全 文 ：2002年5月第9卷第5期 中国中医药信息杂志 ·11·

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松果菊属3种药用植物的DNA分子鉴别研究△
张英涛 刘文芝 艾铁民*
(北京大学药学院 北京 100083)
[提 要] 目的：对松果菊属3种药用植物进行DNA指纹图谱鉴别,筛选出稳定的鉴别引物。方法：RAPD。结
果：共筛选随机引物 160个,3种松果菊中,狭叶松果菊与淡紫松果菊的 RAPD图谱极其相似,难以区分。最终仅筛
选得到一个可用于鉴别的随机引物H07。结论：引物H07可用于3种松果菊的原植物与药材鉴别,狭叶松果菊与淡
紫松果菊具有明显较近的亲缘关系。
[关键词] 松果菊 RAPD 分子鉴别
DNA Molecular Identification of the Three Echinacea Species Zhang Yingtao Liu Wenzhi Ai
Tiemin (School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Beijing 100083)
Abstract Objective：To find a molecular marker for identifying the three Echinacea species.
Methods：RAPD. Results：160 OPERON primers were screened and a primer H07 was found to be useable
to differentiate the three Echinacea species. Conclusion： The primer H07 can be used for the
identification of the three Echinacea species. Echinacea angustifolia and E. pallida turns out to be very
related species, while E. purpurea shows quite different from the other two species.
Key words Echinacea；RAPD；Molecular identification
松果菊属(Echinacea)植物是近年风靡国际市场的草药
之一,在我国也已受到药学界的关注。该属植物常作药用的有
3个种,即：松果菊(Echinacea purpurea)、狭叶松果菊
(E.angustifolia)与淡紫松果菊(E.pallida)。由于以上 3
种植物在形态、性状、化学成分与显微结构上均较为相似,
尤其后二者较难区分,甚至在国际市场上也经常出现两种药
材混合出售的现象。因而对3种药材的准确鉴别成为一个有
待解决的问题。笔者通过简单易行的RAPD方法对三者的DNA
进行了随机引物的鉴别筛选,最终获得了可靠的鉴别引物与
鉴别图谱。
1 材料
1.1 植物材料

△国家中医药管理局重大科技开发项目(№.2001-10)
*责任作者
松果菊属3种植物的新鲜材料与干燥药材均由北京市怀
柔县药用植物研究所提供。每种植物分别选择3株进行新鲜
材料的DNA提取与RAPD筛选,干燥药材用于筛选出的鉴别引
物的验证。
1.2 试剂
Taq DNA Polymerase 2μ/μl(北京鼎国生物技术发展中
心)；dNTPs(Bebco)；Lamda DNA/Hind III Makers (北京鼎
国生物技术发展中心)；RAPD系列引物A-H(OPERON)等。
1.3 仪器
PCR仪(PE Gene Amp PCR System 2400)；凝胶成像系统
(美国White/Ultraviolet Transilluminator)；DYY-III-6B
稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂)等。
2 方法
2.1 总DNA的提取与纯化
采用CTAB方法[1],并做了适当改动。将5g新鲜叶片用
1998,21(3)：
111 周宁娜,杨秀英,肖庆慈.大黄与巴豆配伍药理作用的研
究.云南中医学院学报,1997,20(1)：1
112 李建荣,朱 江,高晓山.配伍对大黄致泻作用的影响(Ⅱ)
―大黄与巴豆配伍.中成药,1993,15(5)26-27
113 毛小平,陈彩琼,毛晓健.玄参与黄芪配伍的实验研究.
云南中医学院学报,1997,20(2)：1
114 冯怀林,刘扬烈.葱白同蜂蜜配伍的实验研究.中医药研
究,1997,13(5)：50
115 吴兴和,管允理,周德和.莱菔子对人参补益作用的影响.
中医杂志,1996,37(5)：300
116 贾宏育,葛嘉峰,史晶杰.中药微量元素的研究概述.中
医药学报,1996,(2)：62
117 陈文贵.浅议中药药效与微量元素的关系.云南中医学
院学报,1990,13(1)：38
(未完待续)
·12· 中国中医药信息杂志 2002年5月第9卷第5期

液氮冷冻研磨至细粉,加入10ml预热至65℃的2×CTAB缓冲
液并移入离心管内,置 65℃水浴保温 90min,加入等体积氯
仿∶异戊醇(24∶1),缓慢反复颠倒混匀,于5000g离心10min
分相,取上清液加入Rnase A至终浓度为50μl/ml,于37℃保
温30 min,加入0.7体积异丙醇,缓慢混匀后用巴斯德吸管钩
出DNA并转移至装有5 ml76%乙醇与0.2M乙酸钠的离心管中
洗涤,干燥 DNA,然后用适量 TE溶解,加等量苯酚∶氯仿(1∶
1)抽提,16000rpm离心10min,取上清重复抽提1次,加入等体
积氯仿∶异戊醇(24∶1)除去苯酚,取上层加2倍体积无水乙
醇沉淀,干燥 DNA,用适量 TE溶解,琼脂糖凝胶电泳测定 DNA
浓度,用TE稀释DNA至终浓度为50～100ng/μl作为模板备
用。
2.2 PCR反应
采用 25μl反应体系(无菌蒸馏水 19.75μl ,10×PCR
buffer 2.5μl, dNTPs 0.25μl ,Taq 酶0.5μl, 模板DNA 1
μl,OPERON引物 1μl)。扩增程序为：94预变性4min,接以
94℃变性45s,35℃复性1min,72℃延伸45s,循环45次后,于
72℃完全延伸7 min。
2.3 扩增产物检测
PCR产物用1.5%琼脂糖-EB凝胶进行检测,每道上样27.5
μl(DNA25μl+10×上样缓冲液 2.5μl),100V电压电泳 2h,
用DNA凝胶成像仪观察采集图像。
3 结果
经过对OPERON系列A、B、C、D、E、F、G、H共8个系
列 160个引物的筛选,发现在 3种松果菊中,松果菊与其它 2
种差异较大,非常易于区分,而狭叶松果菊与淡紫松果菊则在
扩增条带上非常相似,绝大多数扩增条带基本一致,仅有少数
引物的扩增表现出不明显的差别。另外,在3个种的不同个体
间在扩增条带上亦有差别,因而在每种仅选一个个体进行初筛
时发现的种间差异往往在进行 9个个体重复时发现实为个体
变异而被淘汰。最终筛选得到的H07号引物(5’CTGCATCGTG 3’)
可将 3个种明确区分开,而且对于干燥药材叶片的检查亦得
到证实,因而具有鉴别意义。结果如图1所示。
图1 松果属3种植物的1APD分析
Z1、Z2、Z3：松果菊的3个样品；D1、D2、D3：淡紫松果菊的3个样品；
X1、X2、X3：狭叶松果菊的3个样品；M：分子量标准(Lamda DNA/Hind III
Makers)；箭头：示每个种的鉴别条带
4 讨论
松果菊属植物原产北美,我国亦有引种栽培。该属植物的
突出药用价值引起了我国众多制药企业与天然药物工作者的
兴趣[2]。我们实验室从1998年与北京市怀柔县药用植物研究
所合作进行松果菊的研究与开发,先后完成了多项相关的基础
研究工作[3～6],由我们承担的“一类新药材松果菊及其新药制
剂的开发研究”亦于2001年1月正式作为国家中医药管理局
重大科技开发项目进行立项,而开发研究的第一步即是原材
料的鉴别研究。从我们的研究与文献资料来看,狭叶松果菊与
淡紫松果菊在很多方面非常相似,例如从植物形态上看,明显
的区别仅为淡紫松果菊较狭叶松果菊为高,且边花较为下
垂[7],二者的药材性状与显微特征非常相似,没有明显的差
异[5,8]。从花粉形态来看,3种松果菊花粉的主要区别是：松
果菊与狭叶松果菊的花粉是黄色的,而淡紫松果菊的花粉为
黄白色[6,8]。对于化学成分的研究亦未发现后二者的明显差
别[3,7]。以上特征对于药材鉴别来说均缺少足够的说服力。笔
者通过对3种松果菊的DNA进行分析比较而使鉴别依据得以
完善。另外,从实验结果来看,狭叶松果菊与淡紫松果菊在
DNA扩增条带上具有非常大的相似性,结合二者在植物形态、
显微结构、化学成分上的相似性,可以肯定二者具有很近的亲
缘关系。细胞学研究发现狭叶松果菊与松果菊均为二倍体
(2n=22),而淡紫松果菊则是一个四倍体(2n=44)[8],它与狭叶
松果菊在种的起源上的相互关系仍有待于进一步的深入研
究。
参 考 文 献
1 顾红雅,瞿礼嘉译.植物分子生物学实验手册.北京：高等
教育出版社&施普林格出版社,1998.4
2 肖培根.国际流行的免疫调节剂—紫锥菊及其制剂.中草
药,1996,27(1)：46
3 王 弘,王雪薇,陈世忠,等.松果菊属 3种植物的理化分
析.中草药,2001,32(10)：934
4 张英涛,刘文芝,艾铁民.紫花松果菊性状及组织显微鉴别.
中药材,2000,23(3)：131
5 张英涛,刘文芝,艾铁民.狭叶松果菊的形态、性状与显微
鉴别研究.中草药,2001,32(6)：545
6 佟 巍,艾铁民.菊科松果菊属 3种药用植物花粉的形态
研究.中草药,2000,31(10)：779
7 Hobbs, C.Echinacea：The Immune Herb! California：
Botanica Press.1995
8 Heubl G R,Bauer R,Wagner H.Morphologische and
anatomische studien an Echinacea purpurea,E.
angustifolia,E. pallida and Parthenium integrigolium.
Scientia Pharmaceutica,1988,56：145
(收稿日期：2002-01-25)