全 文 ：第 38 卷 第 4 期
2014 年 7 月
南京林业大学学报(自然科学版)
Journal of Nanjing Forestry University (Natural Sciences Edition)
Vol． 38，No． 4
Jul．，2014
doi:10． 3969 / j． issn． 1000 － 2006． 2014． 04． 007
收稿日期:2013 － 09 － 04 修回日期:2013 － 12 － 12
基金项目:国家自然科学基金面上项目(31270663) ;国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2013ZX08009 － 003 － 002)
第一作者:张通，硕士生。* 通信作者:张凌云，副教授，博士。E-mail:lyzhang73@ sohu． com。
引文格式:张通，周燕妮，李长江，等． 青杄 PwWrbA基因克隆及表达分析［J］． 南京林业大学学报:自然科学版，2014，38(4) :34 － 38．
青杄 PwWrbA基因克隆及表达分析
张 通，周燕妮，李长江，张凌云*
(北京林业大学，省部共建森林培育与保护教育部重点实验室，北京 100083)
摘要:色氨酸阻遏结合蛋白(tryptophan repressor-binding protein，WrbA)是一种重要的抗氧化酶类，参与了多种逆
境反应。笔者通过 ＲACE － PCＲ的方法克隆得到青杄 WrbA基因的 cDNA全长，共 1 045 bp，编码区 651 bp，编码
203 个氨基酸。利用生物信息学工具对其进行理化性质、二级结构和三级结构的分析，该蛋白理论分子质量
21. 80 ku，pI值 6. 43，N端 11—15 位氨基酸和 C端 112—165 位氨基酸是 FMN结合位点。荧光定量 PCＲ和半定
量 ＲT － PCＲ发现青杄 PwWrbA在各组织中都有表达，但在针叶中表达量最高。同时，PwWrbA在 NaCl和 ABA胁
迫处理后表达量升高，H2O2也会影响其表达的改变，H2O2 处理 6 h 后表达量上调。因此，PwWrbA 是一个新的
WrbA基因，推测其可能在青杄逆境胁迫应答中发挥作用。
关键词:青杄;WrbA基因;生物信息学;组织表达;胁迫响应
中图分类号:Q78;S792 文献标志码:A 文章编号:1000 － 2006(2014)04 － 0034 － 05
Cloning and expression analysis of WrbA gene from Picea wilsonii
ZHANG Tong，ZHOU Yanni，LI Changjiang，ZHANG Lingyun*
(Key Laboratory of Forest Silviculture and Conservation of the Ministry of Education，Beijing Forestry University，
Beijing 100083，China)
Abstract:The tryptophan(W)repressor-binding protein (WrbA)is an important antioxidant enzyme which has been
shown to play roles in a variety of adversities． In this study，PwWrbA cDNA was cloned by ＲACE-PCＲ method． Bioinfor-
matics analysis showed that the full length of PwWrbA cDNA was 1 045 bp，including the OＲF 651 bp，encoding 203 a-
mino acids． The theoretical molecular weight was 21． 80 ku and value of pI was 6． 43． The ScanProsite online software
showed that the N terminal 11 － 15 aa and the C terminal 112 － 165 aa were supposed to be the FMN binding sites． ＲT-
qPCＲ and semi-quantitative ＲT-PCＲ analysis showed PwWrbA expressed in various tissues，while the highest expression
level was in pollen． Meanwhile，the expression of PwWrbA increased gradually after stress treatment with NaCl and ABA．
In contrast to NaCl and ABA treatment，the expression of PwWrbA decreased in early stage and increased at 6 h after H2O2
treatment． Our results suggested that PwWrbA was a new WrbA gene and played roles during different abiotic stresses．
Key words:Picea wilsonii;WrbA;bioinformatics;tissue expression;stress response
色氨酸阻遏结合蛋白(the tryptophan repressor-
binding protein，WrbA)因和色氨酸阻遏物(TＲPＲ)
同时分离出来而得名，最初的研究表明它能促进
TＲPＲ与目的基因非特异地形成共价复合物［1］。
Grandori等［2］、Patridge 等［3］将 WＲBA与 NAD(P)H
(醌氧化还原酶)进行多序列比对，由于二者都有
共同的保守结构域而把 WＲBA 归为醌氧化还原酶
类。后来，Wolfova 等［4］从晶体结构证明了 WrbA
是具有统一结构的黄素蛋白中心成员。许多研究
表明，大肠杆菌中 WrbA 受胁迫响应 SIGMA 因子
ＲpoS控制，在受到酸、盐和过氧化氢等胁迫下表达
量增加［5 － 9］。另外有实验表明其在氧化胁迫中起
作用，如 Liu等［10］的研究发现，醌含量减少时，Ar-
cA发生磷酸化，此时大肠杆菌 WrbA 表达受到抑
制;在厌氧条件下，硝酸还原酶调节蛋白抑制了大
肠杆菌K －12WrbA的表达［11 － 15］。目前黄素蛋白类
在生物体生长发育及抗逆过程的作用越来越受到
重视，但在植物中的研究目前还不够深入。
青杄(Picea wilsonii)是我国特有的常绿乔木，
具有较广的地理分布和非常强的逆境适应能力，是
进行抗逆基因克隆及研究抗逆机理的理想树种。
笔者通过 ＲACE － PCＲ 的方法，从青杄 cDNA 文库
第 4 期 张 通，等:青杄 PwWrbA基因克隆及表达分析
中克隆得到一个醌氧化还原酶的全长 cDNA序列，
并对该序列进行生物信息学分析。采用荧光定量
PCＲ和半定量 PCＲ分析其在青杄各组织中的表达
情况，并进一步研究其在青杄响应非生物胁迫如
NaCl、H2O2、ABA等条件下的表达模式。
1 材料与方法
1． 1 试材处理和试剂
青杄种子、花粉采集于中国科学院北京植物
园，青杄幼苗的培养基质为草炭土与蛭石(体积比
为 1∶ 1) ，温室相对湿度 60% ～ 70%，日照时间 16
h。用于组织表达的 2 年生青杄的根、茎、针叶用液
氮速冻，－ 80 ℃保存。胁迫响应实验参照文献［16
－ 17］的方法，采用生长 8 周、长势一致的青杄幼
苗，将根分别浸入水(对照) ，100 mmol /L NaCl，10
μmol /L H2O2中处理 1、3、6、12 h 和 100 μmol /L
ABA中处理 0． 5、1、3、6、12 h。每个处理取 5 株幼
苗，液氮速冻后 － 80 ℃保存。
植物 ＲNA 快速提取试剂盒，第 1 链反转录试
剂盒(TUＲEscript 1st Strand cDNA)购于艾德来公
司，荧光定量 PCＲ 试剂盒(SYBＲ Green SuperＲeal-
PreMix)购于 TIANGEN(北京)公司，荧光定量 PCＲ
仪为 ABI公司的 StepOnePlus。
1． 2 青杄 PwWrbA全长 cDNA的获得
青杄 cDNA文库通过 Gateway方法构建，由 In-
vitrogen(上海)公司完成［14］。在前期构建的多年
生青杄均一化 cDNA 文库的基础上，根据青杄 Wr-
bA的 EST序列和 pDONＲ222 载体两端设计特异引
物进行 5端和 3端的 ＲACE － PCＲ 实验。扩增的
PCＲ 产物连接到 pEASY － T1，转化大肠杆菌
DH5α，选取阳性克隆进行测序，将扩增到的序列与
EST片段进行拼接，得到青杄 PwWrbA 的 cDNA 全
长。设计引物从青杄总 cDNA 库中克隆 WrbA 的
OＲF，所用引物序列见表 1。
表 1 cDNA克隆及荧光定量 PCＲ与半定量 PCＲ所用引物
Table 1 Primers used in cDNA cloning，qＲT － PCＲ
and semi-quantitative PCＲ
引物
primer name
上游引物序列 5 － 3
upstream primer (5 － 3)
下游引物序列 5 － 3
downstream primer (5 － 3)
5ＲACE 5 － CAGTCTTAAGCTCGGGCCCCA －3 5 － GTTGAGTTCGCCATAGCCCAC －3
3ＲACE 5 － CTTGCTGGCATTGCAAAGTAT －3 5 － CTGCCAGGAAACAGCTATGAC －3
OＲF － PCＲ 5 －ATGGCCGTCAAAATTTACATT －3 5 － CTAGGCTTCCCCCTTGAGTTT －3
ＲT － qPCＲ 5 － CTCAGTTTAAAGCTTTCTTGG －3 5 － AGCATGCCATGGTGAACCAGC －3
ＲT － PCＲ 5 － TGTCGATTAGCGGACTGGC －3 5 － TGACTTCAGACCTGCTACCTG －3
EF1 －α 5 － AACTGGAGAAGGAACCCAAG －3 5 － AACGACCCAATGGAGGATAC －3
1． 3 PwWrbA生物信息学分析
利用 DNAMAN软件找到 PwWrbA的 OＲF，并进
行蛋白翻译预览，找出其编码的氨基酸序列。用
Blast在 NCBI中搜索其他物种中 WrbA 相似基因序
列，利用 CLUSTAL － X软件进行氨基酸多序列比对
分析，并用 MEGA －5软件基于邻位相连法构建系统
发育树。用 Compute pI /Mw 工具预测蛋白等电点和
分子质量(http:/ /web． expasy． org /compute _ pi /) ，
ProParam预测该蛋白分子式及不稳定指数(http:/ /
web． expasy． org /protparam /) ;SignalP 做信号肽预测
(http:/ /www． cbs． dtu． dk /services /SignalP /) ;
PSOＲT进行蛋白亚细胞定位(http:/ /psort． hgc． jp /
form． html) ;cbs － netpho对磷酸化位点进行预测(ht-
tp:/ /www． cbs． dtu． dk /services /NetPhos /) ;ScanPros-
ite对蛋白进行功能位点预测(http:/ /prosite． expasy．
org / scanprosite /) ;ProtScale 分析蛋白疏水性(ht-
tp:/ /web． expasy． org /protscale /) ;FoldIndex 做无序
化特征预测(http:/ /bip． weizmann． ac． il / fldbin / find-
ex) ;WrbA 二级结构和三级结构则分别用 SOPMA
(http:/ /pbil． ibcp． fr /htm / index． php)和 SWISS(ht-
tp:/ / swissmodel． expasy． org /)进行预测。
1． 4 PwWrbA的表达分析
采用植物 ＲNA快速提取试剂盒分别提取青杄
根、茎、针叶、花粉及种子总 ＲNA，并以不同处理
(NaCl、ABA、H2O2)及处理时间(0、1、3、6、12 h)的
青杄 cDNA为模版，检测 PwWrbA 的相对表达量。
选择 EF1 － α为内参基因［15］，每个反应设置 3 次重
复，取 3 次实验的平均数据，所用引物见表 1。
2 结果与分析
2． 1 青杄 PwWrbA的全长 cDNA克隆结果
用 DNAMAN6． 0 软件分析 ＲACE 实验得到的
PwWrbA cDNA长为 1 045 bp，起始密码子 ATG 出
现在 43 bp，终止密码子 TAG 出现在 651 bp，在
1 026 bp 出现 PolyA 尾巴。设计引物 OＲF － F，
OＲF －Ｒ克隆 WrbA的编码区，并将其构建到 pEASY
－ T1 载体上测序验证，测序结果与预测结果一致。
WＲBA序列图见图 1。
2． 2 PwWrbA序列特征预测与分析
2． 2． 1 PwWrbA结构和理化特性预测
通过 DNAMAN6． 0 软件对 PwWrbA进行翻译，
发现其编码 203 个氨基酸;由 Compute pI /Mw 工具
预测理论分子质量为 21. 80 ku，pI 值为 6. 43;通过
ProParam 工 具 预 测 该 蛋 白 分 子 式 为
C990H1 533N251O287S8，带有负电残基(Asp + Glu)19
个，带有正电氨基酸残基(Arg + Lys)18 个，肽链中
Gly含量最多，共 27 个，占总量的 13. 3% ;其次是
53
南 京 林 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 第 38 卷
图 1 PwWrbA cDNA全长及其编码氨基酸序列
Fig． 1 Nucletide sequences and deduced sequence
of amino acid residues of PwWrbA
注:起始密码子 ATG、终止密码子 TAG和 FMN结合位点用
方框标出。
Ala，共 22 个，占 1. 8%，不稳定指数为 35. 53，低于
40 的阈值，预测此蛋白较稳定。PwWrbA不含信号
肽，因此不属分泌蛋白。磷酸化位点预测发现 Pw-
WrbA的 59、103、113 位氨基酸为丝氨酸(Ser)磷酸
化位点，23 位为络氨酸(Tyr)磷酸化位点。PwWr-
bA蛋白有 10 个酰基化位点，2 个酪蛋白激酶Ⅱ磷
酸化位点，在 N 端 11—15 位氨基酸和 C 端
112—165位氨基酸是 FMN 结合区域;蛋白疏水性
指数为 － 0. 125，表明该蛋白为亲水蛋白(图 2A)。
PwWrbA蛋白进行固有无序化分析的结果显示，Pw-
WrbA蛋白没有无序化特征，预测该蛋白有较强的
刚性结构，行使功能时其构象不会发生改变(图
2B)。用 SOPMA 工具分析氨基酸序列二级结构
(图 2C)表明，该蛋白中 α 螺旋中有 81 个氨基酸，
占总量的 39. 9%;无规则卷曲有 84 个氨基酸，占
41. 38%;延伸链和 β 转角各 25 和 13 个，分别占
12. 3%和 6. 4%。SWISS － MODEL 工具预测的三
级结构结果与二级结构相似(图 2D) ，并且可以看
出 αβ 卷曲的开放折叠片，这是黄素蛋白的典型特
征，在 4 个 β折叠股中穿插形成的独有 αβ 结构则
是 WrbA的特点［18］。
图 2 PwWrbA蛋白结构及理化性质分析
Fig． 2 Protein structure and chemical properties analysis of PwWrbA
2． 2． 2 多重序列比对及系统进化发育树
将 PwWrbA cDNA序列推导编码的氨基酸序列
在 NCBI的在线数据库进行 Blast，找到与 PwWrbA
一致性较高的同源蛋白有白云杉(Picea glauca，Pg-
WrbA，BT106108)、蓖麻(Ｒicinus communis，ＲcWrbA，
XM002534399)、葡 萄 (Vitis vinifera，VvWrbA，
FQ396884)、毛果杨(Populus trichocarpa，PtWrbA，
XM002319222)、番茄(Solanum lycopersicum，SlWrbA，
63
第 4 期 张 通，等:青杄 PwWrbA基因克隆及表达分析
AK323158)、拟南芥(Arabidopsis thaliana，AtWrbA，
BT010514)和 大 豆 (Glycine max，GmWrbA，
NM001250256)等。通过 CLUSTAL X 将青杄 PwWr-
bA氨基酸序列与这 7个物种同源蛋白多序列比对，
发现 PwWrbA在进化上相对保守，而且与白云杉 Pg-
WrbA完全相同(图 3A) ，说明青杄与白云杉在进化
上有相同的祖先，并在进化过程中云杉属这两个种
间在 WrbA基因上没有变异。青杄与木本植物毛果
杨氨基酸序列比对的相似度达 86%。用 MEGA5 构
建系统发育树，发现青杄与模式植物拟南芥和番茄
的遗传距离也比较接近(图 3B)。
图 3 WrbA蛋白多序列比对及系统进化树分析
Fig． 3 Multiple protein sequence alignment result
and phylogenetic tree of WrbA
2． 3 青杄 PwWrbA基因的表达及分析
用植物总 ＲNA 提取试剂盒分别提取青杄的
根、茎、叶和成熟花粉的总 ＲNA，反转录获得 cD-
NA，经均一化后进行荧光定量 PCＲ，设置空白和阴
性对照，每个反应设置 3 个重复。半定量 PCＲ 的
结果与荧光定量 PCＲ 一致(图 4A) ，结果表明 Pw-
WrbA在青杄各组织中都有表达，并且在针叶中的
表达量最高。
在 NaCl胁迫下，随着处理时间的延长，PwWrbA
的表达量逐渐升高，在12 h时达到最高，为对照组的
3． 8倍(图 4B)。在 ABA胁迫下，PwWrbA 的表达量
也随着处理时间的增加而增加，在 12 h相对表达量
为对照的3． 64倍(图4C)。受到H2O2胁迫后，在1 h
和 3 h 时 PwWrbA 表达量降低，但在 6 h 时突然升
高，为对照的 2． 4 倍，12 h 时降到 1． 7 倍(图 4D)。
为了排除水浸幼苗对 PwWrbA 表达量的影响，仅对
在水中处理 0、1、3、6或 12 h的青杄幼苗 PwWrbA的
表达量进行分析，结果发现表达量并无变化，显示了
该研究结果的可靠性和准确性。
图 4 PwWrbA在不同组织及各种逆境处理下
表达量的变化
Fig． 4 Expression patterns of PwWrbA
under NaCl and ABA treatments
3 讨 论
基于文库的 ＲACE － PCＲ 具有准确、简便等优
点［19］，通过 ＲACE － PCＲ 克隆得到的青杄 PwWrbA
的 cDNA序列全长结果表明，该基因共长 1 045 bp，
起始密码子出现在43 bp处，靠近50 bp，所以能初步
确定其为全长 cDNA。PwWrbA 蛋白由 203 个氨基
酸组成，预测在 11—15 和 112—165 氨基酸残基处
是 FMN的结合位点，Patridge等［3］的研究表明，在大
肠杆菌和古球菌中(LIV) (LIVFY) (FY)X(ST) (V)
X(AGC)XT(P)XXAXX(LIV)处是 FMN结合位点，
而预测位点中包含了 PwWrbA 保守功能结合位点。
亚细胞定位预测 PwWrbA定位于微体和过氧化物酶
体，而过氧化物酶体的作用主要是利用氧化酶和过
氧化氢酶将有害物质氧化，具有解毒的作用，对细胞
起保护作用，预示 WrbA可能在抗氧化胁迫方面起作
用。Wolfova等［20］预测WrbA 的晶体结构与哺乳动
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南 京 林 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 第 38 卷
物 NAD(P)H具有亲缘关系，而从系统进化树上看，
青杄 WrbA从进化上与白云杉没有发生分离，与毛果
杨、大豆等植物也保持了高度相似性，说明了 WrbA
进化的保守性。
最近的研究发现，拟南芥 FQＲ1 基因编码醌氧
化还原酶，过表达此基因可以增加黄素蛋白酶的活
性，防止生长素诱导的氧化应激［21］;醌氧化还原酶 1
在小鼠应对臭氧诱导的氧化胁迫是必不可少
的［22 － 23］。尽管2012年Kishko等［24］已经研究了Wr-
bA与醌和 NAD(P)H的复合结构，但目前对于WＲ-
BA在其他生物中相应功能的研究还比较少。笔者
利用荧光定量和半定量 PCＲ 分析表明，PwWrbA 在
青杄各组织中都有表达，在受到 NaCl、ABA 和H2O2
等胁迫后，PwWrbA 的表达量发生明显变化。NaCl
胁迫下，PwWrbA 的表达量在处理12 h后急剧升高，
而 ABA处理后，该基因表达量则随着处理时间延长
而逐渐增加，H2O2处理后表达量先降低随后又升高，
预示其在盐和氧化胁迫时发挥作用，同时表明其对
不同胁迫的反应时间的差别。但 PwWrbA 基因在青
杄抗逆反应中的具体功能，以及参与抗逆信号途径
和调控机制等还需要进一步研究。
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( 责任编辑 刘昌来)
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