS方法 ,样品处理简化 ,定量
下限达到0.2 μg·L -1 ,灵敏度高 ,稳定 ,能满足大量
生物样品的分析测定的要求 。
本试验研究了两种国产曲司氯铵制剂与进口制
剂的生物利用度 ,结果发现两种国产制剂与进口制
剂互为生物等效制剂 ,说明曲司氯铵国产制剂的内
在质量临床疗效与进口产品相当 。
致谢:该试验方案经中南大学药学院医学伦理委员讨论同意并
由该委员会对试验过程进行监察。
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[收稿日期] 2006-10-22
[ 作者简介] 杜娟 ,女 ,学士 ,主管药师 ,电话:0531-82169354
月腺大戟水提物诱导 P388白血病细胞的凋亡
杜娟1 ,徐瑞军2 ,崔晞3 ,居学海3 　(1.山东大学齐鲁医院药剂科 ,山东 济南 250012;2.山东省立医院药剂科 , 山东 济南
250021;3.山东大学公共卫生学院卫生检验学研究所 , 山东 济南 250012)
[ 摘要] 　目的:研究月腺大戟水提物抗 P388白血病及对瘤细胞凋亡的作用。方法:以一级清洁 DBA/ 2 型小鼠为实验对象 ,腹
腔接种 P388白血病细胞 , 胃饲 10 , 2.5 g·L -1的月腺大戟溶液0.3 m L , 连续 6 d ,检测外周血白细胞总数和腹腔瘤细胞总数 ,分
离外周血淋巴细胞 ,观察瘤细胞及凋亡特征 ,计算细胞凋亡率 , 并检测 bcl-2 和 bax 凋亡相关基因的表达情况。结果:月腺大戟
高剂量组外周血白细胞数量显著低于模型对照组(P<0.01)。月腺大戟低剂量组外周血白细胞虽低于模型对照组 , 但差异无
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显著性(P>0.05)。两剂量组的细胞凋亡率均明显高于模型对照组 , 两剂量组间的细胞凋亡率差异显著(P<0.01)。凋亡细
胞中可见核质浓缩 、数个圆形凋亡小体位于胞浆 , 或呈半月形 、块状靠近胞膜边缘 , 还可见核质松散呈网状 , 细胞膜不完整的
退化淋巴细胞 ,表明高剂量明显诱导细胞凋亡(P<0.01),低剂量虽能诱导细胞凋亡 , 但差异无显著性(P>0.05)。结论:高剂
量月腺大戟可通过诱导细胞凋亡明显抑制 P 388白血病瘤细胞的恶性增殖。
[ 关键词] 　月腺大戟;P 388白血病;DBA/ 2 小鼠;细胞凋亡
[中图分类号] R979.1　　[ 文献标识码] A　　[文章编号] 1001-5213(2007)04-0454-05
Apoptosis in P388 lymphocytic leukemic cells induced by water extract of Euphorbia ebracteolata
Hayata
DU Juan
1 , XU Rui-Jun2 , CUI Xi3 , JU Xue-hai3(1.Department o f Pharmacy , Qilu Hospital , Shandong Univer sity ,
Shandong Jinan 250012 , China;2.Depar tment of Pharmacy , Shenli Hospital , Shandong Jinan 250021 , China;3.Depa rtment of
Chemistr y and Bacteria De tection , School of Public Health , Shandong Univ ersity , Shandong Jinan 250012 , China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To explo re the anti-leukemia mechanism of Euphorbia ebracteolata Hayata(EEH).METHODS　
The present study was perfo rmed in DBA/2 mice.The mice w ere randomly designed into nega tive , po sitive , drug contr ol
gr oups and EEH groups , received inocula tion of P388 leukemia strains abdominally , and after 24 hours 0.3 mL EEH ext ract a t
the level of 2.5 g·L -1(low dosage)and 10 g·L-1(high dosage)w ere given to the EEH groups respec tively f or 6 d by intr agas-
tric administra tion.The leucocy tes in periphera l blood and a scitic cells w ere counted , the lymphocy tes w ere isolated and the
char acte ristics of apopto sis o f P388 leukemia cells w ere observ ed , and the gene expression of bcl-2 and bax in the leukemia cells
were obser ved.RESULTS　The number o f leucocytes in the per iphe ral blood and abdominal dropsy of mice administrated with
high dosage w ere significantly lowe r than tha t in positive controls(P<0.01).Similar phenomenon has been show n in the mice
administrated w ith low do sage , but the differences w ere not statistically significant(P>0.05).A marked and dose-dependent
increase in the numbe r o f apopto sis nuclei w as show n in EEH- treated mice.The EEH-trea ted mice cells showed typical features
of apoptosis.And apopto sis was significantly induced in the mice administrated w ith high dosage(P<0.01), a s w ell a s in the
mice administ rated w ith low dosage , but the differ ences were no t statistically significant(P >0.05).CONCLUSION　H igh
do sage EEH could inhibit the prolifer ation of P388 leukemia cells by inducing apopto sis.
KEY WORDS:Euphorbia ebracteolata Hayata ;P 388 leukemia;DBA
　　月腺大戟(Euphorbia ebracteolata Hayata .)
是中药狼毒的原植物之一 ,始载于《神农本草经》 ,具
有散结杀虫的功效 ,民间常用于治疗结核和癌症[ 1] ,
但其毒性大 ,应用受到限制。近年 ,研究者发现狼毒
提取物有抗肿瘤 、抗菌和抗病毒作用[ 2] ,且已分离出
有抗癌活性的二萜和抗结核的有效成分双分子呋喃
醛醚等化学物质[ 3] 。另有研究发现狼毒水煎液及碱
性提取液具有抗惊厥作用[ 4] 和抗癫痫作用[ 5] ,月腺
大戟注射液用于治疗银屑病收到了非常理想的效
果[ 6] 。为了探讨其对白血病的治疗作用 ,本实验对
月腺大戟水提物诱导 P388白血病细胞的凋亡进行了
研究 。
1　材料
月腺大戟(采集于山东省青州市 ,经山东大学药
学院中草药教研室鉴定为大戟科月腺大戟);一级清
洁 DBA/2型小鼠 ,体质量 18 ～ 22 g , ♀♂各半(中
国医学科学院实验动物繁育场 , 动物合格证号:
SOXK京 2004-0001 , SOXK 京 2004-0006);P388淋
巴性白血病细胞株(中国科学院肿瘤研究所 ,液氮保
存 , DBA/2型小鼠传代);水为注射用水。
2　方法
2.1　月腺大戟的提取及溶液的配制　取生药约 30
g ,剪碎(Υ3 mm),置于蒸馏装置内 ,加入 750 mL 注
射用水 ,加热至微沸 , 持续 30 ～ 40 min ,过滤弃药
渣 ,收集滤液 ,反复多次 。将收集的滤液置于低压浓
缩装置 ,采用液体石蜡油浴加热 ,控制温度使滤液保
持微沸 ,浓缩滤液 ,直至呈黏稠状 。将其平铺于托盘
中 , 40 ℃烘干 ,用刀片刮取提取物(1 g 月腺大戟提
取物相当于 18 g 月腺大戟生药),置于密闭容器内 ,
4 ℃保存备用。取0.10 ,0.025 g 月腺大戟分别加入
注射用水 10 mL 溶解后即为高 、低剂量月腺大戟溶
液(1 g 月腺大戟水提物相当于 18 g 月腺大戟生
药)。
2.2　外周血白细胞及腹水肿瘤细胞恶性增殖的测
定　50只 DBA/2 小鼠 ,体质量 18 ～ 22 g , ♀♂各
半。平衡饲养一周后 , 随机分为 5 组:正常对照组
(I ,n=10)、模型对照组(Ⅱ , n=10)、月腺大戟低剂
量组(Ⅲ ,n=10)、月腺大戟高剂量组(Ⅳ, n=10),
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阳性药物对照组(Ⅴ ,n=10)。I 组每鼠腹腔注射生
理盐水0.2 mL ,其余组在相同部位注入 105个 P388
细胞(0.2 mL), 24 h 后Ⅴ组隔日腹腔注射顺铂
(CDDP)4.5 mg·kg-1(第 1 ,3 , 5天),其余组每日由
胃灌入:I 组生理盐水 0.3 mL ;II 组生理盐水0.3
mL ;Ⅲ组低剂量溶液0.3 mL ;Ⅳ组高剂量溶液0.3
mL ,共 6 d 。取 20 μL 尾静脉血与白细胞稀释液0.4
mL 摇匀 , 滴入细胞计数室 ,染色后静置 3 min ,低
倍镜下计白细胞总数。小鼠颈椎脱臼处死后取腹
水 ,生理盐水 1∶100稀释 ,低倍镜下计肿瘤细胞总
数。
2.3　外周血淋巴细胞的分离及形态学观察　取小
鼠眶内血0.5 ～ 1 mL , 用淋巴细胞分离液分离淋巴
细胞 , RPIM-1640 培养液调细胞数为 1×107个·
mL -1 。取0.2 mL 细胞涂片 ,自然晾干后无水乙醇
固定 15 min ,HE 染色 ,镜下观察肿瘤细胞的形态 ,
计数 200个淋巴细胞 ,计算各组肿瘤细胞的凋亡率 。
2.4　bcl-2和 bax 凋亡相关基因蛋白检测　取小鼠
眶内血0.5 ～ 1 mL ,用淋巴细胞分离液分离淋巴细
胞 ,分离后的淋巴细胞加入0.01 mol·L-1 PBS 缓冲
液(pH 7.4)2 000 r·min-1离心 10 min ,弃去上清 ,
沉淀涂片 。涂片立即用纯丙酮室温固定 30 min ,纯
化水洗 ,干燥后-20 ℃保存。涂片的处理参照由武
汉博士德生物工程有限公司提供的 bcl-2 , bax 一抗
及免疫组化染色试剂盒的说明书操作 ,镜下观察不
同给药组中 P 388小鼠外周血淋巴细胞中 bcl-2 和
bax 基因蛋白的阳性表达强度 ,每一标本随机选择 5
个视野共计 100个细胞 ,对阳性细胞计数。
2.5　数据处理　外周血中白细胞数及腹水中肿瘤
细胞数用 x±s表示;细胞凋亡率用 p±s ,多组比较
用秩和检验 ,两两比较用 Q 检验;凋亡相关基因表
达阳性率用 p±s表示 ,比较应用U 检验。
3　结果
3.1　月腺大戟外周血白细胞及腹水肿瘤细胞恶性
增殖的抑制作用　DBA/2小鼠接种后 ,外周血白细
胞总数显著升高 ,腹水肿瘤细胞恶性增殖。CDDP
腹腔注射治疗后病情明显缓解 ,外周血白细胞总数
和腹水肿瘤细胞数显著降低;高剂量月腺大戟对外
周血白细胞和腹水肿瘤细胞的恶性增殖有较强的抑
制作用;月腺大戟对低剂量组虽降低了外周血白细
胞数和腹水肿瘤细胞数 ,但差异无显著性 ,提示这种
抑制作用 ,可能存有剂量依赖关系。同时腹水瘤细
胞数变化幅度不如外周血白细胞数 ,但呈现相同的
趋势 。结果见表 1。
3.2　外周血淋巴细胞形态学观察　瑞氏染色显示 ,
表 1　月腺大戟对外周血白细胞及腹水瘤细胞增殖的作用
( x±s , n=10)
Tab 1　The effect of Euphorbia ebracteolata Hayata(EEH)
on the prolifer ation of the leucocy tes in pe riphe ral blood and
ascitic cells( x±s , n=10)
组别 接种 药物 白细胞数/1010·L-1 P值
腹水细胞数
/1012·L -1 P值
I 生理盐水 生理盐水 0.33±0.15
Ⅱ P388细胞 生理盐水 1.0±0.3 <0.01a 1.86±0.11
Ⅲ P388细胞 低剂量 0.96±0.25 >0.05b 1.69±0.13 >0.05b
Ⅳ P388细胞 高剂量 0.72±0.18 <0.05b 1.27±0.09 <0.05b
V P388细胞 CDDP(腹腔) 0.38±0.17 <0.01b 0.019±0.010 <0.01b
注:a表示与 I比较 , b表示与Ⅱ比较
模型对照组外周血淋巴细胞均为成熟的淋巴细胞。
HE 染色细胞核呈深蓝色 ,核染色质致密 ,胞浆少 ,
呈淡红色 ,可见少数凋亡细胞 ,凋亡细胞着色较浅 ,
核质呈半月形贴于细胞膜周边。给予月腺大戟的两
组动物凋亡细胞多见 ,且有较多凋亡小体散在分布
于细胞中间。凋亡细胞中可见核质浓缩 、数个圆形
凋亡小体位于胞浆 ,或呈半月形 、块状靠近胞膜边
缘。另外 HE染色还可见细胞形态不规则 ,核质松
散呈网状 ,核染色呈天蓝色 ,胞浆呈红色 ,细胞膜不
完整的退化淋巴细胞。在月腺大戟高剂量组中 ,这
种退化的终末细胞比月腺大戟低剂量组的数量多 ,
模型对照组和阳性药物对照组动物的外周血中极少
见这种细胞。
3.3　细胞的凋亡作用　经秩和检验表明 ,5组实验
动物的细胞凋亡率存在差异 ,具显著性 ,见表 2。用
Q检验对实验组进行两两比较 ,结果显示月腺大戟
给药组肿瘤细胞凋亡率均明显高于模型对照组 ,两
组不同剂量药物对细胞凋亡的作用也有明显的差
异 ,月腺大戟高剂量组效果比月腺大戟低剂量组更
为显著。在模型对照组的肿瘤细胞中也存在细胞凋
亡现象 ,与正常对照组及阳性药物对照组比较差异
有显著性 ,而正常对照组和阳性药物对照组之间差
异无显著性 ,见表 3。
表 2　月腺大戟对外周血肿瘤细胞凋亡的作用( p ±s , n=
10)
Tab 2　The effect of Euphorbia ebracteolata Hayata(EEH)
on the apopto sis o f the tumo r cell in peripheral blood( p±s , n
=10)
组别 接种 药物 细胞凋亡率/ %
I 生理盐水 生理盐水 0.35±0.25
Ⅱ P388细胞 生理盐水 4.5±1.1
Ⅲ P388细胞 低剂量 18.2±2.5
Ⅳ P388细胞 高剂量 32.4±5.8
Ⅴ P388细胞 CDDP(腹腔) 25.2±3.6
3.4　bcl-2和 bax 凋亡相关基因表达　结果显示:
⑴正常对照组 , bcl-2和 bax 表达平衡 ,细胞存活期
正常;⑵模型对照组 , bcl-2基因表达旺盛(bcl-2 定
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　　表 3　实验动物组之间细胞凋亡率的比较( p±s , n=10)
Tab 3 　The comparison of the ra te of apoptosis betw een
gr oups of tested mice( p±s , n=10)
组别 秩和差 差的标准误 q
I 与Ⅱ 155.0 27.84 5.567 8b
I 与Ⅲ 255.5 36.97 6.911 3b
I 与Ⅳ 354.5 46.10 7.690 2b
Ⅱ与Ⅲ 102.5 17.87 5.872 0b
Ⅱ与Ⅳ 198.0 27.34 7.058 7b
Ⅲ与Ⅳ 100.5 17.89 6.010 5b
注:Q 检验 , b表示 P<0.01
位于细胞核膜 、内质网和线粒体外膜上),胞浆及膜
均出现深染的棕色或棕黄色颗粒 ,表达阳性率高;同
时 ,细胞中 bax 基因表达程度较低(bax 主要位于细
胞浆中 ,亦呈现为棕黄色颗粒),颗粒染色相对较淡 ,
表达阳性率较低。见表 4 , bcl-2 表达旺盛而 bax 表
达较低 ,bcl-2/bcl-2同二聚体占优势 ,细胞存活期延
长 ,细胞凋亡受到抑制;⑶月腺大戟低剂量组 , bcl-2
表达较阳性对照组下降 , bax 较模型对照组上升 ,但
差异无显著性(P >0.05);⑷月腺大戟高剂量组和
阳性药物对照组 , bcl-2 表达较模型对照组低 ,受到
明显抑制;bax 表达旺盛 ,表达阳性率较高 ,胞浆中
大量深染棕黄色颗粒 ,从而 bax/ bax 同二聚体占优
势 ,药物诱发细胞调亡 ,白血病病程受到遏制 ,同时
提示月腺大戟的作用可能存在剂量依赖关系 。
表 4　外周血淋巴细胞中 bcl-2和 bax基因的表达( p±s , n=
10)
Tab 4　The gene expression of bcl-2 and bax in the leuco-
cy tes in periphera l blo od( p±s , n=10)
组别 接种 药物 bcl-2表达阳性率/ %
b ax 表达阳性率
/ %
I 生理盐水 生理盐水 12.9±11.3 27.2±9.0
Ⅱ P388细胞 生理盐水 68.0±18.2ac 7.6±4.5ac
Ⅲ P388细胞 低剂量 59.5±16.6bd 8.5±5.0bd
Ⅳ P388细胞 高剂量 48.3±18.9bc 13.2±3.6bc
V P388细胞 CDDP(腹腔) 50.6±15.3bc 16.2±5.9bc
注:a表示与 I 比较 , b表示与Ⅱ比较;c表示 P<0.01 , d表示 P>0.05
4　讨论
本实验结果表明 , DBA/2 小鼠接种后 ,外周血
白细胞总数显著升高 ,给予高剂量月腺大戟后 ,外周
血白细胞总数明显降低(P <0.01)。月腺大戟低剂
量组外周血白细胞数较模型对照组有不同程度降
低 ,但差异无显著性 ,腹水瘤细胞变化趋势同白细
胞 ,但是幅度不如白细胞大 ,提示月腺大戟对外周血
白血病细胞和腹水瘤细胞的恶性增殖有较强的抑制
作用 ,此作用可能存有剂量依赖关系。
外周血淋巴细胞形态学观察发现 ,给予月腺大
戟药物的两组动物的凋亡细胞比模型对照组多见 ,
可见典型的凋亡细胞 。另外 ,还可见许多核质呈块
状 ,继而松散呈网状 ,细胞膜不完整的退化淋巴细
胞。在月腺大戟高剂量组中 ,这种退化的终末细胞
比月腺大戟低剂量组多 ,模型对照组和阳性药物对
照组动物的外周血中极少见到这种细胞。两个剂量
组的细胞凋亡率均明显高于模型对照组 ,且月腺大
戟高剂量组的细胞凋亡率明显高于月腺大戟低剂量
组 ,提示月腺大戟能促进白血病细胞的凋亡 ,可能存
在剂量依赖关系。
白血病细胞中有高水平的 bcl-2表达 ,这些细
胞可能具有较强的髓外生存适应能力以及对多种化
疗药物的抗性。bax 是 bcl-2家族中研究最广泛的
促凋亡蛋白[ 7] ,它定位于细胞浆 ,自身可形成同源二
聚体或与 bcl-2形成异源二聚体。许多细胞凋亡中
有 bax 表达升高。转染 bax 不仅能诱导许多细胞自
发凋亡 ,而且促进多因素诱导的多种细胞凋亡。目
前认为 , bcl-2/bax 两蛋白之间的比例是决定对细胞
凋亡抑制作用强弱的关键因素 , bcl-2 和 bax 共同协
调调节细胞凋亡 。如 bcl-2和 bax 表达量平衡 ,形
成的 bcl-2/bax 异二聚体占优势 ,则细胞存活期正
常 ,如 bcl-2过表达而 bax 表达不相应增多 ,使形成
bcl-2/bcl-2同二聚体占优势 ,则细胞存活期延长 ,如
bax 过表达 ,而 bcl-2 表达不相应增多 ,使 bax/bax
同二聚体占优势 ,则诱发调亡[ 8] 。
本实验中 ,正常对照组细胞 bcl-2和 bax 表达
平衡 ,细胞存活期正常 。模型对照组细胞 bcl-2 基
因表达旺盛 ,而 bax 基因表达较低 ,形成 bcl-2/bcl-2
同二聚体占优势 ,则细胞存活期延长 ,细胞凋亡受到
抑制 。月腺大戟低剂量组细胞 bcl-2 表达较模型对
照组下降而 bax 上升 ,但差异无显著性(P>0.05);
月腺大戟高剂量组和阳性药物对照组细胞 bax 表达
旺盛 ,bcl-2表达受到明显抑制 ,此时 bax/bax 同二
聚体占优势 ,诱发细胞调亡 ,白血病病程受到遏制 ,
可说明高剂量月腺大戟对白血病淋巴细胞凋亡有诱
导作用 ,而促凋亡作用可能是月腺大戟抑制白血病
的重要途径 ,作用可能与剂量依赖性有关。
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[收稿日期] 2006-07-11
[ 基金项目] 2007年安徽高校省级自然科学研究项目(编号 KJ2007B317ZC)　[ 作者简介] 张善堂,男 ,硕士 ,副主任药师 ,电话:0551-2283378;
手机:13515661288;E-mai l:zhangsh an tang@163.com
柱前衍生高效液相色谱法测定人血浆中白消安的浓度
张善堂 ,方焱 ,屈建 ,陈象青 ,沈爱宗 ,孙言才　(安徽省立医院 ,安徽 合肥 230001)
[ 摘要] 　目的:建立测定人血浆中白消安浓度的高效液相色谱法 。方法:血浆样品经衍生化处理后 , 以甲醇-水(74∶26)为流动
相 ,流速0.9 mL·min -1 ,选用 NovaPak C18色谱柱(3.9 mm×150 mm , 4 μm), 在 280 nm 波长下进行检测。结果:白消安血浆
质量浓度的线性范围为0.050～ 3.20 mg·L -1 ,以加权最小二乘法运算得到回归方程为Y =4.575X -37.04(r=0.999 3 , n=
9),方法回收率(100.6±1.6)%(99.66%～ 102.4%), 血浆萃取回收率(83.6±2.4)%(81.70%～ 86.35%),日内和日间 RSD
均小于 15%。检测限为0.6 ng , 最低血浆检测质量浓度为0.030 mg·L-1 。结论:该方法准确 、灵敏 , 适用于白消安血浆浓度测
定及其药动学研究。
[ 关键词] 　白消安;高效液相色谱法;血药浓度
[中图分类号] R969　　[ 文献标识码] A　　[ 文章编号] 1001-5213(2007)04-0458-04
Determination of busulfan in human plasma by HPLC with pre-colum derivatization
ZHANG Shan-tang ,FANG Yan ,QU Jian ,CHAN Xiang-qing ,SHEN Ai-zong ,SUN Yan-cai(Anhui P ro vincial
Hospital , Anhui Hefei 230001 , China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To develop an H PLC assay fo r de te rmination of busulfan concentr ation in human plasma.METH-
ODS　P lasma sam ples we re prepared by derivatization with sodium diethy ldithio carbamate(DDTC)and ex tracted w ith ethy l ac-
eta te , the ex tract wa s dried under nitr ogen and reconstituted with methanol prior to HPLC determina tion.Chromato gr aphy w as
accomplished using a NovaPak C18 ana ly tical colum(4 μm , 3.9 mm×150 mm)and mobile pha se of me thanol-wa te r(74∶26)at a
flow rate of 0.9 mL·min -1 with UV detection at 280 nm.RESULTS　Calibr ation cur ves w ere linear fr om 0.05 to 3.20 mg·L-1
(r=0.999 3 , n=9), the recovery of method w as (100.6±1.6)%(99.66%-102.4%), and the mean ex traction yield for
busulfan in plasma w as (83.6±2.4)%(81.70%-86.35%).The RSDs of intra- and inter-day were lower than 11.20% and
14.99%, respectiv ely.The limit of de tection w as 0.030 mg·L-1(signal- to noise ra tio of 6).CONCLUSION　The method is
sensitiv e and accurate f or the determination o f busulfan concentr ation in human plasma.I t is suitable for the pha rmacokine tics
study o f busulfan.
KEY WORDS:busulfan;H PLC;pla sma drug concentration
　　白消安(busulfan , Bu)是一种双功能烷化剂 ,
对造血祖细胞和多能干细胞具有细胞毒作用 ,通常
口服小剂量(2 ～ 8 mg·d-1)治疗慢性粒细胞白血
病。随着造血干细胞移植(hematopoietic stem cell
t ransplantat ion , HSCT)治疗恶性血液病的基础及
临床研究的深入 ,白消安主要用于 HSCT 前的预处
理 ,大剂量的白消安(1 mg·kg -1 ,q6 h×4 d)与环磷
酰胺(cyclophosphamide , Cy)组成的 BuCy 方案是
目前国际上异基因造血干细胞移植的标准预处理方
案 [ 1-2] 。国外研究表明 ,BuCy 方案的疗效和毒副作
用与白消安血浆浓度-时间曲线下面积(AUC)或稳
态血药浓度有密切关系 ,且白消安的药动学性质具
有显著的个体差异 ,因此开展白消安治疗药物监测
十分必要[ 3-4] 。
开展白消安治疗药物监测 ,首先必须建立灵敏 、
准确的血药浓度测定方法 。目前 ,国外用于白消安
血药浓度分析的方法主要是色谱法 ,包括气相色谱
法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)和高效液相色谱
法-质谱联用法(LC-MS)等[ 4-6] ,国内尚未见文献报
道。参考国外文献 ,本试验建立柱前衍生化的高效
液相色谱法 ,以用于测定异基因造血干细胞移植预
处理患者血浆白消安浓度。
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