全 文 ：甜叶菊（Stevia rebaudiana Bertoni）是菊科多年
生小灌木植物， 原产南美巴拉圭， 现世界各地引种
栽培均获得成功。 甜叶菊叶片中含有的甜菊糖甙甜
度是蔗糖的 250~300 倍， 但所含热量仅是蔗糖的
1/300， 是目前已知最甜的天然甜味剂[1-4]， 已经替代
糖精在食品、 医药等工业中得到广泛应用， 并对肥
胖症、 低血糖、 糖尿病、 小儿龋齿、 高血压、 心脏
病等具有一定的防治效果和辅助治疗作用， 是继甘
蔗糖、 甜菜糖之外有开发价值和健康推崇的天然蔗糖
替代品， 被国际上誉为 “世界第三健康糖源”[3，5-8]。
采用植物组织培养快速繁殖技术， 既可保持优良品
种的特征、 特性， 又可加速优良品种的繁殖。 利用
秋水仙素进行化学诱变获得多倍体是园艺植株育种
中的重要方法之一， 将化学诱变技术与组织培养技
术结合进行诱变育种具有其独特优势。 国内外有关
甜叶菊组培快繁已经有较多的报道 [5-14]， 但有关利
用秋水仙素进行甜叶菊多倍体离体诱变研究未见报
道。 本试验采用不同浓度的秋水仙素对茎段侧芽进
行化学诱变， 探讨秋水仙素浓度及处理时间对甜叶
菊茎侧芽成苗及试管苗生根的影响， 比较再生苗的
形态特征、 细胞染色体数、 叶片下表皮组织细胞学
特征， 旨在建立简单快速的甜叶菊多倍体诱导技术
体系， 为甜叶菊多倍体育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 田间材料由安徽蚌埠永生农业科
技有限公司提供的 ‘皖甜 1号’ 亲本株（2n=2x=22），
试管苗为安徽科技学院植物组织培养室培育。
1.1.2 基本培养基 茎段再生苗培养基为 MS+
6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+琼脂粉 5.0 g/L+蔗糖
30 g/L， 试管苗生根培养基为 1/2MS+IBA 0.5 mg/L+
琼脂粉 5.0 g/L+蔗糖 20 g/L。 高压灭菌前用 1.0 mol/L
KOH溶液调节为 pH6.0。
热带作物学报 2011， 32（9）： 1711-1714
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期： 2011-07-14 修回日期： 2011-09-06
基金项目： 安徽省教育厅省级重点自然科学基金项目（No. KJ2010A073）； 安徽省甜叶菊品种选育及栽培工程技术研究中心建设项目。
作者简介： 王 波（1955年—）， 女， 副教授。 研究方向： 植物保护与育种。 *通讯作者： 崔广荣， E-mail： cuigr64@sina.com。
甜叶菊多倍体离体诱导技术体系的建立
王 波， 崔广荣 *， 何克勤， 胡能兵， 林 平， 张子学
安徽科技学院植物科学学院， 安徽凤阳 233100
摘 要 以甜叶菊茎段为外植体， 用不同浓度的秋水仙素在试管苗茎段再生植株过程中进行不同时间处理， 探
讨适合于甜叶菊离体多倍体诱导的最佳秋水仙素处理时间和浓度， 初步建立甜叶菊离体诱导多倍体的技术体系。
结果表明， 秋水仙素对甜叶菊植株形成影响较大， 秋水仙素处理的最佳剂量为 0.1％处理 3 d， 再生植株总数高
且多倍体比率达 42.3％； 同时， 再生苗生根也受到了一定影响； 多倍体苗叶片厚实、 颜色较深、 植株矮化， 气
孔增大， 单位面积气孔数较少； 多倍体细胞核体积增大， 染色体数加倍。
关键词 甜叶菊； 离体培养； 秋水仙素； 多倍体
中图分类号 S566 文献标识码 A
Establishment of the Technique System of in vitro Polyploidy
Induction for Stevia rebaudiana Bertoni
WANG Bo, CUI Guangrong, HE Keqin, HU Nengbing, LIN Ping, ZHANG Zixue
Plant Science School of Anhui Science and Technology University, Fengyang, Anhui 233100, China
Abstract The stem sections of Stevia rebaudiana Bertoni were used as explants for polyploidy induction in vitro
with different concentrations of colchicines for different time treatments during shoot formation. It was investigated
that the best concentrations of colchicines and suitable treatment time in order to establish the technique system
of polyploidy induction in vitro for Stevia rebaudiana Bertoni. There was great effect of colchicines on plantlet
formation from stem section. The best treatment of colchicines was the concentration 0.1% for 3 d, and the ratio of
polyploidy was 42.3%. Meanwhile, the treatment of colchicines could influence the shoot rooting. The leaves of
polyploidy became thick and solid, the leaf colour changed dark and the plantlets got dwarf. The lower epidermal
stomata of the polyploidy got bigger. The nucleus of the polyploidy cell was bigger and the number of
chromosomes was doubled.
Key words Stevia rebaudiana Bertoni; In vitro culture; Colchicines; Polyploidy
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2011.09.026
第 32 卷热 带 作 物 学 报
A B
C D
A. 对照再生苗生长状况； B. 处理Ⅰ-3 再生苗生长状况； C.
处理Ⅰ-6 再生苗生长状况； D. 处理Ⅰ-9 再生苗生长状况。
图 1 秋水仙素处理对再生苗生长的影响
处理号 秋水仙素浓度/％ 处理时间/d 茎段成苗率/％ 苗平均高度/cm 苗生长状况
Ⅰ-1 0.1 1 72.2 b 1.3 b 苗较矮、 生长良好
Ⅰ-2 0.1 2 35.7 d 1.1 b 矮化， 叶色深、 部分畸形
Ⅰ-3 0.1 3 32.5 de 0.7 bc 矮化， 叶色深、 部分畸形
Ⅰ-4 0.2 1 75.0 b 1.2 b 矮化、 叶色深， 生长良好
Ⅰ-5 0.2 2 30.0 de 0.8 bc 矮化、 叶色深、 部分畸形
Ⅰ-6 0.2 3 22.7 e 0.6 c 矮化、 叶色深、 部分畸形， 叶片形成较多褐点
Ⅰ-7 0.4 1 52.7 c 1.1 b 矮化、 叶色深、 生长良好
Ⅰ-8 0.4 2 20.4 ef 0.5 cd 矮化、 叶色深、 部分畸形
Ⅰ-9 0.4 3 13.6 f 0.3 d 矮化严重、 叶色深、 部分畸形、 叶片形成较多褐点
CK 0.0 0 100.0 a 3.6 a 苗较高、 生长良好
表 1 秋水仙素处理对甜叶菊茎段侧芽成苗的影响
说明： 表中小写字母不同表示差异显著性， p=0.05。 下同。
1.1.3 主要药品 植物生长调节剂 6-苄基腺嘌呤
（6-BA）、 萘乙酸（NAA）及吲哚丁酸（IBA）、 秋水仙
素及 8-羟基喹啉等购于上海稼丰园艺用品有限公
司， 各药品均为分析纯， 蔗糖为市售白沙糖。
1.2 方法
在超净工作台上将甜叶菊试管苗去除叶片， 切
成带一侧芽长约 1.0 cm 的茎段， 接种于再生苗培
养基上， 每瓶接种 4 个茎段， 每处理接种 10 瓶，
置于培养室培养。 培养室温度（25±1）℃， 光照强度
约 30 μmol/(m2·s)（光源为 40 W 日光灯）， 光照时
间 12 h/d。 在超净工作台上分别滴加 0.1％、 0.2％
和 0.4％秋水仙素（过滤灭菌）， 确保秋水仙素溶液
浸润每个茎段， 并以滴加无菌水设 1空白对照。 各
秋水仙素浓度处理均设 1、 2和 3 d 三个处理时间，
由此形成 9 个处理和 1 空白对照， 各处理
见表 1。 秋水仙素处理完毕后， 分别用无
菌水漂洗 3 次， 将茎段转移至新的苗再生
培养基上继续培养， 直至芽苗形成， 然后
将芽苗接种于生根培养基中生根培养20 d。
观察茎段侧芽生长变化情况， 30 d 统计苗
再生数（再生率=再生苗茎段数/接种茎段总
数×100％）。 试管苗根长至 1～2 cm 时， 各
处理随机取 30 棵苗， 剪下 1 条根作常规
细胞压片技术进行染色体检测（0.002 mol/L
8-羟基喹啉预处理 2 h、 卡诺氏固定液固
定 24 h、 1 mol/L 盐酸及无水乙醇 1 ∶ 1 解
离液解离 30 min、 改良苯酚品红染液染色
10 min）， 撕取突变苗及对照苗叶片下表皮
观察组织细胞及气孔结构特征。 细胞组织
学检测用 OPTEC 数码显微镜 （BH300 -
DM2000， 中国）观察拍照， 试管苗用数码
相机拍照。 试验于 2010 年 3 月至 2011 年
5月在安徽科技学院植物组织培养室进行，
各阶段试验设 3 次重复 。 试验数据采用 Duncan
氏新复极差测验法（SSR法）进行差异显著性比较
（p=0.05）。
2 结果与分析
2.1 秋水仙素处理对甜叶菊茎段侧芽成苗的影响
从表 1和图 1可见， 秋水仙素处理对甜叶菊茎
段侧芽成苗及苗生长均有较大影响， 不同处理间差
异显著。 秋水仙素处理使侧芽成苗率普遍降低， 苗
叶片变厚、 叶色加深， 苗矮化现象较为严重， 且会
造成其部分伤害， 部分芽在成苗过程中甚至褐化死
去或形成不同程度的畸形苗（图 1-A、 B、 C）， 这
些效应随着秋水仙素浓度的增加和处理时间的延长
而加强。
1712- -
第 9 期
处理号
根初始形成
时间/d
根形成
率/％
多倍体
频率/％
生根苗
总数
嵌合体
频率/％
Ⅰ-1 6 83.7 b 17.2 d 241 1.7
Ⅰ-2 6 82.1 b 31.7 bc 203 0.9
Ⅰ-3 7 76.4 c 42.3 a 191 0.6
Ⅰ-4 8 73.3 cd 18.0 d 188 0.0
Ⅰ-5 10 66.2 d 36.0 b 171 0.0
Ⅰ-6 9 67.9 d 41.1 a 84 0.0
Ⅰ-7 13 44.4 e 32.7 bc 96 0.5
Ⅰ-8 13 41.2 e 40.4 ab 75 0.0
Ⅰ-9 15 38.8 ef 43.6 a 46 0.0
CK 6 100.0 a 0.0 e 677 0.0
表 2 秋水仙素处理对甜叶菊再生苗生根及多倍体诱导率的影响
2.2 秋水仙素处理对甜叶菊再生苗生根及多倍体
诱导率的影响
秋水仙素处理不仅对茎段侧芽再生苗产生重要
影响， 而且对再生苗后续生根影响较大。 由表 2可
知， 尤其是在相同处理时间条件下， 不同浓度间的
差异尤为明显， 处理间差异显著， 生根初始时间延
迟， 特定时间内生根率降低， 表现出诱变效应的延
续性。 从根尖细胞染色体鉴定结果看， 秋水仙素不
同浓度、 不同时间处理， 多倍体诱导率差异显著，
随处理浓度增加或处理时间延长， 多倍体诱导频率
有逐渐加大的趋势， 但多倍体形成频率并非无限制
加大。 同时， 随着秋水仙素浓度加大或处理时间延
长， 获得生根苗数逐渐减少。 综合本试验结果看，
处理Ⅰ-3 的剂量较为理想， 不仅多倍体频率高，
而且获得的苗数也较多。 此外， 染色体检测中， 也
发现了部分嵌合体植株， 这些嵌合体主要出现在低
浓度的秋水仙素处理后的再生苗中。
2.3 多倍体细胞染色体和气孔的特点
2.3.1 多倍体与二倍体根尖细胞 、 染色体比较
如图 2所示， 对照植株（二倍体）染色体数为 22 条，
细胞核明显较小； 多倍体植株染色体数加倍， 而且
细胞核也较大。
2.3.2 多倍体与二倍体叶片下表皮气孔比较 图 3
显示， 多倍体气孔较二倍体气孔明显较大， 多倍体
单位面积气孔数相对较少。
3 讨论与结论
用 0.1％秋水仙素处理茎段侧芽 3d 可得到较高
的多倍体诱导率和较多数量的甜叶菊多倍体植株，
秋水仙素诱导多倍体过程中会对再生植株产生较大
影响， 植株矮化明显， 叶色深、 叶片厚实； 细胞学
检测表明， 多倍体染色体数加倍， 细胞核较大， 叶
下表皮气孔增大， 数量相对减少； 甜叶菊多倍体离
体诱导技术体系初步建立。
利用秋水仙素进行化学诱变获得多倍体是园艺
植物育种中的重要方法之一， 将化学诱变技术与组
织培养技术结合进行诱变育种， 具有其独特的优
势 [15-16]， 诱导频率相对较高， 节约空间、 人力物
力， 筛选方便 [17-18]。 甜叶菊是以叶片计产量的经济
作物， 开展多倍体诱导研究在生产上具有极大的应
用潜力， 因为多倍体植株普遍具有植株形态巨大包
括叶片厚实、 叶片数多、 抗性强等特点。 利用秋水
仙素或其他诱导剂离体诱导多倍体在许多园艺植物
上都有报道， 如崔广荣等 [17-18]获得文心兰和蝴蝶兰
多倍体， 谷晓峰和罗正荣[19]获得了 ‘罗田甜柿’ 十
二倍体再生植株， 张志胜等[20]离体诱导获得了红掌
四倍体再生植株等。
影响植物离体诱导多倍体的因素较多， 包括外
植体生长时期、 诱变剂的浓度、 处理时间等 [15-18]，
其中诱变剂有效渗入外植体是获得较高比例多倍体
植株的重要保障， 本研究中采用试管苗茎段侧芽作
为外植体且在其再生植株过程中进行诱导处理， 由
于试管苗侧芽体较小， 有利于秋水仙素的有效渗入
侧芽所有细胞产生诱变效应， 因而可能是获得较高
比例多倍体植株的原因之一， 也是嵌合体较少的重
图 2 二倍体细胞及染色体（A）（5×40X）和
四倍体细胞及染色体（B）（5×40X）
A B
图 3 多倍体植株叶片下表皮气孔形态（A）(5×10X)与
二倍体植株叶片下表皮气孔形态（B）(5×10X)
A B
王 波等： 甜叶菊多倍体离体诱导技术体系的建立 1713- -
第 32 卷热 带 作 物 学 报
要因素。 由于秋水仙素对植株存在较大的毒害作
用， 所以在离体诱导植物多倍体试验研究中探索适
合该植物的处理剂量往往也是试验成功与否的关
键， 不同植物、 不同的外植体所用秋水仙素处理剂
量上都存在一定的差异 [17-20]， 高浓度诱变剂长时间
处理获得多倍体比例有所提高， 但获得再生植株的
数量却相对较少， 低浓度诱变剂短时间处理获得再
生植株数量较多， 但多倍体比例较低， 也容易获得
一些嵌合体 [16-18]， 给后续多倍体鉴定带来不便， 本
试验研究结果也证明了这点。 因此， 在进行植物离
体化学诱变研究中， 采用不同的外植体及不同的诱
变处理方式， 必须对诱变剂量进行探索 [16]， 以提高
试验研究工作效率。 秋水仙素处理对获取的多倍体
植株在后期生根试验中依然存在一定的影响， 是毒
害作用的延续还是多倍体植株与二倍体植株自身间
生根特性的差异？ 其原因尚待进一步研究。 本研究
只是多倍体诱导的前期基础工作， 获得的多倍体植
株表现与崔广荣等报道的有关文心兰、 蝴蝶兰离体
诱导多倍体的研究结果 [17-18]非常相似， 说明利用秋
水仙素进行植物多倍体离体诱导存在一定的内在规
律， 用最简便的方法获得大量的在生产上有价值的
多倍体植株是相关研究工作者共同努力的方向。 秋
水仙素对甜叶菊离体再生苗的后期生长具有较大的
伤害作用， 解除这些伤害作用， 最终获得在生产上
具有应用价值的高产甜叶菊植株尚需较多的工作要
做， 尤其是田间苗的驯化和筛选工作。
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责任编辑： 沈德发
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