全 文 ：思茅松等位酶实验方法及改进
陈少瑜 , 赵文书
(云南省林业科学院 , 云南　昆明 650204)
摘要:以思茅松种子的胚乳为实验材料 , 探索了思茅松等位酶的实验方法。采用聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳与水
平切片淀粉凝胶电泳相结合的方法 , 获得所试验的 13 种等位酶中 AAT , ADH , EST , GDH , G6PD , MDH , PGD-
6 , PGM和 SKD等 9种电泳效果良好的等位酶酶谱。通过两种电泳方法的有机结合 , 以及对制样及上样方法的改
进 , 大大地提高了实验效率。本研究得到的等位酶酶谱式样 , 为下一步思茅松种群遗传分析提供了资料。
关键词:思茅松;等位酶;实验方法;凝胶电泳
中图分类号:S 791.259　　文献标识码:A　　文章编号:1007-3353 (2001)03-0041-04
　　本实验以思茅松(Pinus kesiya var.langbianensis)
种子的胚乳为材料 , 将聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳
与水平切片淀粉凝胶电泳相结合 , 并对这两种方法
加以改进 , 获得了谱带清晰的 9种等位酶的酶谱 ,
为下一步的种群遗传分析提供了资料。
1　实验材料
材料取自普文试验林场思茅松无性系种子园及
江城 、 大渡岗 、澜沧糯福乡 3个天然种群。各种群
取10～ 20株 , 以单株种子的胚乳为材料进行等位酶
实验。11 ～ 1月思茅松种子成熟期 , 分单株采集球
果。采回后风干 , 脱出种粒 , 置低温冰箱中备用 。
2　实验方法
实验时 , 从各单株的种子中 , 随机取 6 ～ 8 粒
种子 , 取其胚乳 , 两粒胚乳为一个样 , 以确定母株
的基因型 。由于胚乳(雌配子体)为单倍体 , 可以直
接用以分析是否符合 Mendel分离规律 , 进而确定
谱带所代表的等位基因位点及每个位点的等位基因
数。等位酶实验采用了两种凝胶电泳方法 , 即聚丙
烯酰胺垂直板凝胶电泳和水平切片淀粉凝胶电泳 。
2.1　聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳
(1)样品制备　试验了 3种提取缓冲液 ,以每
2粒胚乳为 1个样 ,置于预冷的比色皿中 ,每样加入
0.2 mL 的提取缓冲液 ,在冰浴中研磨提取酶蛋白。
之后用整齐截取的 3 mm×6 mm大小的滤纸条作沁
子吸取研磨液上样 。
Ⅰ号提取缓冲液:电极缓冲液+(0.1%巯基乙
醇+4%PVP)
Ⅱ号提取缓冲液:简单磷酸提取液0.1M ,pH 7.5
X:NaH2PO4·H2O(0.1 M , 50 mL):0.69 g →50
mL;Y:Na2HPO4·12H2O(0.1 M , 50 mL):1.79 g →50
mL;4 mL X+21 mL Y+2.5 g 蔗糖+0.05 mL巯基乙
醇+少许PVP→50 mL。
Ⅲ号提取缓冲液:复杂磷酸提取缓冲液(使用前
配制)
0.28 g 四硼酸钠;0.08 g 偏亚硫酸钠;1.00 g 聚
乙烯基吡咯烷酮(PVP);1.00 g 抗坏血酸钠(存冰
箱);0.07 g 二乙基二硫代氨基甲酸钠(存冷冻室)。
加入25 mL磷酸缓冲液 (0.1 M , pH 7.5), 溶解至
透明 , 加入 0.25 mL巯基乙醇。
(2)凝胶及电泳　聚丙烯胺酰凝胶不连续垂直
板式电泳 ,分离胶浓度为 7.5%,浓缩胶浓度为 3%。
电极缓冲液为 Tris-甘氨酸(pH 8.3),电泳在 4℃冰
箱中进行 。电泳时 ,浓缩胶部分电流为 l mA/样 ,进
入分离胶后增至 2 mA/样 ,电泳时间 3.5 ～ 4 h。
(3)染色　试验的13种酶的染色液配方如下[7] :
AAT :天冬氨酸转氨酶 Asparate aminotransferase
　50 mL 天冬氨酸转氨酶底物溶液(pH 7.4);0.05 g
固蓝 BB盐(fast blue BB salt ,冷冻箱);放在磁力搅拌
　第 3 期　总第 96 期
　2001 年 9月 　　　　　　　　　 云　南　林　业　科　技Yunnan Forestry Science and Technology　　　　　　　　　　　　 No.3Sept.2001
收稿日期:2001-01-09
　　　基金项目:云南省自然科学基金资助项目 , 项目编号:98C017Q
　　　第一作者简介:陈少瑜 (1968-), 广东人 , 女 , 副研究员 , 主要从事林木遗传育种研究。
器上搅拌溶解后 ,迅速倒在胶上 ,于暗处温室下温育。
ACP:酸性磷酸酶 Acid phosphatase 　0.5 mL 醋
酸钠缓冲液(l M sodium acetate buffer ,pH 5.0);47.5 mL
H2O;10滴氯化镁(10%MgCl2);0.05 g α-磷酸萘酯 ,钠
盐(α-naphthyl acid phosphate , sodium salt ,冷冻箱);
0.05 g 固酱紫GBC盐(fast garnet GBC salt ,冷冻箱)。
ADH:(乙)醇脱氢酶 Alcohol dehydrogenase 　50
mL Tris-HCl 缓冲液(0.05 M , pH 8.0), 4滴酒精
(95%), 16 滴辅酶 I (1%NAD), 16 滴氮蓝四唑
(1%NBT 或 1%MTT), 4滴吩嗪甲硫酸 (1%PMS)。
EST:酯酶 Esterase 　5 mL Tris-HCl 缓冲液
(1.0 M , pH 6.0);45 mL H2O;染色前加入:2 mL
β-奈乙酸 (1 g/100mL丙酮 , β-naphthyl acetate),
2 mL α-奈乙酸(1 g/100 mL 丙酮 , α-naphthyl ac-
etate),摇匀倒胶上 ,暗处室温 15 min ,称 0.1 g 固蓝
RR盐溶于 10 mL H2O ,倒胶上 。
FDH:甲酸脱氢酶 Formate dehydrogenase　50 mL
Tris-HCl 缓冲液(0.05 M , pH 8.0), 1 mL 甲酸钠
(10%formic acid , sodium salt), 16 滴辅酶 I(1%
NAD),16 滴氮蓝四唑(1%NBT , 1%MTT), 4 滴吩嗪
甲硫酸(1%PMS)。
GDH:谷氨酸脱氢酶 Glutamate dehydrogenase 　
50 mL Tris-HCl缓冲液(0.05 M ,pH 8.0), 32滴 L-
谷氨酸钠(10%L -glutamate , sodium salt)+0.05g 氯
化钙 , 16 滴辅酶 I (1%NAD), 16 滴氮蓝四唑
(1%NBT or 1%MTT),4滴吩嗪甲硫酸(1%PMS)。
G 6PD:6葡萄糖磷酸脱氢酶 Glucose-6-phos-
phate dehydrogenase 　50 mL Tris-HCl 缓冲液(0.05
M , pH 8.0),8滴氯化镁(10%MgCl2),32滴 6-磷酸
葡萄糖钠盐(2.5%glucose -6-phosphate , disodium
salt),16滴辅酶 II(0.5%NADP), 16滴氮蓝四唑(1%
NBT or 1%MTT),4滴吩嗪甲硫酸(1%PMS)。
LDH:乳酸脱氢酶Lactate dehydrogenase　50mL Tris
-HCl缓冲液(0.05 M , pH 8.0), 100 mg 乳酸锂(lactic
acid , lithium salt),16滴辅酶 I(1%NAD),16滴氮蓝四唑
(1%NBT or MTT),4滴吩嗪甲硫酸(1%PMS)。
MDH:苹果酸脱氢酶 Malate dehydrogenase 　50
mL Tris-HCl缓冲液(0.01M ,pH 8.5),5 mL DL-苹
果酸(2M DL-malic acid , pH 8.0),16 滴辅酶 I(1%
NAD),16滴氮蓝四唑(1%NBT or 0.1%MTT),4滴吩
嗪甲硫酸(1%PMS)。
ME:苹果酸酶Malic enzyme　50mL Tris-HCl缓
冲液(0.05M ,pH 8.0), 5 mL DL-苹果酸 (2 M DL
-malic acid , pH 8.0), 10滴氯化镁 (10%MgCl2),
16滴辅酶 II (0.5%NADP), 16 滴氮蓝四唑(1%
NBT or 1%MTT),4滴吩嗪甲硫酸(1%PMS)。
PGD:6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶 6-phosphoglu-
conate dehydrogenase　50 mL Tris-HCl缓冲液(0.05
M ,pH 8.0),10滴氯化镁(10%MgCl2),0.02 g 6-磷
酸葡萄糖钡(6-phosphogluconic acid , barium salt ,冷
冻箱), 16 滴辅酶 II(0.5%NADP), 16 滴氮蓝四唑
(1%NBT or 1%MTT),4滴吩嗪甲硫酸(1%PMS)。
PGM:磷酸葡萄糖变位酶 Phoshoglucomutase 50
mL Tris-HCl缓冲液(0.01 M ,pH 8.5)浸 15 min;加
入:10滴氯化镁(10%MgCl2), 16 滴 6-磷酸葡萄糖
脱氢酶(20 unit/mL , Glucose -phosphate dehydroge-
nase),48滴 1-葡萄糖磷酸二钠盐(5% glucose-l-
phosphate ,disodium salt),16滴辅酶 I(1%NAD),16滴
噻唑蓝(1%MTT),4滴吩嗪甲硫酸(1%PMS)。
SKD:莽草酸脱氢酶 Shikmate dehydrogenase 　50
mL Tris-HCl缓冲液(0.01 M , pH 8.5), 0.05 g 莽草
酸(shikimic acid , 冷冻箱), 16 滴辅酶 II(0.5%
NADP),16滴氮蓝四唑(1%NBT or 1%MTT),4滴吩
嗪甲硫酸(1%PMS)。
染色后记录结果 ,用凝胶图像分析系统扫描胶
片 ,然后用干胶仪将之制成永久性干胶片 。
2.2　水平切片淀粉凝胶电泳
(1)样品制备　同前。
(2)凝胶及电泳 　采用 Sigma 淀粉 , 胶浓度
12%。实验试用了两种凝胶和电极缓冲液组合(见
表 1)。使用王仲仁设计的由北京六一厂生产的水
平切片淀粉凝胶电泳槽 。同样用滤纸条上样。电泳
在 4℃冰箱中进行 , 50 mA 稳流电泳 5小时左右 ,
待溴酚蓝移至电泳槽顶端 , 停止电泳 , 切胶染色。
染色及以后步骤同前。
表 1　水平切片淀粉凝胶电泳的电泳缓冲液系统配方
Tab.1　The electrode buffer and gel buffer in horizontal starch electrophoresis
编　号 电泳缓冲液 凝胶缓冲液
A 　0.4 mol/ L柠檬酸三钠 (pH 7.0) 　　　　0.02 mol/L盐酸组氨酸 (pH 7.0)
B 　0.1 mol/ L NaOH , 0.3mol/L硼酸 (pH 8.6) 　　　　0.015 mol/L Tris , 0.004 mol/ L柠檬酸
42 云　南　林　业　科　技 　　　　　　　　　　　　　2001年
3　结果与讨论
3.1　实验结果
聚丙烯酰胺凝胶电泳不同提取缓冲液的实验结
果如表 2。由表 2可见采用此电泳方法 , III号提取
缓冲液可以获得有酶带显示的酶系统数最多(7
种), 其中AAT , EST 和 GDH 3种酶系统表现出最
好的电泳效果。
表 2　思茅松胚乳不同提取缓冲液聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验结果
Tab.2　The result with different extract buffers in vertical slab polyacry lamide gel electrophoresis
酶系统 AAT ACP ADH EST FDH GDH G6PD LDH MDH ME PGD-6 PGM SKD
Ⅰ号 - / / + / - / / / / / / -
Ⅱ号 + / - + / - / / / / / / -
Ⅲ号 + / - + / + / / - - / / -
注:“ +” 表示显带良好;“ -” 表示显带不好;“/” 表示无带。表 3亦同。
　　水平切片淀粉凝胶电泳的实验结果如表 3。由
表3可见 , 简单磷酸提取缓冲液(Ⅱ号提取缓冲液)
与A电泳缓冲系统 , 复杂磷酸提取缓冲液(Ⅲ号提
取缓冲液)与A电泳缓冲系统的组合皆具有数目较
多 、 显带较好的电泳效果 。其中 , 在Ⅱ+A的组合
中 , ACP , ADH , GDH , G6PD和SKD 5种酶具有最
好的电泳效果;在 Ⅲ+A 的组合中 , ADH , G6PD ,
MDH , PGD-6和 PGM 5种酶表现出最好的电泳效
果 。其它两种组合仅有 2种酶有较好的电泳效果 。
表 3　思茅松胚乳不同提取缓冲液和电泳缓冲系统组合的水平切片淀粉凝胶电泳实验结果
Tab.3　The experiment result for the combination of extract buffers with electrophoresis systems in horizontal starch electrophoresis
酶系统 AAT ACP ADH EST FDH GDH G6PD LDH MDH ME PGD-6 PGM SKD
Ⅱ号提取液
A 号电泳缓冲系统 - + + / / + + / - / / - +
Ⅱ号提取液
B号电泳缓冲系统 / - + / / - + / - / / - /
Ⅲ号提取液
A 号电泳缓冲系统 - - + - / - + / + - + + -
Ⅲ号提取缓冲液
B号电泳缓冲系统 - / - - / / + / - / + - -
表 4　思茅松等位酶电泳实验方案
Tab.4　The scheme for electrophoresis experiment of isozymes of Pinus kesiya var.langbianensis
　　　酶系统名称 缩写 酶代码 电泳方法 提取缓冲液 电泳缓冲系统
天冬氨酸转氨酶
Aspartate aminotransferase
AAT E.C.2.6.1.1 聚丙烯酰胺垂直板电泳 Ⅱ号提取液
乙醇脱氢酶
Alcohl dehydrogenase
ADH E.C.1.1.1.1 水平切片淀粉凝胶电泳
Ⅱ号或Ⅲ号
提取液 A或 B
酯酶
Esterase
EST E.C.3.1.1.- 聚丙烯酰胺垂直板电泳
Ⅰ 、 Ⅱ或Ⅲ号
提取缓冲液
谷氨酸脱氢酶
Glutamate-ammonia ligase GDH E.C.1.4.1.2
聚丙烯酰胺
垂直板电泳 Ⅲ号提取液
葡萄糖 6-磷酸脱氢酶
Glucose-6-phosphate dehydrogenase G6PD E.C.1.1.1.49
水平切片淀粉
凝胶电泳
Ⅱ号或Ⅲ号
提取液 A或 B
苹果酸脱氢酶
Malate dehydrogenase
MDH E.C.1.1.1.37 水平切片淀粉凝胶电泳 Ⅲ号提取液 A
磷酸葡萄糖酸脱氢酶
Phosphogluconate dehydrogenase
PGD E.C.1.1.1.44 水平切片淀粉凝胶电泳 Ⅲ号提取液 A
磷酸葡萄糖变位酶
Phosphoglucomuase
PGM E.C.5.4.2.2 水平切片淀粉凝胶电泳 Ⅲ号提取液 A
莽草酸脱氢酶
Shikimate dehydrogenase
SKD E.C.1.1.1.25 水平切片淀粉凝胶电泳 Ⅱ号提取液 A
43第 3期　　　　　　　　　　　陈少瑜等:思茅松等位酶实验方法及改进
　　两种电泳方法共试验了 13 种酶系统 , 其中 9
种酶系统表现了稳定而清晰的酶谱 。可用于下一步
的遗传分析 。9种等位酶的酶谱式样见图版 Ⅰ (图
版Ⅰ由凝胶图象分析系统扫描获得)。
综合分析以上实验结果 , 得到这 9种酶系统的
最佳实验方案 , 总结于表 4。
3.2　讨论
(1)聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳具有成本低 、
分辨率高的特点 , 但每次电泳的样品数及酶系统的
种类相对较少(20个左右的样品 ,仅两种酶), 效率
低。另外 , 此法可以做出的酶种类也较少。水平切
片淀粉凝胶电泳每次电泳的样品数多 , 酶种类也较
多(每次电泳可上 40 个样品 , 4 ～ 5 种酶), 效率较
高。另外 , 这种方法可能做出结果的酶种类要比用
聚丙烯酰胺凝胶电泳的多 , 但此法分辨率低 , 成本
高。因此两种方法各有其特点 , 本研究采用了两种
电泳相结合的实验方法 , 以用最低的成本 、 最高的
效率 , 获得最好的实验结果。
(2)在本实验中 , 将各单株的每 2粒胚乳混合
研磨制为 1个样以提高工作效率 。若 2粒胚乳某一
位点的等位基因相同则出现 1条酶带 , 若不相同则
出现 2条酶带 , 这样很容易判断等位基因的种类和
数目 。因为每 2粒胚乳为 1个样与 1粒胚乳为 1个
样相同 , 都可以获得容易判读的酶谱型 , 而 2粒胚
乳仅占据了1个泳道 , 这样效率就比 1粒胚乳占 1
个泳道提高了 1倍。
(3)制样及上样方法大大简化。过去制样通常
用研钵在冰浴中研磨样品 , 然后将研磨液倒于离心
管中 , 低温离心 , 取上清液上样。这种制样方法在
制样过程中样品浪费较大 , 往往要样品的量较大时
方可操作 , 比如叶 、芽 、枝皮等器官或组织 , 像胚
乳 、胚 、花药等来源量少的样品便不适用此法 。本
实验直接用比色皿在冰浴中研磨样品 , 省去了离心
一步 , 然后用滤纸条上样 , 同样可以得到理想的电
泳效果 。
参考文献:
[ 1] 赵文书 , 郭宇渭 , 汪福斌 , 等.思茅松天然优良
林分选择的研究 [ J] .云南林业科技 , 1993 (4):2 ～ 10
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[ J] .云南林业科技 , 1995 (1):1～ 5
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[ 4] 赵文书 , 唐社云 , 李莲芳 , 等.普文试验林场思
茅松无性系种子园营建技术 [ J] .云南林业科技 , 1998
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[ 6] 吴丽圆, 赵文书 , 顾志建 , 等.思茅松景洪大渡岗居
群的核型变异研究 [ J] .云南林业科技 , 2000 (1):23～ 26
[ 7] 王仲仁.植物等位酶分析 [ M] .北京:科学出版
社 , 1996
图版说明:Explanation of plate
图版Ⅰ 　思茅松 9种等位酶的电泳酶谱式样
Plate Ⅰ 　The patterns for isozyme electrophotrsis of
Pinuskesiya var.langbianensis
1.AAT;2.ADH;3.GDH;4.G6PD;5.EST;
6.MDH;7.PGD;8.PGM;9.SKD
Methods and Improvement for Isozyme Experiment of Pinus kesiya var.langbianensis
CHEN Shao-yu , ZHAO Wen-shu
Yunnan Academy of Forestry , Kunming Yunnan 650204 , China)
Abstract:Endosperm of Pinus kesiya var.langbianensis as material , the experiment has probed into high effective
method of isozyme electrophoresis.Nine out of 13 clear isozyme band patterns were obtained through the combination of
two electrophoresis methods , namely vertical slab polyacrylamide del electrophoresis and horizontal starch electrophore-
sis.The 9 isozyme systems are AAT , ADH , EST , GDH , G6PD , MDH , PGD-6 , PGM and SKD.The organic
combination of the two electrophoresis methods , the improvement on the ways of sample preparing and delivering made
the experiment more effectively .The isozyme band patterens from the experiment will provide information for further
study on the genetic structure of Pinus kesiya var.langbianensis.
Key words:Pinus kesiya var.langbianensis , isozyme , vertical slab polyacrylamide gel electrophoresis , horizontal
starch electrophoresis
44 云　南　林　业　科　技 　　　　　　　　　　　　　2001年