全 文 ：收稿日期:2011 － 12 － 05;修回日期:2012 － 05 － 21
作者简介:顾 欣(1983) ，女，博士，主要从事油脂及蛋白质
工程方面的研究工作(E-mail)shipinzhiliang03@ 163． com。
通信作者:王建中，教授(E-mail)w62338221@ 163． com。
油料蛋白
山杏仁肽的体外抗氧化活性研究
顾 欣1，崔 洁1，李 迪2，林市齐1，黄 昆1，
王文江1，蔺立杰1，王建中1
(1. 北京林业大学 生物科学与技术学院，北京 100083;2. 河北化工医药职业技术学院，石家庄 050026)
摘要:分析了山杏仁蛋白的氨基酸组成，比较了分别使用蛋白酶 M、AX、Alcalase 和 Papain 酶解山
杏仁蛋白所制备的山杏仁肽的抗氧化性质。结果显示:山杏仁蛋白中疏水性氨基酸占氨基酸组成
的 35. 97%，谷氨酸含量超过了 27%。使用蛋白酶 M 制备的山杏仁肽还原能力最好，并且与其质
量浓度呈正相关性。使用 Alcalase制备的山杏仁肽在清除二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)方面
能力最强，40 mg /mL时清除率达到 91. 97%。使用蛋白酶 AX 所制备的山杏仁肽在清除羟基自由
基(·OH)及超氧阴离子自由基(O －2·)方面有着更强的能力，在山杏仁肽质量浓度为 50 mg /mL时
清除率分别达到 78. 91%和 89. 47%。
关键词:山杏仁蛋白;山杏仁肽;抗氧化
中图分类号:TS229;TQ936． 1 文献标志码:A 文章编号:1003 － 7969(2012)09 － 0040 － 04
Antioxidant activities in vitro of bitter apricot kernel peptides
GU Xin1，CUI Jie1，LI Di2，LIN Shiqi1，HUANG Kun1，
WANG Wenjiang1，LIN Lijie1，WANG Jianzhong1
(1. College of Biological Sciences and Technology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China;
2. Hebei Chemical ＆ Pharmaceutical College，Shijiazhuang 050026，China)
Abstract:The amino acid composition of bitter apricot kernel protein was analyzed，and the antioxidant
activities of four different bitter apricot kernel peptides prepared by hydrolysis with four proteases inclu-
ding M，AX，Alcalase and Papain were compared． The results showed that hydrophobic amino acids were
in the accounts for 35. 97% of the bitter apricot kernel protein amino acid composition，and glutamic acid
content was above 27% ． The peptide prepared by protease M had the best reducing power which in-
creased with the increase of peptide content． At the same time，the peptide prepared by Alcalase was the
best one on scavenging ability for DPPH radical，and the clearance rate of 40 mg /mL could attain to
91. 97% ． In addition，the peptide prepared by protease AX was better than others on scavenging ability
for hydroxyl radical and superoxide anion radical，and the clearance rate of 50 mg /mL reached 78. 91%
and 89. 47%，respectively．
Key words:bitter apricot kernel protein;bitter apricot kernel peptide;antioxidation
山杏仁中的蛋白含量在植物蛋白中仅次于大豆
蛋白，质量可与花生蛋白媲美，为不可多得的植物蛋
白资源［1］。我国山杏仁资源丰富，但多用于提取其
中的杏仁油与苦杏仁甙，大量含有丰富蛋白的山杏
仁粕没有充分合理利用［2］。与其他植物蛋白相比，
对山杏仁蛋白的相关研究也仅限于提取工艺方
面［3］，抗氧化活性等相关生物活性研究报道相对
较少。
生物活性肽是涉及生物体内各种细胞功能的
生物活性物质，是具有氨基酸序列的多肽，并在肠
道消化过程中充当新陈代谢潜在生理效应物［4］。
生物活性肽具有多种优良的生物活性及较好的稳
定性，能够作为功能因子添加到各种食品及保健
品中［5 － 6］。
本文对山杏仁蛋白的氨基酸组成进行分析，用
04 CHINA OILS AND FATS 2012 Vol. 37 No. 9
还原力、清除二苯代苦味酰基自由基、清除羟基自由
基和清除超氧阴离子自由基 4 种评价方式，分析比
较了不同蛋白酶(M、AX、Alcalase 和 Papain)酶解山
杏仁蛋白制备的山杏仁肽的抗氧化性能，以期为山
杏仁粕的开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 原料、试剂
山杏仁粕(河北省平泉县)。蛋白酶 AX、蛋白
酶 M(天野酶制品株式会社) ，Alcalase(诺维信生物
技术有限公司) ，Papain(Sigma 公司) ;其他试剂，均
为分析纯。
1. 2 主要仪器、设备
3200 Q TRAP LC － MS /MS(美国 AB 公司) ，
SHZ － 88A 往复式水浴恒温振荡器，PHS － 25 pH
计，BL － 05 高速万能粉碎机，752 紫外可见分光光
度计，KDY － 9830 全自动凯氏定氮仪，Therma
PRTMO. R 冷冻离心机，LL1500 冷冻干燥机，
FA10004A电子天平，80 目标准筛。
1. 3 山杏仁蛋白的提取
在室温下，将山杏仁粕粉碎用石油醚浸泡脱脂，
反复几次至脱脂彻底，置于通风橱内晾干，并过 80
目筛，得到脱脂山杏仁粉，于 4℃下保存。
采用碱提酸沉法提取山杏仁蛋白，具体工艺流
程为［7］:脱脂山杏仁粉→碱提(液料比 14∶ 1，37℃，
60 min，pH 9. 0)→离心(4 000 r /min，20 min)→上
清液→酸沉(pH 4. 1)→离心(5 000 r /min，15 min)→
沉淀→复溶(调 pH至中性)→冷冻干燥→山杏仁蛋
白粉。
1. 4 山杏仁蛋白的氨基酸成分分析
取 50 mg 山杏仁蛋白粉，加入 6 mol /L 的盐酸
100℃水解 22 h后，对其进行衍生化处理，采用LC －
MS /MS测定山杏仁蛋白的氨基酸组成。
1. 5 山杏仁肽的制备
称取一定量的山杏仁蛋白粉，按照表 1 列出的
条件进行酶解，酶解过程中保持整个体系 pH 稳定。
酶解度达到一定程度反应终止，沸水浴灭酶 10 min，
冷却后 5 000 r /min离心 20 min，取上清液调 pH 至
中性，冷冻干燥，即得到山杏仁肽粉，贮于 4℃下
备用。
表 1 各种蛋白酶的酶解条件
蛋白酶
底物质量浓度 /
(g /mL) 酶底比 酶解条件
M
AX
Alcalase
Papain
0. 05
0. 05
0. 05
0. 05
0. 02∶1
0. 02∶1
0. 02∶1
0. 02∶1
pH 6. 0，40℃，6 h
pH 9. 0，50℃，6 h
pH 9. 0，50℃，6 h
pH 7. 0，50℃，6 h
1. 6 还原力的测定［8］
取适量山杏仁肽粉，溶于 0. 2 mol /L pH 6. 6 磷
酸钠缓冲液中，配制成质量浓度为 0、20、40、60、80、
100 mg /mL 的样品溶液。于具塞试管中加入 0. 3
mL样品溶液，0. 75 mL 0. 03 mol /L的铁氰化钾溶液
和 0. 75 mL的磷酸盐缓冲溶液，混匀后于 50℃水浴
保温 20 min;冷却后加入 0. 75 mL 0. 6 mol /L的三氯
乙酸溶液，混匀后 3 000 r /min 离心 10 min，取上清
液 2 mL，并加入 2 mL 去离子水和 0. 4 mL 6 mmol /L
的氯化铁溶液，混合均匀，于 700 nm下测定吸光度。
每个样品 3 组重复。吸光度越高，说明还原力越强，
则抗氧化性越强［9］。
1. 7 二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)清除能力
的测定
在参考文献［10］分析法的基础上略有改动。将
山杏仁肽粉用去离子水配制成质量浓度为 0、10、20、
30、40、50 mg /mL的样品溶液，取 2. 0 mL样品溶液于
10 mL试管中，加入 2. 0 mL 0. 2 mmol /L DPPH·无水
乙醇溶液，混合均匀，于室温下避光反应 30 min 后
在 517 nm 测定其吸光度。每个样品 3 组重复。样
品的 DPPH·清除能力是以吸光度的减少作为判断
依据的［11］，计算公式如下:
DPPH·清除率 =
Ao － (Ai － Aio)
Ao
× 100%
式中:Ai 为 DPPH·溶液 +样品溶液的吸光度;
Aio为无水乙醇 +样品溶液的吸光度;Ao 为DPPH·
溶液 +去离子水的吸光度;以无水乙醇做参比。
1. 8 羟基自由基(·OH)清除能力的测定
采用邻菲罗啉 － Fe2 +氧化法［12］，并在其基础
上适当修改。将山杏仁肽粉用去离子水配制成质
量浓度为 0、10、20、30、40、50 mg /mL的样品溶液。
取 0. 3 mL 1. 5 mmol /L 的邻菲罗啉溶液加入试管
中，依次加入 0. 6 mL 磷酸盐缓冲液(0. 2 mol /L，
pH 7. 4) ，0. 3 mL 蒸馏水和 0. 3 mL 0. 75 mmol /L
硫酸亚铁溶液充分混匀，加 0. 3 mL 2 mmol /L
H2O2，37 ℃下恒温反应 45 min，于 536 nm 处测其
吸光度，其值为对照组 AB;用 0. 3 mL 蒸馏水代替
H2O2，测得的吸光度为空白组 AP;用 0. 3 mL 样品
溶液代替 0. 3 mL蒸馏水，测得的吸光度为 AS。计
算公式如下:
·OH清除率 =
AS － AP
AB － AP
× 100%
式中:AP为空白组的吸光度;AB为对照组的吸光
度;AS为样品溶液组的吸光度。
1. 9 超氧阴离子自由基(O －2·)清除能力的测定
采用邻苯三酚方法［13］，并在其基础上适当修
改。将山杏仁肽粉用去离子水配制成质量浓度为
142012 年第 37 卷第 9 期 中 国 油 脂
0、10、20、30、40、50 mg /mL 的样品溶液。在试管中
加 1 mL 0. 05 mol /L pH 8. 2 的 Tris － HCl缓冲液，分
别加入待测样品溶液 100 μL，之后加入 100 μL 10
mmol /L邻苯三酚溶液，振荡并计时至 5 min 时，加
入 100 μL 0. 17 mol /L 抗坏血酸溶液，振荡终止反
应，在 420 nm处测定其吸光度。空白组加入同体积
蒸馏水代替样品溶液。计算公式如下:
O －2·清除率 =
Ao － As
Ao
× 100%
式中:Ao 为空白组的吸光度;As 为试样组的吸
光度。
2 结果与讨论
2. 1 山杏仁蛋白的氨基酸组成(见表 2)
表 2 山杏仁蛋白的氨基酸组成 %
氨基酸种类 含量 氨基酸种类 含量
精氨酸 6. 94 酪氨酸* 2. 02
组氨酸 2. 70 天门冬酰胺 0. 03
异亮氨酸* 3. 19 天门冬氨酸 9. 28
亮氨酸* 5. 80 瓜氨酸 0. 11
赖氨酸 2. 47 谷氨酸 27. 37
甲硫氨酸 2. 51 谷氨酰胺 1. 94
苯丙氨酸* 4. 72 鸟氨酸 0. 10
苏氨酸 1. 93 半胱氨酸 0. 16
色氨酸 2. 37 同型半胱氨酸 0. 10
缬氨酸* 4. 35 α －氨基正丁酸 0. 42
甘氨酸* 4. 90 丙氨酸* 4. 94
丝氨酸 3. 78 脯氨酸* 6. 05
牛磺酸 1. 82 肌氨酸 0. 01
注:* 表示疏水性氨基酸。
有研究表明［14］，多肽的抗氧化活性与其组成中
的疏水性氨基酸有一定的相关性。由表 2 计算可
知，山杏仁蛋白中疏水性氨基酸占氨基酸组成的
35. 97%;此外，亲水性氨基酸中的谷氨酸含量较高，
超过了 27%。
2. 2 还原力的测定(见图 1)
图 1 不同质量浓度山杏仁肽溶液的还原能力
由图 1 可知，各质量浓度的山杏仁肽均具有一
定的还原能力。使用蛋白酶 AX、M、Alcalase 3 种酶
制备的山杏仁肽的还原能力随着质量浓度的增加而
增强，并在 20 ～ 100 mg /mL 范围内具有一定的线性
相关性。其中，蛋白酶 M所制备的山杏仁肽还原力
最强，Papain 酶所制备的山杏仁肽质量浓度在 60
mg /mL之前，山杏仁肽的还原能力随着质量浓度的
增加而增强，继续增大样品质量浓度后，样品溶液在
反应过程中生成黄色沉淀，且沉淀量随质量浓度增
大而显著增加，离心后测定的吸光度明显下降。这
可能是该酶水解产物将 Fe2 +还原为 Fe3 +后，肽端的
某些基团与 Fe2 +发生反应引发沉淀现象。
2. 3 DPPH·清除能力(见图 2)
图 2 不同质量浓度山杏仁肽溶液清除 DPPH·的能力
由图 2 可以看出，这 4 种酶制备的山杏仁肽都
具有一定的清除 DPPH·的能力，且山杏仁肽质量
浓度在 10 ～ 40 mg /mL范围内，清除 DPPH·的能力
随着质量浓度的增加而逐渐增大。Alcalase 制备的
山杏仁肽在 40 mg /mL 时 DPPH·清除率达到最高
值(91. 97%) ;40 ～ 50 mg /mL 时，Alcalase 和蛋白酶
AX所制备的山杏仁肽清除能力趋于稳定，Papain
与蛋白酶 M所制备的山杏仁肽清除能力仍处于上
升趋势。4 种酶所制备的山杏仁肽的 IC50值如表 3
所示，表明其清除 DPPH·的能力由大到小依次为:
Alcalase ＞ AX ＞ M ＞ Papain。
表 3 不同酶所制备的山杏仁肽清除 DPPH·的 IC50值
mg/mL
AX Alcalase Papain M
15. 33 10. 31 18. 09 17. 59
2. 4 ·OH清除能力(见图 3)
图 3 不同质量浓度山杏仁肽溶液清除·OH的能力
由图 3 可以看出，除 Alcalase 所制备的山杏仁
肽外，其余酶制备的山杏仁肽质量浓度与·OH 的
清除率有明显的量效关系。随着山杏仁肽质量浓度
的增加，清除率均呈上升趋势。其中，以蛋白酶 AX
制备的山杏仁肽清除效果最好，当山杏仁肽质量浓度
24 CHINA OILS AND FATS 2012 Vol. 37 No. 9
为 50 mg /mL时，其对·OH 的清除率达到 78. 91%。
Alcalase所制备的山杏仁肽的·OH 清除率较低，随
山杏仁肽质量浓度变化关系不明显，在低质量浓度
下其清除率出现负数，即出现促进氧化的情况。不
同酶解产物对·OH 清除能力的差别可能是由于不
同酶的酶切位点不同，致使制备的多肽在序列、长度
以及游离基团的种类和数量上有所不同，最终影响
·OH清除效果。
4 种酶所制备的山杏仁肽 IC50值如表 4 所示，表
明其清除·OH的能力由大到小依次为:AX ＞ M ＞
Papain ＞ Alcalase。
表 4 不同酶所制备的山杏仁肽清除·OH的 IC50值
mg/mL
AX Alcalase Papain M
28. 67 159. 68 55. 80 45. 18
2. 5 O －2·的清除能力(见图 4)
图 4 不同质量浓度山杏仁肽溶液清除 O －2·的能力
由图 4 可见，不同蛋白酶制得的山杏仁肽均对
邻苯三酚的自氧化有明显的抑制作用，抑制能力与
山杏仁肽质量浓度在 10 ～ 50 mg /mL 范围内具有一
定的线性正相关性。其中，蛋白酶 AX 所制备的山
杏仁肽的 O －2·清除能力最为明显，在 10 mg /mL 时
其清除率为 57. 89%，50 mg /mL 时清除率达到
89. 47%;蛋白酶 M和 Alcalase所制备的山杏仁肽的
O －2·清除能力接近，在 50 mg /mL 时二者相差不足
1%;Papain所制备的山杏仁肽的 O －2·清除能力较
差，在 50 mg /mL时清除能力为 50. 00%。
4 种酶所制备的山杏仁肽的 IC50值如表 5 所示，
表明其清除 O －2·的能力由大到小依次为:AX ＞
Alcalase ＞ M ＞ Papain。
表 5 不同酶所制备的山杏仁肽清除 O －2·的 IC50值
mg/mL
AX Alcalase Papain M
7. 01 21. 04 57. 88 26. 16
3 结 论
山杏仁蛋白中疏水性氨基酸占氨基酸组成的
35. 97%，亲水性氨基酸中的谷氨酸含量超过了
27%。通过碱提酸沉法提取山杏仁蛋白后，分别使
用蛋白酶 M、AX、Alcalase和 Papain 4 种酶酶解制备
山杏仁肽。使用蛋白酶 M 制备的山杏仁肽有最好
的还原能力，并且随着质量浓度的升高而增强。使
用 Alcalase 制备的山杏仁肽在清除 DPPH·方面能
力最强，40 mg /mL时清除率达到 91. 97%。使用蛋
白酶 AX所制备的山杏仁肽在清除·OH 及 O －2·方
面有着更强的能力，在山杏仁肽质量浓度为 50 mg /
mL时清除率分别达到 78. 91%和 89. 47%，IC50值同
样支持以上结论。
鉴于山杏仁肽较好的抗氧化能力，今后可进一
步在山杏仁抗氧化肽提取利用以及分离纯化方面进
行更加深入的研究。
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