全 文 ：中国农学通报 2012,28(02):15-18
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
哺乳动物的器官在失去后很难进行再生，鹿茸是
唯一的失去后还能完全再生的哺乳动物附属器官[1]。
鹿茸的再生涉及到许多组织的快速生长，包括表皮、真
皮、软骨、骨骼、血管和神经等，是研究哺乳动物器官再
生的理想动物模型。鹿茸的生长速度非常快，一旦鹿
茸快速增殖程序启动，茸角顶端包括表皮、真皮、间充
质、前软骨、软骨和骨组织都能快速生长[1,2]。真皮层由
致密结缔组织构成，真皮层内的细胞主要是成纤维细
胞，能合成胶原纤维和弹性纤维。关于梅花鹿鹿茸真
基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金资助项目“甲状旁腺素相关肽及其受体在梅花鹿茸角内的表达及与茸角再生的关系”
（20100061110078）；国家自然科学基金资助项目“PTHrP-IHH信号通路对梅花鹿茸角再生的调控”（31072099）；国家高技术研究发展计划资助项目
“梅花鹿鹿茸再生相关基因的筛选、克隆及功能分析”（2007AA10Z150）。
第一作者简介：王守堂，男，1988年出生，吉林吉林人，硕士研究生，主要从事鹿茸再生的分子机理等方面的研究。通信地址：130062吉林大学畜牧兽
医学院，Tel：0431-87836162，E-mail：wangshoutang_1988@126.com。
通讯作者：郭斌，男，1979年出生，山西定襄人，博士，讲师，主要从事动物生殖与发育等方面的研究。通信地址：130062吉林大学畜牧兽医学院，Tel：
0431-87836162，E-mail：guobin-1979@hotmail.com。
收稿日期：2011-06-27，修回日期：2011-09-06。
梅花鹿鹿茸真皮层细胞的分离培养及冷冻保存
王守堂，张 璐，田学超，韩玉帅，李当当，杨德才，郭 斌，岳占碰
（吉林大学畜牧兽医学院，长春 130062）
摘 要：为了研究梅花鹿鹿茸真皮层细胞的生物学特性，取梅花鹿鹿茸生长顶端的真皮层组织，分离真皮
层细胞进行体外培养及冷冻保存。结果表明，在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，鹿茸真皮
层细胞能进行短期体外培养，培养的细胞呈长梭形或菱形，细胞的生长状况良好，传代培养的细胞培养
5天可长至汇合。传4代以前的细胞形态均一，边缘光滑，胞质均匀透明，细胞排列紧密；传5代后，细胞
伸展变为扁平形，细胞突起增多，边缘不光滑，汇合后细胞排列疏松。以含 5%二甲基亚砜（DMSO）和
10%FBS的DMEM为冻存液，经梯度降温后冻存，真皮层细胞复苏后的存活率较高。
关键词：梅花鹿鹿茸；真皮层细胞；体外培养；冷冻保存
中图分类号：S8，Q24 文献标志码：A 论文编号：2011-1862
Culture and Cryopreservation of Sika Deer Antler Dermis Layer Cells in vitro
Wang Shoutang, Zhang Lu, Tian Xuechao, Han Yushuai, Li Dangdang, Yang Decai, Guo Bin, Yue Zhanpeng
(College of Animal Science and Veterinary Medicine, Jilin University, Changchun 130062)
Abstract: To study the biological characteristics of sika deer antler dermis layer cells, the dermis layer of
growing tip in sika deer antler was collected and a culture and cryopreservation system in vitro for the dermis
layer cells was established. The results showed that the antler dermis layer cells could be cultured well within a
short term in DMEM medium with 10% FBS in vitro. The cultured dermis layer cells were spindle or rhombic
and the cultured cells merged each other after 5 days. The cells before the fourth generation appeared uniform.
The edge of the cells was smooth and the cytoplasm was uniform and transparent. The cultured cells were
closely arranged. The cultured cells changed into flat after the fifth generation and extended more apophysises.
The edge of the cultured cells was not smooth and the cells were loosely arranged after merged. The suitable
cryopreserved condition for the dermis layer cells was DMEM medium containing 5%DMSO and 10%FBS with
gradient-cooling.
Key words: sika deer antlers; dermis layer cells; culture in vitro; cryopreservation
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皮层细胞的分离培养及冷冻保存方法，目前尚未见详
细报道。试验以梅花鹿为研究对象，对梅花鹿鹿茸真
皮层细胞进行了体外培养及冷冻保存，为深入研究鹿
茸生长及再生机理等提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验动物
试验所需梅花鹿选自吉林农业大学梅花鹿养殖
场，选取约1岁龄的健康梅花鹿，初角茸生长到约30天
时割取鹿茸。
1.2 试剂
DMEM培养基(Gibco)；胎牛血清（FBS，四季青）；
L-谷氨酰胺(Invitrogen)；胰蛋白酶(Sigma)；Ⅰ型胶原酶
(Sigma)；台盼兰(Sigma)；二甲基亚砜(DMSO，Sigma)。
1.3 组织分离
切取鹿茸尖部，将切下的鹿茸尖部组织在无菌条
件下从中央部纵向切开，结合形态学观察结果，参照
Li等[2]的组织分离方法，在解剖显微镜下定位和切取
鹿茸的真皮层。
1.4 细胞培养及传代
采用酶消化培养法进行鹿茸真皮层细胞体外培
养。鹿茸真皮层组织用无菌PBS洗 3次，将组织切碎
至1 mm3左右，移入50 mL离心管，再用PBS洗3次，将
洗后的组织碎块用0.2%Ⅰ型胶原酶消化，当在倒置显
微镜下观察到大量细胞从组织块中迁出时，1000 r/min
离心 5 min终止消化。将收集到的细胞用无血清的
DMEM洗 3次，接种到含 10%FBS的DMEM培养瓶
中，放入 37℃、5%CO2的培养箱中培养。7~9 h后镜下
观察细胞的贴壁情况，换液 1次/3天。待原代细胞生
长至汇合时，调整细胞浓度为1×105个/mL进行传代培
养，试验至少重复3次。
1.5 细胞的冷冻保存
将培养的 2代细胞长至汇合时收集细胞，台盼兰
染色测定细胞的存活率，加入含不同浓度DMSO的
DMEM细胞冻存液，调整细胞浓度为 5×106个/mL冷
冻保存。冷冻方法分2种：一种是连续降温，即将细胞
悬液分装入冻存管，用脱脂棉包好后直接放入-80℃低
温冰箱使其缓慢降温，24 h后移至液氮中保存；另一种
是梯度冷冻，即将冻存管经4℃保存30 min，-20℃保存
60 min，接着-80℃保存 12 h使其逐渐降温，最后放入
液氮中保存。冷冻细胞复苏后，用台盼兰染色测定不
同条件下冻存细胞的存活率，试验至少重复3次。
1.6 细胞的生物学检查
在倒置显微镜下观察不同代数、不同生长时期细
胞的形态。将培养3代的细胞经HE染色后，镜下观察
细胞形态。
1.7 统计分析
用 SPSS13.0软件分析试验数据，用平均值±标准
差表示。数据的组内比较采用方差分析（ANOVA），组
间比较采用双因素方差分析。
2 结果
2.1 鹿茸真皮层细胞的培养条件
采用酶消化培养法能有效地获得梅花鹿鹿茸真皮
层细胞，传代细胞在含10%FBS的DMEM中生长状况
良好。
2.1 鹿茸真皮层细胞的分离培养
原代培养的鹿茸真皮层细胞在9~12 h内贴壁，培
养 5天左右长至汇合。传代培养的细胞在 5~7 h内贴
壁，2代细胞培养 5天左右长至汇合，细胞呈单层排列
（图1A）。3代细胞形态与2代细胞类似，经HE染色后
可见胞质着色均匀，无颗粒状物质，细胞核呈圆形或椭
圆形（图 1B,C）。传 4代以前的细胞形态均一，呈长梭
形或菱形，边缘光滑，胞质均匀透明，细胞排列紧密（图
1A,B,C,D）。传至 5代时，细胞生长速度明显变慢，部
分细胞形态开始改变，表现为细胞伸展变得肥大，突起
增多，呈三角形或多角形，形态不规则（图1E）。传至6
代时，几乎所有细胞形态都发生改变，表现为细胞伸展
变为扁平形，细胞突起增多，边缘不光滑，汇合细胞排
列疏松（图1F）。
2.2 培养细胞的冷冻保存
采用连续降温和梯度降温方法，用加入含不同浓
度DMSO的DMEM作为细胞冻存液，对培养第2代梅
花鹿鹿茸真皮层细胞进行冷冻保存，冻存细胞复苏后
用台盼兰染色测定细胞的存活率，结果见表 1。结果
表明，不论采取连续降温还是梯度降温方法，添加5%
DMSO组真皮层细胞冻存复苏后存活率极显著高于
添加7.5%DMSO组和10%DMSO组(P<0.01)。对采用
不同降温方法的冷冻保存效果比较发现，添加不同浓
度DMSO后，采用梯度降温方法的真皮层细胞冻存复
苏后的存活率显著高于采用连续降温方法(P<0.05)。
在所有组中，以添加5%DMSO的DMEM为冻存液，经
梯度降温进行冻存，真皮层细胞复苏后的存活率最高，
存活率为97.50%。
3 讨论
鹿茸是哺乳动物唯一的失去后能完全再生的附属
器官。鹿茸每年都会脱落并且重新长成完整的器官,
是研究哺乳动物器官再生理想的动物模型[3-4]。鹿茸的
生长速度非常快，有些品种的鹿其茸角的生长速度可
超过每天 2 cm，鹿茸的再生涉及许多组织的快速生
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王守堂等：梅花鹿鹿茸真皮层细胞的分离培养及冷冻保存
长，包括有表皮、真皮、软骨、骨骼、血管和神经等[5-7]。
然而，目前人们对于鹿茸再生及快速生长的机理仍不
清楚。
Li等[3,8-9]报道了从新鲜鹿茸尖部的组织切面上精
确定位和分离鹿茸真皮层细胞的方法，该取材方法的
建立为深入研究鹿茸再生机理等提供了有效的手段。
真皮层由致密结缔组织构成，对鹿茸角真皮层的组织
学观察研究表明，该层内的细胞成分单一，主要是成纤
维细胞，能合成胶原纤维和弹性纤维，细胞间质含量较
少，主要是一些纤维成分，该层与其他组织层间的分界
较明显[10-11]。关于真皮层细胞的分离培养方法，目前常
用的主要有 2种，一种是将真皮层组织用Ⅰ型胶原酶
进行消化，得到游离的真皮层细胞进行体外培养；另一
种是组织块预消化法[12-13]。采用0.2%Ⅰ型胶原酶消化
法对梅花鹿鹿茸真皮层细胞进行了分离培养，获得了
梅花鹿鹿茸真皮层细胞，建立了鹿茸真皮层细胞的体
外培养方法，传代细胞在含10%FBS的DMEM中生长
状况良好。梅花鹿鹿茸真皮层细胞培养方法的建立，
为深入研究鹿茸再生机理奠定了一定的理论基础。通
过研究发现，梅花鹿鹿茸真皮层细胞长至汇合的时间
约为5天，在传4代以内可保持细胞形态及生长速度的
相对稳定。所以，在利用鹿茸真皮层细胞进行相关研
究时尽量使用培养 4代以前的细胞，随着传代次数的
增加，细胞的生长速度逐渐变慢，细胞的形态也发生明
A.长至汇合的2代细胞；B.长至汇合的3代细胞；C.3代细胞HE染色；
D.长至汇合的4代细胞；E.长至汇合的5代细胞；F.长至汇合的6代细胞
图1 梅花鹿鹿茸真皮层细胞的形态（100×）
冻存方法
梯度降温
连续降温
DMEM中添加DMSO的比例
5
97.50±0.09
94.83±0.03
7.5
89.20±0.13
87.92±0.08
10
85.00±0.12
81.85±0.48
表1 不同冻存条件下真皮层细胞的存活率 %
A
C
E
B
D
F
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显的变化。
关于鹿茸真皮层细胞的冷冻保存，目前尚未见详
细报道。不同细胞的冷冻保存方法不同，细胞的冻存
保护剂种类很多，其中DMSO是最常采用的体外培养
细胞冻存保护剂[14-15]。通过对梅花鹿鹿茸真皮层细胞
的冷冻保存方法进行了较系统的研究，采用连续降温
和梯度降温方法，用加入含不同浓度DMSO的DMEM
作为细胞冻存液进行培养第2代梅花鹿鹿茸真皮层细
胞的冷冻保存，冻存细胞复苏后用台盼兰染色测定细
胞的存活率。研究结果表明，在所有组中，以添加5%
DMSO的DMEM为冻存液，经梯度降温进行冻存，真
皮层细胞复苏后的存活率最高，其存活率为 97.50%，
可以满足相关试验研究的需要。同时，建立起的梅花
鹿鹿茸真皮层细胞体外培养方法及冷冻保存方法，也
可为深入研究鹿茸生长及再生机理等奠定基础。
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