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小花假泽兰的抑菌活性成分研究



全 文 :浙江大学学报(农业与生命科学版) 36(3):293~ 298 , 2010
Journal of Zhejiang University(Agric.& Life Sci.)
文章编号:1008-9209(2010)03-0293-06 DOI:10.3785/j.issn.1008-9209.2010.03.009
  收稿日期:2009-11-14
基金项目:公益性行业(农业)科研专项资助项目(200903052);陕西省农业科技攻关资助项目(2004K01-G7-02).
作者简介:庄世宏(1971—),男 ,陕西佳县人 , 副研究员 ,主要从事昆虫毒理及森林害虫防治研究.E-mail:zhuangshihong @
sina.com.
通信作者:冯俊涛 ,男 ,教授 ,主要从事农药学与植物保护学方面的教学与研究工作.E-mai l:jt feng@126.com.
小花假泽兰的抑菌活性成分研究
庄世宏1 , 郝彩琴2 , 冯俊涛1 , 张 兴1
(1.西北农林科技大学 无公害农药研究服务中心/陕西省生物农药工程技术研究中心 ,陕西杨凌 712100;
2.宁夏职业技术学院 生物工程系 ,宁夏 银川 750002)
摘 要:为研究小花假泽兰的抑菌活性成分 , 采用活性跟踪法对小花假泽兰的全株乙醇提取物进行分
离 , 并利用现代波谱技术(IR、1H-NM R和13C-NMR)对已分离的化合物进行结构鉴定.结果表明:从小
花假泽兰中分离出 4 种具有抑菌活性的化合物 ,分别为豆甾醇 、去氧薇甘菊内酯 、二氢薇甘菊内酯和 β-
谷甾醇.采用生长速率法和孢子萌发法测定其中 2 种化合物(去氧薇甘菊内酯和二氢薇甘菊内酯)对 8
种重要植物病原菌的抑制作用.结果表明:这 2种化合物对小麦纹枯病菌 、辣椒疫霉病菌和棉花立枯病
菌的菌丝生长抑制作用较强 , 100 mg L-1剂量下抑制率均在 90%以上;对小麦纹枯病菌的有效抑制中
浓度(EC50)分别为 5.61和 18.24 mg L -1;对辣椒疫霉病菌的 EC50分别为 13.88 和 12.84 mg L-1;对
番茄灰霉病菌孢子萌发的 EC50分别为 10.49和 34.68 mg L -1;对玉米大斑病菌孢子萌发的 EC50分别
为 48.79 和 75.47 mg L-1 .这 2 种化合物对农业植物病原菌的抑菌活性均为首次报道.
关 键 词:小花假泽兰;抑菌活性;去氧薇甘菊内酯;二氢薇甘菊内酯
中图分类号:S 436.421.1.3    文献标志码:A
ZHUANG Shi-hong1 , HAO Cai-qin2 , FENG Jun-tao1 , ZH ANG Xing 1(1 .Research and Deve lopment
Center o f Biorational Pesticide/Technology and Engineering Center of Biopesticide , Shaanx i
Province , Northwest A &F University , Yangling , Shaanx i 712100 , China;2 .Department o f B io-
engineering , Ning xia Prof essional and Technical College , Y inchuan 750002 , China)
Active antifungal components of Mikania micrantha H.B.K.Journal of Zhejiang Univ ersity (Agric. &
Life Sci.), 2010 , 36(3):293-298
Abstract:I n o rder to study the antifungal components of Mikania micrantha H .B.K , fo ur compounds
w ere iso lated from ethano l e xtr acts of whole-plant M.micrantha based on bio activity-guided iso la tion ,
and their chemical structures w ere identified as stigmaste rol (1), deoxymikano lide (2),
dihydromikano lide(3) and β-sito stero l (4)by spectral methods (IR , 1 H-NMR , 13 C-NM R).The
fung icidal activities o f compounds (2) and (3)w ere tested in v itro.Results show ed that they had
definite inhibito ry effect ag ainst the mycelium grow th of Rhizoctonia cerealis Vander H oeven ,
P hy tophthora capsici Leon and Rhizoctonia solani , and the inhibition ra te s were bo th over 90% under
the concentr ation of 100 mg L-1 , and the median effectiv e concent ration (EC50) values against the
mycelium g row th of R.cerea lis w ere 5.61 and 18.24 mg L-1 , P.capsici being 13.88 and 12.84 mg
浙江大学学报(农业与生命科学版)
L-1 , respectiv ely.Compounds (2)and(3)had strong inhibitory effect ag ainst the spo re germina tion of
Botry tis cinerea Pe rs.et T ris with an EC50 value of 10.49 and 34.68 mg L-1 , and E xserohilum
turcicum (Pass)Leonard with an EC50 va lue of 48.79 and 75.47 mg L-1 , respectively.In addition , this
is the first repor t on the fungicidal activities of com pounds(2)and (3).
Key words:Mikania micrantha H.B.K;antifungal activ ity;deoxymikanolide;dihydromikano lide
  小花假泽兰(Mikania micrantha H .B.
K.)又名小花蔓泽兰 、薇甘菊等 , 属菊科
(Asteraceae)假泽兰属(Mikania).该植物原产
于中美洲和南美洲 , 20世纪 80年代末传入内
伶仃岛地区 ,目前广泛分布于深圳 、珠海 、广州 、
东莞 、番禺 、内伶仃岛等地[ 1] ,它生长迅速 、破坏
力强 ,故有植物杀手之称[ 2-3] .在民间被广泛
用来治疗创伤 、痢疾 、癌症 、霍乱 、毒蛇咬伤等疾
病[ 4] .近年来对其在防治农业病虫害方面的作
用日益得到研究者的重视.张茂新等[ 5] 就小花
假泽兰挥发油对昆虫生物活性进行了研究 ,结
果表明 ,小花假泽兰挥发油对小菜蛾 、黄曲条跳
甲和猿叶虫有显著的产卵驱避作用 ,同时也具
有一定的触杀毒力;祝木金等[ 6] 的研究表明 ,小
花假泽兰乙醇提取物对农业病原菌有一定的抑
制作用;余鑫平等[ 7] 采用活性跟踪法从小花假
泽兰茎叶乙醇提取物中分离到有一定抑菌作用
的豆甾醇和 β-谷甾醇.本文拟采用活性示踪法
对小花假泽兰全株抑菌活性成分进行分离鉴
定 ,旨在寻求其中结构新颖的高活性抑菌成分 ,
为进一步应用提供依据.
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 植物样品   小花假泽兰(Mikania
micrantha H.B.K.)全株于 2005年 10月采自
广东省东莞市 ,室温自然晾干 ,粉碎后低温保存
备用.
1.1.2 供试病菌  番茄灰霉病菌(Botry tis
cinerea Pers. et Tris), 玉 米 大 斑 病 菌
(Exserohilum turcicum (Pass)Leonard),苹果炭
疽病菌(Glomerel la cingulata Schr.et Spauld),小
麦 纹 枯 病 菌 (Rhizoctonia cerealis Vander
Hoeven),辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici
Leon),白菜黑斑病菌(Alternaria brassicae),番
茄早疫病菌(Alternaria solani),棉花立枯病菌
(Rhizoctonia solani)均由西北农林科技大学无公
害农药研究服务中心提供.
1.2 仪器与试剂
  R205B型旋转薄膜蒸发仪(上海申生科技
有限公司);ZF-1型三用紫外分析仪(上海市宝
山区顾村电光仪器厂);X-6型数字显示显微熔
点测定仪(北京泰克仪器有限公司);柱色谱硅
胶及薄层层析硅胶(青岛海洋化工厂);葡聚糖
凝胶 Sephadex LH-20(日本 YMC公司).豆甾
醇 、β-谷甾醇标样均由西北农林科技大学无公
害农药研究服务中心提供.
1.3 实验方法
1.3.1 提取与分离  采用活性跟踪法提取
分离小花假泽兰中的抑菌活性物质 ,测试提取
分离过程中不同萃取段或分离段对番茄灰霉病
菌和小麦纹枯病菌的抑制作用 ,每次选取活性
相对较高的部分进行下一步分离.具体提取分
离过程如下:
  将 90 kg 小花假泽兰全株粉碎 ,分批在反
应釜中用工业乙醇常温搅拌提取 ,减压浓缩得
乙醇浸膏.乙醇浸膏用水悬浮后依次用重蒸工
业石油醚(60 ~ 90 ℃)、氯仿 、乙酸乙酯和正丁
醇萃取 ,各溶剂萃取 4次 ,分别减压浓缩回收溶
剂得各浸膏.活性测定结果表明氯仿萃取段对
番茄灰霉病菌和小麦纹枯病菌的抑制作用较
高 ,因此 ,取氯仿萃取段浸膏280 g ,经硅胶干柱
层析 , 石油醚 ∶乙酸乙酯(体积比为 100 ∶
0 , 90∶10 ,80∶20 , , 10∶90 , 0∶100)梯度洗
脱 ,收集 203个馏分 ,经 TLC检测 ,紫外灯和碘
显色归类合并 ,最后得 F1 ~ F18 部分.对活性
较高的 F3 、F4 、F5 部分分别做进一步的分离 ,
分离过程如下:F3(5.11 g)经凝胶柱层析 ,
氯仿∶丙酮(1∶1)洗脱除去部分色素 ,后用氧
294 第 3 6卷 
庄世宏 ,等:小花假泽兰的抑菌活性成分研究
化铝柱层析 ,石油醚∶丙酮(体积比为 100∶0 ,
90∶10 ,80∶20 , , 10∶90 ,0∶100)梯度洗脱 ,
T LC检测 、紫外灯和碘显色合并 ,然后经丙酮
和石油醚重结晶得化合物 1(740 mg);F4
(39.81 g)经硅胶柱层析 ,氯仿∶乙酸乙酯 (体
积比为 100∶0 , 90∶10 , 80∶20 , , 10∶90 ,
0∶100)梯度洗脱 , TLC 检测 、紫外灯和碘显
色合并得 H1 ~ H6 部分 , H1 和 H2 分别经多
次硅胶柱层析后 ,再经 Sephadex LH-20凝胶
柱纯化得白色针状结晶化合物 2(40 mg)和化
合物 3(580 mg);F5(3.1 g)经反复硅胶柱层
析 ,然后经 Sephadex LH-20凝胶柱纯化 ,最后
得白色针状结晶化合物 4(12 mg).将 4个化合
物通过测定其物理数据和波谱数据 ,并参照文
献确定其化学结构.
1.3.2 抑菌活性测定
  1)生长速率法.采用生长速率法[ 8] 测定化
合物 2 和 3对供试病原菌菌丝生长抑制作用.
将化合物用一定量的丙酮配制成 200 mg L-1
供试样品 ,再用融化的 PDA 培养基将供试样
品稀释成 10 、50和 100 mg L-1的含毒培养基 ,
分别取 10 mL 含毒培养基倒入直径 9.0 cm 的
灭菌培养皿内 ,制成平板 ,以加丙酮培养基的
PDA 平板为对照 ,再将病原菌菌饼(Υ=4 mm)
置于平板中央 ,于 28 ℃培养 3 ~ 7 d ,用十字交
叉法测量供试病原菌菌落生长直径 ,每处理 3
次重复.根据公式(1)和(2)计算菌丝生长抑
制率:
  菌落生长直径/mm =2次直径平均值-菌
饼直径(4.0); (1)
  菌丝生长抑制率=(对照菌落生长直径-
处理菌落生长直径)/对照菌落生长直径 ×
100%. (2)
  2)孢子萌发法.采用凹玻片法[ 8-9] 测定化合
物 2和 3 对供试病原菌孢子萌发的抑制作用.
将培养好的病原菌孢子用无菌水从培养基上洗
脱 ,用多层纱布过滤除去病菌菌丝 ,制成孢子悬
浮液.孢子浓度以在显微镜下观察时每视野的
分生孢子量为 20 ~ 30个为宜.将化合物用一定
量的丙酮配制成 200 mg L-1供试样品 ,再将供
试样品以孢子悬浮液稀释成梯度浓度 ,设空白
对照.将配制的混合液滴加于凹玻片的凹槽处 ,
每个浓度重复 3 次 ,将滴加好混合液的载玻片
放在保湿的培养皿中 ,置于 22 ~ 25 ℃培养室
中 ,4 h后开始检查萌发率.按照公式(3)和(4)
计算萌发率及抑制率.
  萌发率 =孢子萌发数/检查孢子总数 ×
100%; (3)
  抑制率=(对照萌发率-处理萌发率)/对
照萌发率×100%. (4)
2 结果与分析
2.1 化合物结构鉴定
  化合物 1:白色针状结晶 , mp 213 ~ 214 ℃,
[α] D25-42°与豆甾醇标样混合熔点不下降 ,在 3
种展开剂系统下 R f 值相同.IR(KBr):3 429 ,
2 958 ,2 865 , 1 641 , 1 465 , 1 378 cm-1;1H-NMR
(400 MHz ,CDCl3)δ:0.69(s ,18-CH3), 0.78(d ,
27-CH3), 0.80(t , 29-CH3), 0.83(d , 26-CH3),
1.01(s , 19-CH3), 1.04(d , 21-CH 3), 5.03(d , H-
23),5.13(d , H-22), 5.35(m , H-6), 3.53(m , H-
3).根据其物理数据与参考文献[ 7-10] ,确定化
合物 1为豆甾醇.
  化合物 2:白色针状结晶 , C15H 16O 5 , mp
94.3 ~ 96.2 ℃ ,易溶于氯仿 ,可溶于甲醇 、丙
酮 、乙酸乙酯等溶剂 , IR(KBr):3 455 , 3 088 ,
1 753 ,1 660 ,1 413 ,1 389 , 1 367 cm-1 ;13C NMR
(CDCl3 ,100 MHz)δ:171.3(C-12), 167.4(C-
15),146.1(C-5), 136.3(C-4), 133.7(C-11),
123.7(C-13),81.3(C-6), 78.0(C-8), 61.7(C-
1),50.3(C-7),43.7(C-9),22.6(C-2), 22.1(C-
3),20.1(C-14);1H NM R(CD3C l , 100 MHz)
δ:7.43(1H , br , H-5), 6.49(1H , dd , J=4 , H-
13a), 5.94(1H , dd , J =2.8 , H-13b), 5.28
(1H ,brs , H-6), 4.51(1H , m , H-8),3.41(1H ,
m , H-7).根据以上物理数据和波谱数据并参考
文献[ 11] ,确定化合物 2为去氧薇甘菊内酯.
  化合物 3:白色针状结晶 , C15 H16 O6 , mp
194.3 ~ 196.2 ℃,易溶于甲醇 ,可溶于丙酮 、乙
酸乙酯等溶剂 , 13C NMR(CD3OD ,100 MHz)δ:
178.0(C-12), 172.6(C-15), 149.5(C-5), 136.5
(C-4), 82.1(C-6), 79.2(C-8), 69.4(C-1), 69.4
(C-3),62.8(C-2), 58.9(C-10), 55.3(C-7), 44.3
295 第 3期
浙江大学学报(农业与生命科学版)
(C-9), 41.2(C-11), 21.45(C-14), 13.5(C-13);
1
H NMR(CD3OD ,100 MHz)δ:7.89(1H , br ,
H-5), 5.32(1H , br , H-6), 4.61(1H , m , H-
7), 3.1(1H , d , 9.64 , H-7), 2.06(1H , m , H-
7), 1.26(3H , br , H-13 , —CH3).根据上述物
理数据和波谱数据并参考文献[ 11] ,确定化合物
3为二氢薇甘菊内酯.
  化合物 4:白色针状结晶 , C29 H 50O , mp
144 ~ 146 ℃,与 β-谷甾醇标样混合熔点不下
降 ,与标样 TLC 对比在 3种展开剂系统下 R f
值相同 ,故确定化合物 4 为 β-谷甾醇.化合物
1 ~ 4的结构见图 1.
图 1 化合物 1 ~ 4 的结构式
Fig.1 C hemical s t ru cture of com pounds 1-4
2.2 化合物 2和 3的抑菌活性测定
2.2.1 对 8种供试病原菌菌丝生长的抑制作
用  化合物 2和 3均具有较强和较广谱的抑
菌活性(表 1 ,表 2),对供试病原菌有一定的抑制
效果 ,但对不同病原菌抑制效果不同.化合物 2
在100 mg L-1剂量下 ,对小麦纹枯病菌 、辣椒疫
霉病菌 、棉花立枯病菌 、苹果炭疽病菌抑制作用
较强 ,抑制率均在 90%以上;其次对番茄灰霉病
菌和番茄早疫病菌抑制率均在 70%以上;但对
玉米大斑病菌 、白菜黑斑病菌等病原菌的抑制活
性较低 ,分别为 56.7%和 60.5%(表 1).
  化合物 3亦对供试病原菌均有一定的抑制
效果(表 2),但对不同病原菌抑制效果存在差
异.其对小麦纹枯病菌 、辣椒疫霉病菌 、番茄灰
霉病菌抑制作用较强 , 100 mg L -1剂量下抑制
表 1 化合物 2 对 8 种供试病菌菌丝生长的抑制作用
T ab le 1 Fungicidal activi ty of compound 2 against mycelium
grow th of eight pathogens %
供试菌种 抑制率
10 mg L -1 50 mg L-1 100 m g L -1
白菜黑斑病菌 0.0 55.3 60.5
番茄早疫病菌 15.9 62.8 72.9
番茄灰霉病菌 42.3 62.3 88.0
棉花立枯病菌 42.3 96.5 100.0
小麦纹枯病菌 52.6 100.0 100.0
玉米大斑病菌 4.1 29.7 56.7
苹果炭疽病菌 22.1 57.9 94.2
辣椒疫霉病菌 45.5 100.0 100.0
率均在 90%以上;但对番茄早疫病菌 、棉花立
枯病菌 2种病原菌的抑制活性较差 , 100 mg
L
-1剂量下抑制率均低于 50%.
296 第 3 6卷 
庄世宏 ,等:小花假泽兰的抑菌活性成分研究
表 2 化合物 3 对 8 种供试病菌菌丝生长的抑制作用
Table 2 Fungicidal activity of com pound 3 again st m ycelium
grow th of eigh t pathogens %
供试菌种 抑制率
10 mg L-1 50 m g L -1 100 mg L -1
白菜黑斑病菌 0.0 42.3 57.0
番茄早疫病菌 0.0 33.3 42.9
辣椒疫霉病菌 22.5 74.3 100.0
棉花立枯病菌 0.0 9.4 34.8
苹果炭疽病菌 21.8 45.5 72.7
玉米大斑病菌 19.2 39.7 55.1
小麦纹枯病菌 50.6 100.0 100.0
番茄灰霉病菌 25.4 48.7 91.4
2.2.2 化合物 2 和 3对 4种供试病原菌菌丝
生长的抑制毒力  采用生长速率法进一步测
试化合物 2和 3对番茄灰霉病菌 、辣椒疫霉病
菌 、小麦纹枯病菌和苹果炭疽病菌的抑制毒力 ,
结果见表 3.化合物 2对供试病原菌均有较强
的毒力 ,且对不同病菌的毒力存在差异 ,对 4种
病菌的 EC50在 5.61 ~ 18.55 mg L-1之间 ,对
小麦纹枯病菌 、辣椒疫霉病菌 、苹果炭疽病菌和
番茄灰霉病菌的 EC50依次为 5.61 、13.88 、
14.46和 18.55 mg L-1 .
  与化合物 2对病菌的毒力相比 ,化合物 3
的活性则相对较弱.在供试的 4种病菌中 ,仅对
辣椒疫霉病菌的毒力与化合物 2 相当 , EC50为
12.84 mg L -1 ,对番茄灰霉病菌 、小麦纹枯病
菌和苹果炭疽病菌的毒力仅为化合物 2 的
1/3 ~ 1/4.
2.2.3 化合物 2和 3对 2 种供试病原菌孢子
萌发的抑制毒力  化合物 2和 3对 2种供试
病原菌的抑制作用强弱不同(表 4),化合物 2
的 EC50高于化合物 3.化合物 2对番茄灰霉病
菌和玉米大斑病菌孢子的 EC50分别为 10.49
和 48.79 mg L -1;化合物 3对 2种病原菌孢子
的 EC50分别为 34.68和 75.47 mg L-1 .
表 3 化合物 2 和 3 对 4 种供试病原菌菌丝生长的抑制毒力(4 d)
Tab le 3 Ant ifungal vi ru len ce of comp ound 2 and 3 agains t mycelium grow th of fou r pathogen s(4 d)
化合物 供试病原菌 毒力回归线 EC50(EC50 95%置信区间)/(mg L -1) 相关系数
化合物 2
辣椒疫霉病菌 Y =3 .1444+1.6243 x 13.88(10.76~ 18.71) 0.9234
番茄灰霉病菌 Y =2 .2112+2.1988 x 18.55(15.32~ 26.47) 0.9475
小麦纹枯病菌 Y =3 .0810+2.5622 x 5.61(4.31~ 8.58) 0.9648
苹果炭疽病菌 Y =2 .9844+1.7373 x 14.46(10.41~ 21.74) 0.9148
化合物 3
辣椒疫霉病菌 Y =2 .2862+2.4480 x 12.84(9.32~ 18.47) 0.9873
番茄灰霉病菌 Y =1 .7701+1.8457 x 56.23(50.38~ 70.27) 0.9884
小麦纹枯病菌 Y =0 .9022+3.2496 x 18.24(14.13~ 22.54) 0.9983
苹果炭疽病菌 Y =1 .2798+2.0624 x 63.65(53.54~ 84.69) 0.9706
表 4 化合物 2和 3对 2 种供试病原菌孢子萌发的抑制毒力
Table 4 Anti fungal virulence of compound 2 and 3 against spore bourgeon of tw o path ogens
化合物 供试病原菌 毒力回归线 EC50(EC 50 95%置信区间)/(m g L -1) 相关系数
化合物 2
玉米大斑病菌 Y =1 .8874+1.8436 x 48.79(31.14~ 59.26) 0.9954
番茄灰霉病菌 Y =3 .3987+1.5687 x 10.49(7.09~ 17.96) 0.9994
化合物 3
玉米大斑病菌 Y =1 .7556+1.7278 x 75.47(52.23~ 109.56) 0.9786
番茄灰霉病菌 Y =1 .9560+1.9765 x 34.68(38.02~ 31.82) 0.9754
3 讨 论
  本文在前期研究基础上 ,从小花假泽兰乙
醇提取物中分离到 2个对多种供试病原菌具有
较高抑菌活性的倍半萜内酯化合物(去氧薇甘
菊内酯和二氢薇甘菊内酯).许多研究证实倍半
萜内酯化合物是一类重要的生物活性物质 ,在
297 第 3期
浙江大学学报(农业与生命科学版)
医药上具有抗肿瘤 、抗疟疾[ 12] , 抗炎 、抗真
菌[ 13]活性;在农业上对小菜蛾 、蚜虫等害虫具
有拒食活性 、忌避和生长发育抑制活性[ 14] .因
此 ,在此基础上如对该类化合物进行结构修饰 、
衍生合成及其结构与活性关系等方面进行更为
深入系统的探讨 ,将有望开发出新型高效杀菌
剂品种.
  本研究只对分离到的薇甘菊内酯类化合物
进行了相关的抑菌活性测试 ,而前期成分预试
显示小花假泽兰中还含有香豆素类 、烷烃类 、黄
酮类等化合物 ,并且前期对其精油的抑菌活性
作了初步研究 , 发现其精油有较好的抑菌活
性[ 15] .因而对小花假泽兰中杀菌化学成分及其
杀菌作用的进一步深入研究 ,有可能发现活性
更高的抑菌成分.
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