全 文 ：中国农学通报 2011,27(01):362-365
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
哺乳动物的器官失去后很难再生，鹿茸角是哺乳
动物唯一的失去后还能完全再生的器官。鹿茸角的生
长速度非常快，其生长中心间充质层细胞的分裂增殖
速度比肿瘤细胞的增殖速度还要快[1]。在大多数肿瘤
中 均 存 在 转 化 生 长 因 子 β（transforming growth
基金项目：国家高技术研究发展计划资助项目“梅花鹿鹿茸再生相关基因的筛选、克隆及功能分析”（2007AA10Z150）；国家自然科学基金资助项目
“PTHrP-IHH信号通路对梅花鹿茸角再生的调控”（31072099）；长春市科技支撑计划资助项目“优质梅花鹿良种选育与高效快繁关键技术研究与开
发”（08KZ36）；教育部新教师基金资助项目“梅花鹿茸角ColX基因表达分布及调控分析”（200801831048）；高等学校博士学科点专项科研基金资助
项目“甲状旁腺素相关肽及其受体在梅花鹿茸角内的表达及与茸角再生的关系”（20100061110078）。
第一作者简介：韩玉帅，男，1985年出生，山东省茌平县人，硕士研究生，主要从事鹿茸再生的分子机理等方面的研究。通信地址：130062吉林省长春
市西安大路5333号吉林大学畜牧兽医学院，Tel：0431-87836162，E-mail：hys198579@tom.com。
通讯作者：岳占碰，男，1966年出生，山西省保德县人，博士，教授，主要从事动物生殖与发育等方面的研究。通信地址：130062吉林省长春市西安大
路5333号吉林大学畜牧兽医学院，E-mail：zpyue@yahoo.com.cn。
收稿日期：2010-06-24，修回日期：2010-09-13。
SB-431542对梅花鹿鹿茸软骨层细胞增殖的影响
韩玉帅，张 璐，赵丽红，郭 斌，冯海华，岳占碰
（吉林大学畜牧兽医学院，长春 130062）
摘 要：通过研究转化生长因子 β（transforming growth factor-β，TGF-β）的特异性小分子拮抗剂
SB-431542对梅花鹿鹿茸软骨层细胞增殖的影响，探讨转化生长因子β在鹿茸快速生长中的调节机制。
分离培养生长30天的梅花鹿鹿茸软骨层细胞，将传代培养第2代的细胞经不同浓度的SB-431542（0、1、
3、5、8、10 μmol/L）作用，培养48 h后用MTT法测其细胞增殖的变化，并用SPSS软件分析其差异性。结
果显示，SB-431542处理组细胞增殖活性都低于对照组（P<0.05），其中浓度为 8 μmol/L和 10 μmol/L的
SB-431542处理组与对照组相比差异非常显著（P<0.01），随着添加SB-431542浓度的升高，对细胞的生
长速度抑制更加明显，试验结果表明，TGF-β对维持梅花鹿鹿茸软骨层细胞的快速增殖有重要作用。
关键词：SB-431542；梅花鹿鹿茸；软骨层细胞；增殖
中图分类号：S8，Q24 文献标志码：A 论文编号：2010-1916
Effects of SB-431542 on the Proliferation of Sika Deer Antler Chondrocytes
Han Yushuai, Zhang Lu, Zhao Lihong, Guo Bin, Feng Haihua, Yue Zhanpeng
(College of Animal Science and Veterinary Medicine, Jilin University, Changchun 130062)
Abstract: The regulatory mechanism of TGF-β on the rapid growth of antler was investigated by studying the
effect of specific micro-molecule antagonist SB-431542 of transforming growth factor- β (TGF-β) on the cell
proliferation of sika antler chondrocytes. The sika deer antler chondrocytes were isolated at the 30th day of the
growth, then the second generation cells were incubated with 0, 1, 3, 5, 8, 10 μmol/L of SB-431542, after 48
hours of culture, the MTT assay was used to examine the proliferation of antler chondrocytes and the SPSS
software was used to analyze the difference of the results. The result showed that the proliferation activity of
cells treated with SB-431542 was lower than that of the control group (P<0.05), among them, the proliferation
activity of cells treated with SB-431542 at the concentration of 8 μmol/L and 10 μmol/L was significantly
lower than that of the control (P<0.01), with the increased concentration of SB-431542, the inhibition to cell
proliferation rate was more significant. In conclusion, these results indicated that TGF-β might play an
important role to maintain the rapid proliferation of sika antler chondrocytes.
Key words: SB-431542; sika deer antlers; chondrocyte; proliferation
韩玉帅等：SB-431542对梅花鹿鹿茸软骨层细胞增殖的影响
factor-β，TGF-β）的表达异常，TGF-β对细胞的作用因
细胞的种类、细胞周围微环境和细胞自身状态的不同
而表现出刺激或抑制效应[2]。鹿茸的快速生长是在一
系列分子的调控下进行的，在赤鹿的研究中发现，
TGF-β1与TGF-β2在鹿茸中表达水平均较高[3-4]。研究
TGF-β在鹿茸生长中的调节作用对探明鹿茸再生的分
子机制有重要意义。SB-431542是特异性TGF-βⅠ型
受体抑制剂，可竞争性结合ATP位点而特异性抑制
TGF-βⅠ型受体，从而阻止Ⅰ型受体磷酸化进而阻断
TGF-β信号通路中特定靶基因的表达[5]。试验通过研
究SB-431542对鹿茸软骨层细胞增殖的影响，来探讨
TGF-β在鹿茸快速生长过程中的调节作用。
1 材料与方法
1.1 试验动物
选定约 1岁龄的健康梅花鹿（吉林农业大学梅花
鹿养殖场），在初角茸生长到约30天时割取鹿茸。
1.2 试剂
DMEM培养基（Gibco）；胰蛋白酶（Sigma）；Ⅱ型
胶原酶(Invitrogen)；透明质酸酶(Invitrogen)；胎牛血清
(杭州四季青)；台盼兰（Sigma）；DMSO（Sigma）；
SB-431542（Sigma）；MTT（Sigma）。
1.3 组织分离
取快速生长期的鹿茸，将割取的鹿茸进行消毒，并
用手术刀切取 5 cm长的鹿茸尖部。将切下的鹿茸尖
部组织在无菌条件下用手术刀从中央部纵向切开以暴
露茸尖内部组织，结合形态学观察结果，依据Li等[6]的
取材方法，在解剖显微镜下定位和切取鹿茸的软骨层。
1.4 细胞培养及传代
鹿茸软骨层组织切碎后先用 0.1%透明质酸酶
37℃消化 20 min。离心去除透明质酸酶后加入含
200 U/mLⅡ型胶原酶和 10%胎牛血清的DMEM中进
行消化，于37℃温箱中孵育3 h左右。消化后的组织和
游离出的细胞通过离心去除消化液，用PBS洗3次，再
用细胞培养液悬浮后转移至培养瓶中，在 37℃和 5%
CO2的培养箱中培养。培养3天后换液并继续培养，细
胞生长到 80%融合时，用胰蛋白酶消化贴壁生长的细
胞，并对消化的细胞进行台盼兰染色以确定细胞的活
性，用倒置显微镜观察并对细胞进行计数，做细胞爬片
的HE染色。
1.5 试验设计
将鹿茸的第二代软骨细胞接种于 96 孔板
（1×104个/mL），细胞贴壁并生长至 80%~90%丰度时，
加入不同浓度的 SB-431542（终浓度为 0、1、3、5、8、
10 μmol/L，用 DMSO溶解），孵育 48 h后每孔加入
0.5 mL的MTT/PBS溶液100 μL，37℃培养4 h，每孔再
加入DMSO 100 μL后剧烈震动 10 min，用酶标仪于
590 nm处测定吸光度。
1.6 数据统计
采用SPSS10.0软件对所得数据进行分析。
2 结果
2.1 鹿茸软骨层细胞的分离培养
培养的鹿茸软骨层细胞第3天换液除去未贴壁的
细胞，倒置显微镜下观察可见，鹿茸软骨层细胞已贴
壁，细胞形态均匀，呈三角型或多边型，细胞呈克隆样
生长，贴壁的细胞增殖迅速，细胞爬片染色发现少数细
胞呈纺锤形或梭形（见图1）。台盼兰染色结果显示细
胞活性均在90%以上。
2.2 SB-431542对鹿茸软骨层细胞增殖的影响
将传代培养第 2代的细胞经不同浓度SB-431542
（0、1、3、5、8、10 μmol/L）作用，培养 48 h后用MTT法
测其细胞增殖的变化，并用SPSS软件分析其差异性。
结果表明，SB-431542处理组细胞增殖活性都低于对
照组（P<0.05），浓度为 8 μmol/L 和 10 μmol/L 的
SB-431542处理组与对照组相比差异非常显著（P<
0.01），随着添加 SB-431542浓度的升高，对细胞的生
长速度的抑制更加明显（见图2）。
A.倒置显微镜观察（100×）；B.细胞爬片HE染色（100×）
图1 传二代梅花鹿鹿茸软骨层细胞形态
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3 讨论
鹿茸角是哺乳动物唯一的失去后还能完全再生的
器官，是研究哺乳动物器官再生及创伤修复理想的动
物模型。鹿茸角是哺乳动物出生后生长速度最快的组
织之一，鹿茸角的生长中心间充质层细胞的分裂增殖
速度比肿瘤细胞的增殖速度还要快，鹿茸的生长和长
骨的生长非常相似，为研究长骨的生长提供了良好的
模型[7]。鹿茸的快速生长是在一系列分子的调控下进
行的。TGF-β是一类多功能的细胞因子，在大多数肿
瘤中均存在TGF-β的异常表达[8]。TGF-β能促进软骨
细胞和骨细胞的分裂增殖，促进骨细胞产生Ⅰ型胶原，
抑制软骨细胞生成Ⅱ型胶原，促进骨桥蛋白及碱性磷
酸酶合成，增强基质钙化及骨形成蛋白的诱导成骨能
力[9]。TGF-β对细胞的作用因细胞的种类、细胞周围微
环境和细胞自身状态的不同而表现出刺激或抑制效
应 [2]。一些学者在赤鹿的研究中发现，TGF-β1与
TGF-β2在鹿茸中表达水平均较高[3-4]，TGF-β可能在鹿
茸生长过程中起重要的调节作用。
SB-431542是特异性 TGF-βⅠ型受体抑制剂，可
竞争性结合ATP位点而特异性抑制TGF-βⅠ型受体，
从而阻止 I型受体磷酸化进而阻断下游的 smad2和
smad3进入核内，最终阻断 smad2/smad3介导的TGF-β
信号通路中特定靶基因的表达[10-11]。Li等报道了在鹿
茸尖部组织切面上精确定位和分离鹿茸软骨层细胞的
方法[6]。作者利用该取材方法获得梅花鹿生长约30天
的初角茸软骨层细胞，通过研究SB-431542对鹿茸软
骨层细胞增殖的影响，来探讨TGF-β在鹿茸快速生长
过程中的调节机理。通过研究发现，在低浓度的
SB-431542存在的情况下鹿茸软骨层细胞增殖受到了
抑制，随着添加SB-431542浓度的增加，对鹿茸软骨层
细胞的抑制作用更加明显，表明，用 SB-431542阻断
TGF-βⅠ型受体后，鹿茸软骨层细胞在失去TGF-β信
号调节的情况下，生长速度变慢，TGF-β可能对鹿茸软
骨层细胞的增殖起促进作用。有学者在对小鼠成骨细
胞的研究中发现，TGF-β能够抑制其碱性磷酸酶的活
性，从而抑制细胞过度骨化[12-13]。将小鼠的TGF-βⅠ型
受体敲除后发现，该基因敲除小鼠的关节软骨发育畸
形变短，过早的发生矿化[14-15]。在鹿茸的快速生长期，
鹿茸的生长速度可达 1 cm/天，尽管生长速度非常快，
但其结构井然有序，未发生癌变的迹象。添加
SB-431542后，梅花鹿鹿茸软骨层细胞的增殖活动受
到明显的抑制，由于 SB-431542是特异性TGF-βⅠ型
受体抑制剂，SB-431542可阻断 smad2/smad3介导的
TGF-β信号转导，TGF-β可能在鹿茸快速生长期平衡鹿
茸生长与癌变中发挥重要作用。
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0.105
0.110
0.115
0.120
0.125
0.130
0.135
DMSO(对照) 1 3 5 8 10SB-431542浓度/(
mol/L)
OD 5
90
图2 不同浓度SB-431542对梅花鹿鹿茸软骨层细胞增殖的影响
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