全 文 ：第 27 卷　第 2期
2005 年 3 月
北　京　林　业　大　学　学　报
JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITY
Vol.27 , No.2
Mar., 2005
收稿日期:2004--03--22
http: journal.bjfu.edu.cn
基金项目:浙江省自然科学基金项目(399277).
第一作者:郝朝运 ,硕士生.主要研究方向:植物生理生态.电话:0579-2298065　Email:haochy79@163.com 　地址:321004 金华市浙江师范
大学生物科学系.
责任作者:刘鹏 ,博士 ,教授.主要研究方向:植物营养 、植物生态和植物区系.电话:0579-2282099　Email:pliu99@vip.sina.com　地址:同
上.
濒危植物七子花种群间遗传分化的初步研究
郝朝运　郭卫东　刘　鹏
(浙江师范大学生物科学系)
摘要:该文应用 RAPD技术分析了 9个七子花种群间的遗传分化.从 70 多个引物中筛选出清晰且多态性高的 27 个
引物进行扩增 ,共检测到 268 个位点 ,其中多态位点 163 个 , 多态位点比率 60.7%.平均每个引物扩增的 DNA 片段
数约为10条.应用 Jaccard 公式计算 9 个种群的相似性 ,并以此为基础通过组间连接法作出 9 个种群遗传分化的树
系图.结果显示 9 个种群分为 3个分支:北山 、植物园 、大盘山和东白山种群组成一个分支;天台山和括苍山种群组
成第二个分支;四明山种群单独一个分支.同时基于表型数据矩阵的 PCA分析也支持上述的聚类结果.分析认为 9
个种群间的遗传分化程度与其间地理距离有一定的联系.最后 ,作者建议当前应采取以下两点保护措施:尽可能保
护较多的种群数目;适当增加遗传分化较大的种群间的基因流.
关键词:七子花 , 种群 , RAPD , 遗传分化 , 聚类分析
中图分类号:S685.99　　文献标识码:A　　文章编号:1000--1522(2005)02--0059--06
HAO Chao-yun;GUO Wei-Dong;LIU Peng.Primary study on genetic divergence within populations of
Heptacodiummiconioides.Journal of Beijing Forestry University (2005)27(2)59-64 [ Ch , 15 ref.]
Department of Biological Science , Zhejiang Normal University , Jinhua , 321004 , P.R.China.
Random amplified polymorphic DNA (RAPD)analysis was applied to the samples of Heptacodium
miconioides from 9 main populations(No.1:Jiuquxi in Dapanshan , No.2:Huaxi in Dapanshan , No.3:
Chachangshang in Dongbaishan , No.4:Beishan , No.5:Botanic Garden in Zhejiang Normal Univ., No.6:
Chachangxia in Dongbaishan , No.7:Tiantaishan , No.8:Kuoc﹒angshan , No.9:Simingshan).Twenty seven
primers screened from 70 ones yielded 268 RAPD bands which had 163 polymorphic products and a total band
rate of 60.7%.The Jaccard coefficient was applied to compare the genetic similarity of these 9 populations
based on the RAPD data.A dendrogram based on Jaccard coefficients was constructed by using the between-
groups linkage method.The dendrogram shows that these 9 populations are clustered into three groups:No.1 ,
No.2 , No.3 , No.4 , No.5 and No.6 populations together;No.7 andNo.8 populations in the second cluster;
the SMS population(No.9)alone in the last cluster.The dendrogram result is also supported by a principal
component analysis(PCA)of RAPD phenotypic data.The analysis indicates that the genetic variations within
the nine populations are correlated with their geographical distance.Finally , the authors propose two
approaches of conserving genetic diversity of H.miconioides populations in fragmented habitats based on its
genetic structure and its biological characteristics.
Key words　Heptacodium miconioides , population , RAPD , genetic divergence , cluster analysis
　　七子花(Heptacodium miconioides Rehd.)是我国
特有的珍稀濒危植物 ,属国家二级重点保护植物.七
子花为落叶小乔木 ,属于忍冬科(Caprifoliaceae)的单
型属植物 ,在系统演化和区系分类上具有重大的学
术价值.同时七子花树姿优美 、花期长 、花朵纤小可
爱 ,可以作为优良的园林和绿化树种 ,但其分布非常
狭窄 ,并有不断缩小的趋势.模式标本产于湖北兴
山 ,现已灭绝 ,目前仅间断分布于浙江的北山 、大盘
山 、天台山以及安徽的泾县和宣城的少数地区 ,只在
金华北山 、大盘山和天台山有小片残留.它们多生于
DOI :10.13332/j.1000-1522.2005.02.012
悬崖峭壁 、山坡灌丛和林下 ,由于七子花生境的不断
恶化和人为的破坏 ,种群逐渐变小 ,数量日益减少 ,
分布范围不断缩小 ,其濒危机制和保护对策的研究
具有紧迫性.
探讨物种稀有和濒危的机制是生物多样性研究
与保护的热点之一 ,而稀有和濒危物种的遗传学研
究则是其中的一个重要方面[ 1 , 2] .揭示濒危物种的遗
传多样性和遗传变异在种群内和种群间的分布 ,能
为制定相关的保护策略与恢复措施提供必要的理论
指导[ 3-5] .关于种群遗传分化的研究 ,国内外已有众
多的报道[ 6-8] .而目前关于七子花的研究主要集中于
土壤 、生理 、光合 、解剖 、繁殖 、种群和群落等方面 ,其
分子水平遗传分化的研究报道较少.本研究利用
RAPD技术 ,以 9个七子花种群为研究对象 ,从分子
水平分析其种群间的遗传分化 ,对种群间的遗传关
系进行初步的探讨 ,以期为开展这一濒危植物的分
子生态学研究和保护措施的制定奠定基础.
1　材料与方法
1.1　材　料
材料取自浙江北山 、天台山 、括苍山 、大盘山 、东
白山 、四明山等地(见表 1),每个种群采 10 ～ 12个
单株样品用于混合总DNA的提取.由于七子花可通
过植株基部和根系萌蘖新植株 ,所以在条件允许的
情况下 ,采样的株间距大于 20 m.将采集的七子花
嫩叶 ,贮于冰壶内 ,快速带回实验室 ,洗净晾干 ,冷藏
于-70℃超低温冰箱中 ,备用.
表 1　七子花取样种群的基本情况
TABLE 1　Locations of 9 populations of Heptacodium miconioides
种群代号 种群地点 经度 纬度 海拔 m 生境
1 大盘山九曲溪 120°32′E 28°59′N 600 ～ 800 水沟旁次生林 ,轻微破坏
2 大盘山平板坡 120°31′E 28°58′N 900 ～ 1 100 水沟旁次生林 ,未遭破坏
3 东白山茶厂上 120°27′E 29°29′N 800 ～ 900 水沟旁次生林 ,破坏严重
4 北山 119°42′E 29°25′N 600 ～ 800 水沟旁次生林 ,轻微破坏
5 学校植物园 119°43′E 29°13′N 250 ～ 300 7 a前从北山移栽
6 东白山茶厂下 120°27′E 29°28′N 700 ～ 800 水沟旁次生林 ,破坏严重
7 天台山 120°55′E 29°14′N 800 ～ 1 000 水沟旁次生林 ,轻微破坏
8 括苍山 120°53′E 28°43′N 800 ～ 1 000 水沟旁次生林 ,轻微破坏
9 四明山 121°05′E 29°45′N 600 ～ 700 水沟旁次生林 ,轻微破坏
1.2　主要试剂
10 bp寡聚核苷酸随机引物及 RAPD试剂盒购
自上海生工生物工程有限公司.λDNA EcoR I+Hind
III Markers购自华美生物工程公司 ,其余均为国产
AR级试剂.
1.3　方　法
1.3.1　总 DNA的提取
DNA提取方法参考邹喻苹等[ 9] 的高盐低 pH
法 ,并根据七子花叶片特点做部分改动 ,方法如下:
①取冷藏混合叶片约 0.4 g ,用 70%酒精洗6 s ,
用蒸馏水清洗 3 次.②把洗净的叶片擦干 ,加入 1
mL 预冷的提取介质(100 mmol L pH 4.8 NaAc , 50
mmol L pH 8.0 EDTA Na2 ,500 mmol L NaCl , 2%PVP ,
1.4%SDS ,其 pH为 5.5),冰浴中迅速研磨 ,匀浆转
至1.5 mL 离心管中.③置浮桥上 65℃水浴保温 40
min后 ,室温 12 000 r min 离心 15 min ,弃沉淀.④加
入2 3体积的 2.5 mol L KAc (pH 4.8),混匀 ,0℃放
置30 min , 沉淀蛋白质.4℃12 000 r min离心 10 ～
20 min ,弃沉淀.⑤上清液加入 0.6倍体积的-20℃
预冷的异丙醇.温和混匀后于 4℃沉淀核酸 2 h.⑥
4℃12 000 r min离心20min ,收集沉淀.用750μL无
菌蒸馏水溶解沉淀 ,并于 50℃水浴助溶几分钟.⑦
4℃12 000 r min 离心 10 min ,弃不溶物.⑧上清液中
加入 0.6倍体积异丙醇 ,1 10体积 3 mol L NaAc(pH
5.2),混匀后于12 000 r min离心10min , 收集DNA.
⑨500μL 70%乙醇洗涤沉淀 ,空气干燥 5 min.⑩溶
于 500 μL 0.1×TE 缓冲液中.分装后存于 4℃或
-20℃备用.
1.3.2　DNA浓度和质量检测
用Pharmacia Biotech Ultrospec 4000 系统测定紫
外光吸收以确定提取的总 DNA 浓度和纯度 , 0.8%
琼脂糖凝胶电泳检测 DNA完整性.
1.3.3　引物筛选
本实验所用 70个 10碱基随机寡核苷酸引物购
自上海生工生物工程公司.任取一个模板 ,对所有引
物做初步筛选 ,从中选出扩增条带清晰 、重复性好的
引物供做下一步实验.
1.3.4　RAPD扩增与检测
经预实验优化条件后确定反应体系为:总体积
25μL , 其中 10 ×PCR buffer(500 mmol L KCl , 100
mmol L Tris-HCl , 1.0% Triton X-100 , 20 mmol L
MgCl2)2.5 μL , 引物(1.5 μmol L)0.3 μL , dNTP
60 北　京　林　业　大　学　学　报 第 27卷　
(dATP 、dCTP 、dGTP 、dTTP 各 2 mmol L)2.5 μL ,模板
1.7μL(约含 DNA 50 ～ 100 ng),Taq酶 0.3 μL(0.5
U),无菌水 17.7 μL ,反应混合物用 15 μL 石蜡油覆
盖.扩增条件:94℃200 s 预变性;94℃60 s ,36℃60
s;72℃120 s ,42个循环;72℃延伸 10 min.所有反应
在Thermo Hybaid P ×2 扩增仪上进行 ,扩增产物经
1.4%的琼脂糖凝胶(5 V cm)电泳检测 , Pharmacia
Biotech Image Master VDS系统下观测 、照相记录结果
(如图 2).PCR扩增反应重复一次 ,选取可重复的
DNA带(包括强带和弱带)记录分析.
1.4　数据统计分析
1.4.1　RAPD原始数据矩阵
把 RAPD作为显性标记 ,按照扩增的有(1)和无
(0)记录电泳谱带 ,构建原始数据矩阵.
1.4.2　多态位点比率
在某一特定位点上 ,若扩增片断出现的频率小
于0.99 , 则此位点称为多态位点.多态位点比率
(PPB)即在检测位点中多态位点所占的比例.
PPB = Ni N (1)
式中 , Ni 表示第 i 个种群的多态位点个数 , N 表示
总的位点数.
1.4.3　Jaccard系数矩阵
种群间遗传相似性系数按照 Jaccard公式计算:
S ij = a (a +b + c) (2)
式中 ,S ij为 i , j两个种群在遗传上的相似系数;a为
i , j两个种群共有的条带数;b为 i种群有而 j 种群
没有的条带数;c 为 j 种群有而 i 种群没有的条带
数.
1.4.4　聚类分析与主成分分析
基于 Jaccard 系数矩阵 , 应用组间连接法
(Between-groups linkage)进行聚类分析;基于 RAPD
表型数据矩阵进行主成分分析(PCA).
2　结果与分析
2.1　七子花总 DNA的提取
本实验按照邹喻苹等[ 9] 的方法提取七子花总
　　
DNA , OD 值(260 280)大体介于 1.6 ～ 1.9之间 ,通
过琼脂糖凝胶电泳发现 DNA有一定程度的降解 ,但
是 RAPD扩增表明对结果影响不大.由于该方法提
取时间过长 ,我们做了一些改进以缩短提取时间 ,提
取的七子花模板 OD260 OD280在 1.4 ～ 1.7之间 ,表
明 DNA中含有一定的蛋白质 ,我们在水浴过程中加
入终浓度 10 mg mL 的蛋白酶K以彻底消化蛋白质 ,
测得的比值为 1.6 ～ 2.0之间 ,说明提取的 DNA中
RNA含量较少且没有蛋白质 、酚污染.电泳结果(见
图 1)表明 ,提取的 DNA在 20 kb 以上 ,仅有轻微程
度的降解 ,后续的 PCR反应也获得了较好的结果.
M:Lambda DNA Hind III + EcoR I
图 1　9个种群七子花 DNA 电泳图
FIGURE 1　Results of electrophoresis of 9 populations
of Heptacodium miconioides
2.2　随机引物的筛选和扩增结果
对 70个引物进行筛选 ,得到 40个扩增产物清
晰的引物 ,进而对 40个引物进行复筛 ,选出 27个扩
增稳定性强 、多态性较好的引物(序列见表 2),其 G
+C 的百分含量为 64.4%.用这 27 个引物对所有
DNA样品进行 RAPD扩增 ,共获得 268条扩增产物 ,
每个引物的扩增条带为 7 ～ 17条 ,平均约为 10条 ,
DNA片段大小分布在 0.25 ～ 3.0 kb之间.其中 163
条谱带具有多态性 ,每个引物检测到的 RAPD多态
谱带介于 1 ～ 10条之间 ,平均为 6条 ,多态位点百
分率(PPB)为 60.7%.表明七子花不同种群间的
DNA多态性是很丰富的 ,有较高的遗传差异性 ,因
此利用 RAPD 标记能从 DNA水平上检测七子花种
群间的遗传差异.
表 2　27个引物及其扩增出的 DNA片段数
TABLE 2　DNA fragments samplified with 27 primers
引物 序列 5′～ 3′ 扩增谱带(多态谱带) 引物 序列 5′～ 3′ 扩增谱带(多态谱带) 引物 序列 5′～ 3′ 扩增谱带(多态谱带)
S6 TGCTCTGCCC 17(9) S50 GGTCTACACC 14(8) S335 CAGGGCTTTC 10(10)
S8 GTCCACACGG 13(9) S301 CTGGGCACGA 12(4) S339 GTGCGAGCAA 9(4)
S10 CTGCTGGGAC 10(5) S302 TTCCGCCACC 11(6) S343 TCTCCGCTTG 10(9)
S11 GTAGACCCGT 12(8) S306 ACGCCAGAGG 9(4) S352 GTCCCGTGGT 6(3)
S12 CCTTGACGCA 9(8) S313 ACGGGAGCAA 10(3) S353 CCACACTACC 8(5)
S14 TCCGCTCTGG 7(6) S320 CCCAGCTAGA 9(5) S354 CACCCGGATG 7(5)
S41 ACCGCGAAGG 11(10) S323 CAGCACCGCA 9(1) S355 TGTAGCAGGG 8(3)
S42 GGACCCAACC 8(7) S330 CCGACAAACC 9(6) S358 TGGTCGCAGA 10(6)
S45 TGAGCGGACA 10(5) S331 CTCAGTCGCA 11(10) S360 AAGCGGCCTC 9(4)
61第 2期 郝朝运等:濒危植物七子花种群间遗传分化的初步研究
M:Lambda DNA Hind III + EcoR I
图 2　随机引物 S8(a)、S45(b)的扩增产物
FIGURE 2　Amplifi cation products of primer S8(a), S45(b)
2.3　种群间聚类分析
表3列出了 9个七子花种群间的 Jaccard相似
性系数 、RAPD 图谱中共同的片段数和扩增片段总
数.结果显示 ,种群的遗传相似性介于 0.303 ～
0.664之间 ,遗传相似性最小的为 0.303(2号和 9号
种群),最大的为 0.664(4号和 5号种群),遗传距离
在 0.336 ～ 0.697之间.遗传距离越大 ,表明种群间
的遗传分化也就越大.
表 3　任意两个种群间的遗传相似性(Jaccard)、RAPD图谱中共同的片段数和扩增片段总数
TABLE 3　Genetic similarity(Jaccard)between any two populations , the numbers of the shared fragments and the total numbers of fragments
amplified in RAPD patterns
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 0 0.617 0.496 0.552 0.504 0.432 0.383 0.372 0.350
2 51 173 0 0.432 0.430 0.394 0.448 0.431 0.317 0.303
3 51 181 49 170 0 0.504 0.507 0.595 0.441 0.431 0.421
4 67 194 55 183 65 191 0 0.664 0.432 0.508 0.461 0.354
5 62 167 49 156 57 164 79 177 0 0.386 0.425 0.437 0.339
6 49 176 41 165 63 173 58 186 53 159 0 0.470 0.354 0.412
7 62 192 54 181 58 189 68 202 66 175 59 184 0 0.518 0.359
8 53 177 51 166 54 174 55 187 49 160 44 169 65 185 0 0.325
9 42 166 37 155 43 163 45 176 42 149 40 158 53 174 44 159 0
　　图3显示 ,9个种群间存在一定的遗传分化 ,大
体可分为 3个分支:1 ～ 6号 6个七子花种群的遗传
距离相对较近 ,形成一个分支;7号和 8号 2个七子
花种群的关系较近 ,构成另一分支;而 9号与其他种
群关系都较远 ,单独一个分支.5号种群浙江师大植
物园七子花为 7 a 前从北山移栽 ,所以应属于 4号
种群 , 9个种群中 ,两者地理距离最近 ,在树系图上
的位置也最近;1号和 2号种群均取自大盘山国家
自然保护区 ,相对于其他种群 ,这两个种群地理距离
也较近 ,从树系图上看两者的相似性较高;3号和 6
～ 8号种群情况与 1 号和 2 号种群相似 ,彼此的遗
传距离也较近;9号种群与其他 8个种群距离都较
远 ,在树系图上也显示了较大的遗传分化.而 9个种
群的海拔与生境条件等基本相似 ,可以排除因这些
因素造成种群遗传分化的可能.同时基于 RAPD谱
带表型的主成分分析(PCA)也支持 UPGMA 聚类结
果 ,图 4显示依据分析中提取的前 3个主成分获得
的三维排序分布图.通过以上的分析我们认为 ,种群
间的相对地理距离明显影响到七子花种群的遗传分
化 ,两者具有明显的对应性.
3　讨论与建议
通过以上分析可以看出 ,七子花种群间产生了
一定程度的遗传分化 ,且分化程度与种群间的地理
距离具有一定的相关性 ,这是其遗传结构的特点.以
往的相关研究表明 ,多年生濒危植物种群间多产生
明显的遗传分化 ,黄久香等[ 10] 利用 RAPD技术研究
了 4个观光木(Tsoongiodendron odorum)自然种群的
62 北　京　林　业　大　学　学　报 第 27卷　
图 3　基于 Jaccard数据矩阵聚类构建的
9个七子花种群的遗传树系图
FIGURE 3　Genetic dendrogram by using the between-groups linkage
algorithm to cluster Jaccard coefficient matrix
图 4　基于 RAPD表型数据的 9个七子花种群
遗传分化 PCA三维排序图
FIGURE 4　PCA three-dimensional ordination of plot of 9
populations based on the RAPD phenotype data
遗传多样性 ,结果表明其种群间产生了较为明显的
遗传分化 ,且其遗传距离有随地理跨度递增的趋势 ,
这与本文的结果类似;邓洪平等[ 11] 利用同工酶电泳
技术对濒危植物缙云卫矛(Euonymus chloranthoides)
的遗传分化进行了研究 ,结果显示 ,由于特有的生物
学特点和环境隔离等原因 ,不同种群间产生了较大
的遗传分化;张颖娟等[ 12] 分别利用等位酶和 RAPD
技术研究了鄂尔多斯特有种四合木(Tetraena
mongolica)种群的遗传多样性 ,发现其种群间分化较
为明显 ,也与本文的研究结果相似 ,不同之处在于四
合木种群间的遗传距离与地理距离并无直接相关关
系.但并非所有的研究都如此 ,比如肖宜安等[ 13] 利
用同工酶电泳技术来揭示井冈山长柄双花木
(Disanthus cercidifolius)种群的遗传多样性和遗传分
化 ,结果表明 5个种群间的遗传分化不明显;李巧明
等[ 14] 利用同工酶电泳技术对望天树(Parashorea
chinensis)居群的遗传结构及分化进行了研究 , GST值
仅为 0.030 ,表明种群间仅存在低水平的遗传分化.
七子花种群间遗传的高度分化表明其种内存在
着较高程度的近交 ,这与以前的观察和研究相一致.
从花的外观形态上看 ,七子花为虫媒传粉 ,而边才苗
等[ 15] 的研究表明 ,七子花没有自花授粉限制机制 ,
同株传粉和异株授粉的结实率相差不大;七子花总
是成群出现 ,而在群与群之间则少见.同时通过野外
调查 ,我们发现七子花具有较强的无性繁殖能力 ,因
其自身的生物学特点(结实率低 、种子的休眠期长 、
发芽率低),无性繁殖作用更为突出 ,能在一定程度
上降低片断化小种群的遗传漂变 ,减轻了生境片断
化的影响;七子花为多年生植物 ,寿命较长(大盘山
自然保护区有一株七子花株龄在 500 a 以上),有限
的片断化时间内小生境效应对其影响不大.综合以
上因素我们认为七子花自身的生物学特点是造成种
群间的遗传分化的主要原因 ,片断化后的瓶颈效应
进一步加重了这种趋势 ,而片断化造成的种群间基
因流的减少以及小种群效应(主要是遗传漂变)对七
子花遗传多样性影响不大 ,所以在没有人为破坏和
环境变化等因素造成七子花大规模消亡的情况下 ,
七子花种群的遗传多样性在短期内不会降低 ,现状
将维持相当长的时间.
基于以上分析结果 ,目前对于七子花的保护我
们建议可采取以下两种措施:①尽可能保护较多的
种群数目.这样能有效地保护七子花的遗传多样性 ,
但每个种群包含的个体数目并不需要很多.②适当
增加遗传分化较大的种群间的基因流 ,用以提高七
子花种群遗传多样性 ,提高种群整体对环境的适应
能力.
虽然不能完全排除实验过程中造成的可能影
响 ,但从基于 RAPD谱带的聚类和主成分分析的结
果判断 , RAPD结果较好地反映了七子花种群间的
遗传差异信息 ,因此 RAPD技术应用于七子花研究
能够揭示其种群间的遗传差异性.我们通过濒危物
种七子花种群间遗传差异性的初步研究 ,为七子花
种群遗传多样性的揭示提供可行性途径 ,同时获得
了七子花种群遗传多样性与遗传差异分布的初步资
料 ,这对于我们后续研究和制定科学的保护对策都
具有重要的参考价值.
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(责任编辑　董晓燕)
64 北　京　林　业　大　学　学　报 第 27卷