全 文 ：癌变 · 畸变 , 突变 1 9 9 0年第 2 卷第 生期 1 .
夺,
紫露草四分体微核计算机图象分析 `
林光恒 吕 红 徐建华” 夏文杰料 孙慰迟“ 金旭 东” 马德修林 .
中国科学院海洋研究所 . ’ 上悔复旦大学 ` ” 美国西伊利诺大学
摘要 环境污染物紫露草 ( rT ad es c a时 ` a )四分体微核生物检测法是一种有效的测定污染物遗传毒性的 短 周
期方法。 该方法已被许多实验室和环境保护监测部门用来进行环境诱变剂的检测和现场污染监测之用 。 为
了提高该方法的效率和精度 , 并使四分体微核计数过程标准化以减少主观误差 , 我们进行了交又学科的联
合玫关研究 , 成功地推出了一种紫露草四分体微核计算机图象分析处理系统。 该系统使四分体微核计数 和
数据统计分析都能在计算机中同时进行 , 因而不仅降低了计数过程的主观误差 , 而且使工作 效 率 明 显 提
高 。
关键词 紫露草 , 微核 , 诱变剂 , 计算机 , 图象分析系统
奋
环境污染不仅危及当代人类的生活与生
存 , 而且 也对人类社会的未来造成 重 大 威
胁 。 如何将环境中以及人类生活各个领域中
形形色色的污染物检测出来 , 并加以治理或
排除 , 已是各国科学家面临的一项既繁重又
艰巨的任务。 近十数年来最引人注目的进展
之一是遗传毒理学家 己经建立起数十种可以
用来检测具有潜在诱变作用和致癌作用化学
物质的生物学方法 l[ ’ 2 ` “ I, 从而可以把 存 在
于大气中、 水体中 、 土壤中 、 生物中 , 以及
食品 、 饮料 、 医药 、 农药 、 日用化妆品中可
能含有的诱变剂和致癌剂检测出来。 大量的
事实和研究结果表明 , 具有诱变作用效果的
物质不仅门类多 , 而且涉及范围相当广泛 ,
与人类的关系也相当密切 , 这些物质既有生
物碱 、 抗菌素 、 抗代谢物、 某些重金属离子
和一些高分子化合物 , 也包括一些人类 日用
化学用品山 。
在已经推出的三大类生物检测系统中 ,
微生物系统和动物 (包括人体细胞 )系统历史
较久 , 已广泛被采用 , 而植物系 统 发展 较
晚 , 历史较短 , 只是近数年来进展才比较迅
. 中国科学院海洋研究所调查研究报 告第 16 68 号 ; 中国
科学院 自然科学蓦金 资助研究项 目
速 ,并显示 出巨大的优越性和应用潜力 , 已为
世界许多遗传毒理学家和环境保护监测部门
所采用 价’ 。 l。 紫露草花粉母细胞四分体微 核
测定法 (简称 T r ad 一M C N T eS O是国际上著名
遗传毒理学家马德修教授创立的一种环境诱
变剂植物监测技术 口 ’ . 1 , 经许多实验室应 用
表明 , 该技术具有 : 1 .材料培养容易 , 可以
终年取用 , 2 . 不需复杂仪器设备 ; 3 . 操作
技术不繁杂 , 易于在各实验室和环境污染监
测部门推广采用 ; 4 . 多年应用表 明 , 该 技
术具有广泛的全能性 , 适用范围 广卜 ’ 习 J。 尽
管该技术本身具有上述一些优点 , 很适用于
监测环境中的诱变污染物 , 然而面对着人类
生存环境中各种各样的污染物和年以千计增
加着的各种人工合成化合物 , _作为一种有效
的诱变剂饵筛手段 , 该技术还是有待完善和
发展 。 主要表现在目测显微镜下四分体微核
计数效率较低 , 同时由于观测者熟练程度的
不同 , 所产生的主观误差 , 对结果的精度和
可比性都有一定影响 。
为了提高紫露草四分体微核分析技术的
精度和效率 , 以适应大量样品粗筛的需要 ,
我们于 1 9 8 6年始将现代计算机图象分析技术
与环境污染物紫露草四分体微核分析技术相
结合 , 开展交叉学科的联合攻 关 研 究 。 同
时 , 也为生物学和医学领域中许多显微镜下
的繁重观测计数工作的计算机化探索一条新
路 。
1
. 紫露草四分体微核计算机图象分析 系 统
概述
1
.
1 硬件系统
1
·
1
.
1 系统总框图
为适应紫露草四分体微核图象 分 析 技
术的需要 , 采用目前 国 际 上 流 行 的 I nt el
8 0 3 8 6 芯 片 为 C P U 组 成的主机 , 具有微型
化 、 多功能化 、 软件硬化之特点 。 整个系统
利用进口部件组装 , 系统总框图如下 :
一一 {F G 一 10 5实时图象处理板
…二亚亚二.{摄象
!
一监视器…一…一…机
打印机一鼠标器一显微镜
图 1 硬件系统总框图
2 硬件配置
A
.美国 U S 一 3 86 微机
B
. 实时图象处理板 (F G 一 105 型 )
C
.
E leC tr
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13 护高分辨率 长 余
辉彩色监视器
D
.
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E
.
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F
.
R C A T C 7 0 0 0 6 5 0线黑白摄象机
G
.
M
一 1 7 2 4 24 针打印机
.
3 主要技术指标
A
.图象图形分辨率 : 51 2 x 51 2象素
B
.图象灰度级 : 256 级
C
.图象实时采集速度 40 0 5/ 帧
D
.实时采集图象 数 : 1 0 24 x 1 0 2 4
x 1 2 b i t l 帧 或 5 12 x 5 12 x 12
b i t 4 帧
E
.显示格式 : 黑白 5 12 x 5 12 b计
或 2 5 6、 x 2 5 6 b i t
伪彩色 5 1 2 x 5 1 2 b i t
或 2 5 6 x 2 5 6 b i t
F
. 自检测试信号 :
① 几何线性测试信号 : 方格 信 号
(三种 )
② 灰度测试信号 : 2 56 级灰度 (水
平垂直二种 )
③ 清晰度测试信号 : 5 12 线 (水平 、
垂直二种 )
G
.外存 ( 4 0M B )硬盘可容 纳 5 12 x
5 1 2 x s b i t 图象 1 5 0 帧以上
由于本系统是引进国外先进的主机和部
件组装 , 这样可以加快图象分析方法和软件
的研制速度 。 同时 , 由于 sU 一 3 86 微机的功
能在很多方面 已 经超 过 了 v A x l 汀 8。和
M icr 。 一 v A x l , 而价格不到其十分之 一 , 从
而提高了整个系统的性能价格比 。 另外 , 本
系统还具有脱机自检能力 , 便于 调 机 和 维
护 。 再则 , 采用目前流行 的 I nt el 8 0 3 8 6 主
机和 C P U 芯 片 , 对 i B M P C / x T 和 A T 机
软件向上兼容 , 这样就便于推广应用软件和
配接其它兼容微机 。
1
.
2 软件系统
1
.
2
.
1 系统工作流程图
为了使紫露草四分体微核计算机图象分
析能达到准确 、 快速的目的 , 我们设计出下
列软件系统工作流程图 :
峰
(
一丽蔽 一卜藏藏间一}嘎骊萝!l幸
{三伞卜巨亘i亚昼}一 }夔夔…
{蜘趣)一…竺缨创户卜日三乡咬i
图 2 软件系统工作流程图
.
2
.
2 设计原则
A
. 软件系统采用模块化结 构 , 调
子形式 ,
B
.软件系统尽量利用 u s 一 3 86 微机
与 F G 一 10 5 图象处理板的硬件 功
能以提高处理速度 ,
C
.软件系统具有较强的自动处理与
检测能力 , 又具有较强的人机交
互能力 ,
D
.软件系统采用规范化设 计具 有
较强的移植性 。
.
2
.
3 设计特点
A
. 图象背景灰度补偿 ;
B
.图象多门限整体分割处理 ;
C
.基于形状规则的图象局部区域重
新分割 ;
D
. 形状分析 ,
E
.判别正常四分体和微核 的 准 确
性 ;
F
. 输出数据的多样性 和 直 观 性 。
.
2
.
4 系统功能
本软件系统由一个主执行程序和多个子
程序构成 , 按视野窗口移动并连续提取紫露
草四分体图象 , 自动检测出 :
A
.不含微核的正常四分 体 总 数 ,
B
.含 n个微核的四分 体 总 数 , n 二
1 , 2 , 3…
C
.计算出微核频率 , 即每 10 0个四
分体中的微核数 ;
D
.根据生物统计学公式计 算 差 异
显著度 ;
E
.输出各种数据 。
2
. 紫露草四分体橄核计算机图象分析 _系 统
效率
2
.
1 机测与目测效果比较
为了检验该系统的工作效率及 其 准确
性 , 专家组对系统进行鉴定并将该计算机图
象分析系统测定的结果 (简称机测 )和用显微
镜直接计数结果 (简称 目测 )进行比较 , 结果
列于表 1。
表 1 机测与 目浏效果比较
A 表
_ _ _ _
_ 机 “ 一
j
-
- 一且 - 一一工 - - -一-一处 理 组 微核率 (% ) 耗 _时 (分 ) 处 理 组 微核率 (% ) 耗 时 (分 )
n曰nó州é
.…,口nù门éùO4noCQ1 6 8。 7 0 10 。 02 3 9。 9 0 8。 03 3 8 。 6 9 1 1 。 2
盛 4 0。 3 0 1 2。 0
1 6 3
。
9 0
2 7 9
。
5 0
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。 1 0
盛 6 5。 3 0
平 均 6 8。 9 5 3 7。 0
B 表
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一二一一一燮 一一一一竺兰一 - 一 - }一 -一兰一 -一塑生一一一二 i一一一 -一半 均 3· 。 6 1 1 · 2 ! 平 均 4 · 5 0 1 2 · 3
从表 1 可以看 出无论在对照组 (微 核 率
低 )还是处理组 (微核率高 )中 , 机测的 速度
均比目测为快 , 特别是在处理组中 , 由于微
核频率高 , 机测速度与目测速度之间差异明
显补大 , 前者 (平均耗时仅 10 . 3 分 ) 比 后 者
(平均耗时 37 分 )快 3 倍多 。 同时 , 由 于 主
观误差的减少 , 大大地提高了结果的精度和
可比性 。
值得说明的是表 1 中微核率在机测与目
测方面 , 不论是处理组或是对照组都存在一
定差异 , 机测微核率普遍低于目测微核率 。
出现这种微核率偏低的原因 , 主 要 有 二 方
面 , 一是摄象机对微核的分辨率低于肉眼 ,
特别是对于很小的微核或略有重叠但肉眼仍
可分辨 出是不同的微核的情况下 , 机影往往
就难以将它们分辨并统计出来 , 二是由于同
一视野内的微核 , 受人工制片的限制 , 很难
全部都聚焦在同一平面上 , 当图象采集时 ,
就可能有个别微核未能采集进入计算机 。 鉴
于环境因诱变剂的存在而造成的污染是通过
与对照或正常状况相比较来判别污染与否及
程度的 , 因此 , 微核率在对照组和处理组中
相对应地降低 , 对最后结果的判断并无特别
影响 , 因为 , 即使是用目测计数时 , 也有个
别微小的肉眼难以分辨出的微核被排除在统
计数之外 。
2
.
2 影响机测效率的因素
2
.
2
.
1 四分体密度
由于每张片子至少要统计 30 0 个四分体
因此片子上四分体密度状况直接影响到摄入
的视野数 目 , 密度越低 , 要摄入的视野数就
越多效率就降低 。 然而 , 四分体密度也并非
越大越好 , 密度太大 , 往往会造成四分体拥
挤重叠现象的出现 , 给计算机图象分析处理
造成困难 , 反而降低了微核率和分析精度 。
较合适的密度是每个输入视野内的体四分数
在 1 0 一 25 个范围内 。
2
.
2
.
2 显微镜放大倍数
显微镜放大倍数对机测微核率有一定影
响 。 一般情况是 , 倍数较低微核率也较低 ,
倍数较高 , 则微核率也较高 , 且技近于目测
微核率 。 表 2 列出了显微镜放大倍数对机测
微核率影响的测定资料 。 从表上 , 我们可以
看 出 , 机测时 , 显微镜放大倍数不同 , 微核
率是有差异的 , 当放 大 倍 数 为 6 . 7 X 10 倍
时 , 平均微核率为 15 . 27 % , 而倍数为 6 . 7 X
2 0 时 , 平均微核率达 23 . 20 % , 这一数字 与
在 10 x 4 0 倍显微镜下 目测观察统计 出 的 平
均微核率 2 5 . 72 %是较接近的 。
因此 , 适当的显微镜放大倍数 , 对保证
表 2 显微镜放大倍数对机测微核率的影响
— 一—— —一一花丁 ` — 一 ’ 一一-一 ” , 一一 ’一 ” “ 。 . ’ “一~ . .一 .一 : l二一 ” ’ 一 `刁` 侧 曰 酬定数测次6。 7 又 1 0倍时微核率 (纬 ) 6。 7 x 2 0倍 时微核 率 (肠 ) 1 0 K弓0倍 时微核率 (% )定数测次
1 2 5
。
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2 2 5
。
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。
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。
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平均微核率 15。 2 7士 3。 12 2 3。 2 0士 2。 委 1
一 { 平均微核 率 2 5 .殆 士 2 . 16
机测的效率和精度 , 减少相对误差 , 仍然是
不可忽视的 。
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参 考 文 献
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1 9 8 1
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1 9 8 3
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.
6
. 中国环境监测总 站编 。 环境监测技术规 范 , 第 四
册 , 生物监测第六节 。 国家环境保护局 出版 ,
19 8 6
7
。
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。
M u t a t R e s 1 9阳 , 6 4 : 3 0 7一 3 1 3 .
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(上接第 70 页 )
中只有二个剂量组和对照组 。 试验分组少 。
这是本试验的不足之处 , 致使图 1中只有三
个点 , 但三点的线性关系是显著的。 文献 sIJ
报导了 S D 种大鼠在 X 射线一次照射 24 小
时后 , 性细胞微核率随着剂量呈线性增加 ,
在 50 ar d 时 , C与对照组有明显的差异 , 在
9 0 0r a d 时 , 微核率最高 , 然而在 12 0 0 r a d 时
又稍下降 , 在我们的实验中是多次照射 , 高
剂量组每天的组织剂量为 1 . 51 ar d , 低剂 量
组为 0 . 6 9ar d , 也同样表明微核细胞率 随射
线的剂量呈线性增高 , 但本试验的组织剂量
要比文献中的低得多 , 因此对于慢性小剂量
作用下 , 对微核的影响 , 应进一步研究 , 以
判定剂量— 效应关系 。3 . 试验的结果表明 , 微核的细胞 率 没
有随着饮入氖水时间的延长而增加 , 也就是
说微核率不是随着累积剂量的增加而升高 ,
而是处于一个 “稳定 ” 损伤状态 , 在有关文献
中指出例 , 给药次数的改变对微核率的影响
不明显 , 多次给药并不能使微核率增加 。 在
一般的辐射生物效应 中 、 剂量的累积作用是
明显的 , 然而在微核细胞率上却不明显。 原
因何在 ? 我们认为在一次照射之后 , 随着时
间的延长 , 微核细胞率越来越少 , 这是由于
损伤修复和丢失的结果 , 在慢性长期作用的
时候 , 虽然损伤也有恢复 、 但损伤也在不断
的产生 , 只有恢复和产生达到平衡。 才会出
现“ 稳定 , 的损伤状态 。 另一方面也应考虑到
血细胞的寿命是有限的 , 在正常情况下 、 血
细胞在不断的死亡 , 消除和生成 , 处于动态
的平衡中 , 也许这种血液成分的动态平衡对
上述的“ 稳定 ” 状态有一定作用。
4
. 试验的结果证明氛水能够致肿瘤 (另
文发表 ) , 同时也能致突变 , 引起染色 体 畸
变和微核的形成 。 但在我们的试验条件下 ,
肿瘤和微核之间却看不出有相关性 。 在有关
的报导中指出 , 在恶性疾患的病人中 , 其末
稍血淋巴细胞的微核出现率明显地高于非癌
患者 , 而我们的结果中却看不出这种关系 。
我们认为这可能和氛水的不断作用有关 , 氛
水对机体的不断作用掩盖了单纯肿瘤产生和
微核形成的关系 , 在本试验中肿瘤和微核形
成二者都是氖水所致 , 而不是单纯的肿瘤与
微核的关系 。
(王丽娟同志参加了本文的部分工作 )
参 考 文 献
1
。 云甫动物研究 所辐射细胞组 。 遗 传 学 报 1 9 78 , 5
( 2 )
2
。 张昌杰 , 等。 华中师范学院学报 1 9 5 0 , (2 : 4 6
3
。
L A H D E T IE J
。
M u t a t R e s 1 9 8 1 , 8 1
.
4
。 相立新 , 等。 青篙素对小鼠骨留多染红细胞 徽 核
率的影 响。
5
. 张昌杏 , 等。 庙症患者外周血 淋巴细胞徽核 的 观
豢 。
C ar e in o ge n e si s
,
T
e r a t o g e n e s i s a n d M u t a g e n e , 15 V o l Z N o 4 1 9 9 0 .
8 7
·
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g e n o t o x ie i t y o f P o l l u t a n t s
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T h i s t e e h n iq u e h a s b e e n a d o P t e d in d e t e e t i n g a n d 艺n ￡i才“
m o n i t o r i n g o f e n v 让o n m e n t a l mu t a g e n s i n am n y e o u n tr i e s
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e o m P u t比 s e i e n e e . hT i s n e w 加 e i l i t y 15 e a l l e d 介 a d e s ca n t i a ~ M icr o n u e l e i
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T h e s o f tw a r e f o r t h i s s y s t e m 15 w r i t t e n i n
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o r o f s e or e s i n tr o d u e e d b y d i f f e r e n t o b s er v er s
.
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S y s t e m wa
s a b o u t 4 t im e s a s f a s t a s t h a t o f h u m a n h a n d s e o r i力 g , a n d t h e d a t a
e a n b e P r o e e s s e d a n d s t a t i s t i e a l l y a n a l邓 e d im m e d i a t e卫y a f t .el o Pear t i o n
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F O RMAT IO N O F HUMAN E M日RYO F口B RO B LA S T C艺L LS INO U C EO
B Y C HE M! C AL C AR C IN O G EN IN V IT RO
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S u n Y a t
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S e n U n i v er s i t y o f M e d i e a l S e i e n e e s
T h e
b i o l o g i e a l
P u r P o s e o f th is
5 1名n i企i e a n e e i n
s t u d y w a s t o i n v e s t ig a t e s o m e b i o l o g ica l ma
r k e r s a n d t h e i r
t h e P r o e e s s o f h u ma
n e e l l ma l ig
n a n t t r a n s f o r ma
t i o n
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