全 文 :收稿日期:2012-12-20
基金项目:国家自然科学基金项目(30800764)
作者简介:张毅华(1990-),男,山西太原人,在读本科生,研究方向:植物生物学。E-mail:569195257@qq.com
*通讯作者:崔 瑾(1974-),女,江苏镇江人,副教授,博士,主要从事植物发育生物学研究。
E-mail:cuijin@njau.edu.cn
硝酸铵和植物生长调节剂对花烛愈伤诱导
和植株再生的影响
张毅华,唐 丽,谷艾素,崔 瑾*
(南京农业大学 生命科学学院,江苏 南京210095)
摘要:以花烛(Anthurium andraeanumLind.)品种阿拉巴马和塞拉叶片为外植体,研究硝酸铵和
植物生长调节剂对花烛愈伤组织诱导及植株再生的影响。结果表明,将硝酸铵用量减少至 MS配
方量的1/4时,阿拉巴马和塞拉叶片愈伤诱导率分别显著提高285.9%和458.5%;叶片愈伤组织
诱导的最适培养基为改良 MS(1/4NH4NO3)+TDZ 0.4mg/L+2,4-D 1.0mg/L;不定芽分化和
试管苗增殖的最适培养基为1/2MS+6-BA 0.2mg/L+KT 0.5mg/L,添加适量生长素(IBA 0.2
mg/L)有利于试管苗生长。
关键词:植物生长物质;花烛;愈伤组织;植株再生
中图分类号:S682 文献标志码:A 文章编号:1004-3268(2013)04-0125-05
Effects of NH4NO3and Plant Growth Regulator on
Calus Induction and Plant Regeneration from
Anthurium andraeanumLind.
ZHANG Yi-hua,TANG Li,GU Ai-Su,CUI Jin*
(Colege of Life Sciences,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)
Abstract:Effects of NH4NO3and plant growth regulator on calus induction and plant regenera-
tion fromAnthurium andraeanumLind.were studied,with the leaves of Anthurium andreaenum
cultivars Alabama and Sierra as explants.The results showed that,when the amount of NH4NO3
was reduced to 1/4in the MS medium,the frequencies of calus induction of both cultivars were
significantly increased by 285.9%and 458.5%respectively.The optimum culture medium for leaf
calus induction was modified MS medium(1/4NH4NO3)supplemented with 0.4mg/L TDZ and
1.0mg/L 2,4-D.The optimum medium for adventitious bud induction and plantlet multiplication
was 1/2MS+0.2mg/L 6-BA+0.5mg/L KT.Addition of 0.2mg/L IBA was beneficial to plant-
let growth.
Key words:plant growth regulator;Anthurium andraeanum;calus;plant regeneration
花烛(Anthurium andraeanum Lind.)又名红
掌、安祖花,为天南星科花烛属多年生草本植物,具
有较高的观赏价值,现已经成为仅次于热带兰的第
二大热带花卉商品[1]。最早花烛繁殖主要利用实生
繁殖和分株繁殖,但存在种子不易获得、繁殖速度缓
慢等问题。自1974年Pierik等[2]成功建立花烛离
体培养技术以来,利用组织培养技术进行花烛种苗
生产已成为一种快速有效的繁殖方式[3-5]。
植物生长物质在植物组织培养中起着重要的调
节作用。愈伤组织诱导一般需要细胞分裂素与生长
河南农业科学,2013,42(4):125-129
Journal of Henan Agricultural Sciences
DOI:10.15933/j.cnki.1004-3268.2013.04.038
素结合使用[6-10],但也有单独使用细胞分裂素诱导
愈伤组织的报道[6]。目前,在花烛的组织培养中发
现,使用6-BA和KT[11-12]以及2,4-D[10]具有显著效
应。而采用具有细胞分裂素活性的新型植物生长调
节剂噻二唑苯基脲(TDZ)对花烛进行离体培养的报
道还较少,且结果不完全相符。黄群声[13]研究表
明,TDZ与6-BA适当配比有利于花烛外植体的脱
分化。而徐彬[14]研究表明,单独使用TDZ或TDZ
结合 KT导致外植体褐化,不能诱导出愈伤组织。
赵云鹏等[15]发现,TDZ诱导花烛愈伤组织分化芽的
效果显著高于6-BA。徐彬[14]研究发现,添加TDZ
导致花烛腋芽发生畸形,叶黄化,且不利于腋芽的发
生。花烛不同品种间基因型差异大,有关硝酸铵含
量及植物生长物质对不同品种花烛离体发育影响的
研究报道较为鲜见。以花烛2个重要栽培品种阿拉
巴马和塞拉为材料,着重研究硝酸铵含量和TDZ质
量浓度对花烛愈伤组织诱导以及不同生长调节剂配
比对其不定芽分化、试管苗增殖生长的影响,以改善
花烛组织培养条件,优化快繁体系,提高花烛种苗的
生产效率。
1 材料和方法
1.1 材料
花烛品种阿拉巴马和塞拉购买于南京市仙林花
卉物流中心。取完全展开的幼嫩叶片(保留中脉),
置于75%乙醇中30s,无菌水洗5次,再置于5%次
氯酸钠中灭菌15min,无菌水洗5次,用无菌吸水纸
吸干后备用。试验所用培养基均添加蔗糖30g/L、琼
脂6g/L,高压灭菌前调节pH值至5.8,植物生长调
节剂采用过滤灭菌。培养温度为(25±2)℃。
1.2 方法
1.2.1 硝酸铵含量对花烛愈伤组织诱导的影响
取2个花烛品种灭菌后的叶片,切割成1cm2 方
块,分别接种于含有全量 NH4NO3(1 650mg/L)、
1/2NH4NO3、1/4NH4NO3、1/6NH4NO3、1/8NH4NO3
的愈伤组织诱导培养基 MS+6-BA 1.0mg/L+
2,4-D 0.1mg/L中,置于黑暗培养,2个月后观察
并统计愈伤组织发生情况。
1.2.2 TDZ质量浓度对花烛愈伤组织诱导的影响
以改良 MS(将 MS基本培养基中NH4NO3 含量
减少至原用量的1/4)为基本培养基,取2个花烛品
种灭菌后的叶片,切割成1cm2 方块,接种于含有不
同质量浓度TDZ(0.05、0.2、0.4、0.6mg/L)的愈伤
组织诱导培养基中,置于黑暗培养,2个月后观察并
统计愈伤组织发生情况。
1.2.3 植物生长调节剂配比对花烛愈伤组织诱导的
影响 以改良 MS为基本培养基,取2个花烛品种灭
菌后的叶片,切割成1cm2 方块,接种于含有不同生
长调节剂的愈伤诱导培养基中:(1)TDZ 0.4mg/L+
2,4-D 1.0mg/L;(2)TDZ 0.4mg/L+2,4-D 1.0mg/
L+KT 0.5mg/L;(3)TDZ 0.4mg/L+2,4-D 1.0
mg/L+6-BA 0.5mg/L;(4)6-BA 0.5mg/L+2,4-D
1.0mg/L+KT 0.5mg/L,置于黑暗培养,2个月后
观察并统计愈伤组织发生情况,计算愈伤组织诱导
率,愈伤组织诱导率=(出愈外植体数/接种外植体总
数)×100%。
1.2.4 植物生长调节剂配比对花烛不定芽分化的影
响 以1/2MS(MS大量元素减半,微量元素、铁盐和
有机成分同 MS)为基本培养基,将诱导出的愈伤接种
于含有不同植物生长调节剂的不定芽分化培养基中:
(1)6-BA 0.2mg/L+ KT 0.5mg/L;(2)6-BA 0.2
mg/L+IBA 0.2mg/L;(3)6-BA 0.2mg/L+NAA
0.2mg/L;(4)KT 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L;
(5)KT 0.2mg/L+IBA 0.2mg/L;(6)6-BA 0.2mg/
L+IBA 0.2mg/L+KT 0.5mg/L;(7)6-BA 0.2mg/
L+NAA 0.2mg/L+KT 0.5mg/L,置于40μmol/
(m2·s)光下培养,光照时间12h/d,1个月后统计不
定芽的发生情况,计算不定芽分化率,不定芽分化率
=(分化出不定芽的愈伤数/接种愈伤总数)×100%。
1.2.5 植物生长调节剂配比对花烛试管苗增殖的影
响 以1/2MS为基本培养基,将花烛阿拉巴马试管
苗接种于含有不同植物生长调节剂的培养基中:
(1)6-BA 0.2mg/L+KT 0.5mg/L;(2)6-BA 0.2
mg/L+IBA 0.2mg/L;(3)6-BA 0.2mg/L+IBA 0.2
mg/L+KT 0.1mg/L;(4)6-BA 0.2mg/L+IBA 0.2
mg/L+KT 0.5mg/L;(5)KT 0.2mg/L+NAA 0.1
mg/L;(6)KT 0.2mg/L+IBA 0.1mg/L,置于40
μmol/(m
2·s)光下培养,光照时间12h/d,1个月后
统计试管苗增殖情况。增殖系数=(结束培养时的苗
数-接种时的苗数)/接种时的苗数。
1.3 数据处理
采用Excel 2003进行数据处理,SPSS 16.0进行
方差分析,邓肯氏新复极差法[16]检验差异显著性。
2 结果与分析
2.1 硝酸铵含量对花烛愈伤组织诱导的影响
由表1看出,当NH4NO3含量减至原来的1/4时,
阿拉巴马、塞拉2个花烛品种的愈伤组织诱导率均达
到最高,分别为91.00%和88.92%,比全量NH4NO3
处理显著提高285.9%和458.5%。全量NH4NO3 处
621 河南农业科学 第42卷
理下愈伤组织诱导率均显著低于其他处理。
表1 不同硝酸铵含量对花烛愈伤组织诱导率的影响 %
NH4NO3含量 阿拉巴马 塞拉
全量NH4NO3 23.58±6.15d 15.92±4.14d
1/2NH4NO3 49.33±11.81c 43.08±10.56c
1/4NH4NO3 91.00±3.88a 88.92±4.00a
1/6NH4NO3 86.17±4.25ab 82.67±5.75ab
1/8NH4NO3 63.92±12.83bc 61.83±11.26bc
注:同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05),下同。
2.2 TDZ质量浓度对花烛愈伤组织诱导的影响
叶片外植体培养3周后体积开始增大,叶片明
显变绿,外植体呈卷曲状。1个月后叶片切口处开
始长出黄绿色愈伤组织,随后愈伤组织不断增殖。
从表2可以发现,当 TDZ质量浓度为0.4mg/L
时,2个花烛品种外植体的愈伤诱导率最高,且生长
迅速,增殖明显(图1-2)。TDZ质量浓度较高时
(0.6mg/L),外植体出现褐化现象。
表2 不同质量浓度TDZ对花烛愈伤
组织诱导率的影响 %
TDZ质量浓度/(mg/L) 阿拉巴马 塞拉
0.05 41.67±4.17c 33.33±3.86c
0.2 58.33±6.30bc 50.00±6.68bc
0.4 83.33±4.98a 77.78±7.03a
0.6 66.67±7.39ab 58.33±6.30b
A.叶片边缘脱分化出浅黄色愈伤组织;B.愈伤组织增殖;C.愈伤组织再分化出红色不定芽;
D.不定芽形成丛生苗;E.丛生苗增殖;F.再生植株
图1 花烛阿拉巴马离体形态建成
a.叶片边缘脱分化出浅黄色愈伤组织;b.愈伤组织增殖;c.愈伤组织再分化出绿色不定芽;
d.不定芽形成丛生苗;e.丛生苗增殖;f.再生植株
图2 花烛塞拉离体形态建成
721 第4期 张毅华等:硝酸铵和植物生长调节剂对花烛愈伤诱导和植株再生的影响
2.3 植物生长调节剂配比对花烛愈伤诱导组织的
影响
从表3可以看出,0.4mg/L TDZ+1.0mg/L
2,4-D对花烛愈伤组织诱导效果较好,愈伤组织诱导率
最高,其中阿拉巴马的愈伤组织诱导率高达93.75%。
其他植物生长调节剂处理也能诱导出愈伤组织,但是
愈伤组织诱导率低于上述培养基。在相同培养条件
下,阿拉巴马的愈伤组织诱导率高于塞拉。
表3 不同植物生长调节剂对花烛愈伤组织诱导率的影响 %
植物生长调节剂及其质量浓度/(mg/L) 阿拉巴马 塞拉
TDZ 0.4+2,4-D 1.0 93.75±4.09a 50.00±6.68a
TDZ 0.4+2,4-D 1.0+KT 0.5 77.08±5.16c 28.57±6.52b
TDZ 0.4+2,4-D 1.0+6-BA 0.5 75.00±6.68c 31.25±6.25ab
6-BA 0.5+2,4-D 1.0+KT 0.5 85.42±5.62ab 28.57±6.52b
2.4 植物生长调节剂配比对花烛不定芽分化的影响
培养4周后,愈伤组织体积逐渐增大,形成紧密
的愈伤块。2周后阿拉巴马愈伤组织中再分化出红
色不定芽,塞拉愈伤中再分化出绿色不定芽(图1-
2)。由表4可见,在所有植物生长调节剂处理中,2
个品种花烛不定芽分化率均为100%。愈伤分化芽
数以处理6-BA 0.2mg/L+KT 0.5mg/L和6-BA
0.2mg/L+IBA 0.2mg/L+KT 0.5mg/L较高,
其次为处理6-BA 0.2mg/L+NAA 0.2mg/L+
KT 0.5mg/L。
表4 不同植物生长调节剂对花烛不定芽分化的影响
植物生长调节剂及其
质量浓度/(mg/L)
阿拉巴马
不定芽
分化率/%
愈伤组织分化
芽数/(个/块)
塞拉
不定芽
分化率/%
愈伤组织分化
芽数/(个/块)
6-BA 0.2+KT 0.5 100 24.9±2.3a 100 24.7±1.9a
6-BA 0.2+IBA 0.2 100 15.8±1.8bc 100 12.7±1.1c
6-BA 0.2+NAA 0.2 100 13.2±1.5cd 100 11.2±1.3cd
KT 0.2+NAA 0.2 100 10.6±1.1d 100 9.0±1.2d
KT 0.2+IBA 0.2 100 10.1±1.2d 100 8.5±1.5cd
6-BA 0.2+IBA 0.2+KT 0.5 100 22.3±2.1a 100 21.5±1.5ab
6-BA 0.2+NAA 0.2+KT 0.5 100 19.9±1.8ab 100 19.6±1.6b
2.5 植物生长调节剂配比对花烛试管苗增殖的
影响
由表5可知,6-BA 0.2mg/L+KT 0.5mg/L处
理试管苗的增殖系数最高,为5.23,显著高于其他处
理,其次是6-BA 0.2mg/L+IBA 0.2mg/L+KT 0.5
mg/L。在6-BA存在的条件下,KT能够提高试管苗
的增殖系数;6-BA不存在时,KT对试管苗的增殖效
果不明显。可见,6-BA和KT同时存在时花烛试管
苗的增殖系数较高。6-BA 0.2mg/L+IBA 0.2mg/
L+KT 0.1mg/L和6-BA 0.2mg/L+IBA 0.2mg/L
+KT 0.5mg/L处理下试管苗的株高和叶面积较
大且显著高于其他处理,可见培养基中添加适量
的生长素(IBA 0.2mg/L)有利于试管苗的生长。
表5 植物生长调节剂配比对花烛试管苗增殖、生长的影响
植物生长调节剂
及其质量浓度/(mg/L)
增殖系数 株高/cm 叶面积/cm2 根数/个
6-BA 0.2+KT 0.5 5.23±0.27a 4.73c 4.56b 8a
6-BA 0.2+IBA 0.2 3.90±0.45b 5.14b 4.36c 7a
6-BA 0.2+IBA 0.2+KT 0.5 4.66±0.26ab 6.45a 5.10a 6ab
6-BA 0.2+IBA 0.2+KT 0.1 4.11±0.38b 6.35a 4.99a 5b
KT0.2+NAA 0.2 1.46±0.18c 4.14e 2.85d 7a
KT0.2+IBA 0.2 1.62±0.25c 4.31d 2.80d 4c
3 结论与讨论
本试验结果表明,培养基组分中的NH4NO3 含
量影响愈伤组织诱导率的高低。当NH4NO3 含量降
至原来的1/4或1/6时,愈伤诱导率明显高于其他处
理。有研究结果表明,低质量浓度的氨盐对很多红掌
愈伤组织诱导有利,206~825mg/L较为合适,大于
825mg/L或小于206mg/L将不利于愈伤组织的诱
导[17]。本试验结果与此报道相符,这可能是由于高
浓度的NH4NO3 容易引起叶片的褐化,从而导致愈
伤诱导率低[18]。
TDZ是具有细胞分裂素活性的苯基脲衍生物,比
821 河南农业科学 第42卷
细胞分裂素活性高。有研究表明,TDZ对愈伤组织诱
导具有很高的活性[13,19-21]。本试验结果表明,单独使用
TDZ能够诱导2个品种花烛叶片产生愈伤,且当TDZ
为0.4mg/L时,愈伤组织诱导率均最高。不同生长调
节剂配比试验结果表明:TDZ 0.4mg/L+2,4-D 1.0
mg/L对2个花烛品种愈伤组织诱导效果较好,这与
Yu等[22]认为TDZ既不适合单独使用,也不适合与
2,4-D配合使用进行花烛愈伤组织诱导的结论不相符,
可能是不同花烛品种对生长调节剂的反应不同所致。
此外,相同培养条件下阿拉巴马愈伤组织诱导率高于
塞拉,外植体更容易脱分化。试验中还发现,TDZ质量
浓度较高时(0.6mg/L)2个花烛品种的外植体均出现
褐化现象,可见TDZ质量浓度是外植体脱分化的关
键。
芽分化是影响花烛快繁效率的主要因素之一。
Lightbourn等[23]研究发现,6-BA是影响愈伤组织芽分
化最重要的植物生长调节剂。也有研究表明,不定芽
分化往往是多种植物生长调节剂相互平衡及协同作用
的结果,生长调节剂的比例尤为重要[18,24-25]。本研究发
现,试验所有处理均能诱导出不定芽,但是不同的生长
调节剂配比对不定芽的诱导效果不同。其中,同时添
加6-BA和KT的处理诱导效果最好,每块愈伤所形成
的不定芽数目最多,显著高于单独添加6-BA或KT的
处理,这与前人的研究结果一致[26-27]。可见,6-BA和
KT配合使用有利于促进花烛不定芽的形成。
试管苗增殖和生长效率是优化花烛快繁体系的重
要环节。6-BA比KT更有利于阿拉巴马试管苗的增
殖生长,培养基中同时添加6-BA和KT显著促进试管
苗的增殖生长。此外,在培养基中添加适量IBA能够
显著促进试管苗茎、叶的生长,有利于培育壮苗,提高
快繁效率。
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