全 文 ：收稿日期：2007-05-07
基金项目：沈阳农业大学中青年硕士导师基金项目（2006）
作者简介：石生林(1972－)，男，沈阳农业大学副教授，博士，从事昆虫杆状病毒研究。 * 通讯作者 Corresponding author：王学英(1951－)，男，沈阳农业
大学教授，博士，从事昆虫生物技术研究。
ApNPV侵染对柞蚕蛹体内保护酶活性的影响
石生林，张 涛，李 群，王学英 *
（沈阳农业大学 生物科学技术学院，沈阳 110161）
摘要：为研究柞蚕核型多角体病毒（Antheraea pernyi nucleopolyhedrovirus，ApNPV）侵染后病毒与宿主间的拮抗关系，测定 ApNPV
侵染后柞蚕蛹体内 SOD、CAT 和 PO 活性变化。结果表明：ApNPV 侵染使柞蚕蛹体内 SOD 活性呈先下降再上升后又下降的变化趋
势，接种后 48h 和 96h 是酶活性变化的两个转折点，48h 是酶活性差值低谷，雌、雄平均较对照低 622U·mL-1；96h 是酶活性差值高
峰，雌、雄平均较对照高 850.5U·mL-1。 CAT 活性变化呈先上升后下降的趋势，接种后 48h 是酶活性变化的转折点，雌、雄平均较对
照高 309.5U·mL-1；72h 后酶活性变化趋于平稳。PO 活性亦呈先上升后下降的变化趋势，接种后 48h 是酶活性变化转折点，雌、雄平
均较对照高 2173.5U·mL-1。 雌、雄蛹间酶系活性变化趋势相似但程度不同，雌蛹酶活性变化幅度大于雄蛹。
关键词：柞蚕；核型多角体病毒；侵染；酶活性
中图分类号：S885.1 文献标识码： A 文章编号： 1000-1700（2008）05-0625-03
Effects of ApNPV Infection on Superoxide Dismutase, Catalase and
Phenoloxidase of Antheraea pernyi Pupa
SHI Sheng-lin, ZHANG Tao, LI Qun, WANG Xue-ying*
(College of Bioscience and Technology, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China)
Abstract：To study the antagonistic relationship between Antheraea pernyi nucleopolyhedrovirus （ApNPV）and its host under the
condition of ApNPV infection, the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and phenoloxidase (PO) of ApNPV in-
fected Antheraea pernyi pupa were determined. The results showed that due to ApNPV infection, the SOD activities in pupa de-
creased at first and then increased and finally decreased again. The two turning points of SOD activity lay at hours 48 and 96
after injection. At 48 h, the mean activity of male and female pupae was lower than the control by 622 U·mL-1 and formed a
activity valley. At 96 h, the mean activity of male and female pupae was higher than the control by 850.5 U·mL-1 and formed a
activity peak. CAT activities increased first and then decreased, with the turning point at 48 h (the mean activity of male and
female pupae was higher than the control by 309.5 U·mL-1), after 72 hours the activity tended to be stable. The turning point of
PO activity which also increased first and then declined was at 48 h post injection at which time the mean activity of male and
female pupae was higher than the control by 2173.5 U·mL-1. Male and female pupae showed similar tendency of change in en-
zyme activity but the female experienced greater range.
Key words：Antheraea pernyi; nucleopolyhedrovirus; infection; enzymic activity
杆状病毒是有囊膜的双链 DNA 病毒，宿主域仅限于无脊椎动物，已经报道有 600 种以上昆虫能被杆状病
毒感染[1]。 分类上，杆状病毒科（Baculoviridae）分核型多角体病毒（NPV）与颗粒体病毒（GV）两个属[2]。 柞蚕核型
多角体病毒（Antheraea pernyi nucleopolyhedrovirus，ApNPV）是柞蚕(Lepidoptera:Saturniidae)脓病的病原，已建立
的 ApNPV—柞蚕蛹宿主载体表达系统具有独特的宿主优势 [3,4]。 昆虫不像脊椎动物那样具有完整的免疫系统，
但为了适应环境，在不良条件下体内酶系会发生一系列应激反应；另一方面，杆状病毒侵入虫体后，在病毒增殖
过程中能破坏靶标昆虫体内的酶系统，使昆虫体内酶系发生变化[5,6]。 利用 ApNPV宿主载体表达系统进行外源
蛋白生产时，注射接种 ApNPV 也会引起蛹体酶系发生变化，涉及病毒与宿主之间的相互拮抗关系。 超氧化物
歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、过氧化物酶(peroxidase，POD)和酚氧化酶(phe-
noloxidase,PO)均在昆虫体内应激反应中起主要作用 [7,8]，常被用来作为生物体生理状态改变的度量指标。本研究
通过测定 ApNPV 侵染后柞蚕蛹体内 SOD、CAT、PO 酶活性变化， 研究 ApNPV 侵染后病毒与宿主间的拮抗关
系，为利用柞蚕蛹作为 ApNPV表达载体宿主，提高外源蛋白表达效率提供理论依据。
沈阳农业大学学报，２００8－10，39(5)：625-627
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００8－10，39(5)：625-627
第 39卷沈 阳 农 业 大 学 学 报
1 材料与方法
1.1 材料
供试柞蚕核型多角体病毒（Antheraea pernyi nucleopolyhedrovirus，ApNPV）为沈阳农业大学柞蚕教研室收
集保存的沈阳株，供试柞蚕蛹为二化性品种青 6号滞育蛹，由沈阳农业大学柞蚕教研室提供。 研究中所用试剂
均为市售国产分析纯试剂。
1.2 方法
柞蚕蛹感染采用体壁穿刺法，取滞育柞蚕蛹 60 个（雌、雄各 30），以 75％酒精体表擦拭消毒；纯化的 ApN-
PV（浓度为 9.2×108PIB·mL-1）加等体积的 2 倍浓度多角体裂解液（0.2mol·L-1 Na2CO3；0.34mol·L-1 NaCl），室温
裂解 30min 后加 10％醋酸调 pH 值至 7.0 终止碱液作用；12000g 4℃离心 10min，上清液为病毒粒子液，加入医
用青霉素至终浓度为 200U·mL-1；每个柞蚕蛹体壁注射接种 50μL病毒粒子液（相当于 2.3×107个多角体），以接
种不含病毒粒子的 1 倍多角体裂解液作为对照处理（Mock infection）；接种后的柞蚕蛹置 25℃，70％相对湿度
保护。 接种后分别在 24，48，72，96，120h 取样， 取样时分别取病毒接种及对照接种柞蚕蛹 4 个，4℃预冷 10
min，加 4mL预冷的 0.1mol·L-1磷酸盐缓冲液（PBS，pH 值 7.0，含 1%的 Triton）冰浴充分研磨。 研磨液转移至预
冷的 40mL离心管，6000g 4℃离心 10min，上清液分装于 1.5mL eppendorf管冷冻保存待测。
1.3 测定项目
SOD活性测定采用微量连苯三酚自氧化法[9]，测定波长为 325nm，以 1mL 反应液中每分钟抑制邻苯三酚自
氧化率达 50％时的酶量为 1 个活性单位（U）；CAT 活性测定采用贝尔斯－西策尔斯（Beers & Sizers）法（改进
型）[10]，测定波长为 240nm，在 25℃、pH 值 7.0 条件下，每分钟分解 1μmol 过氧化氢所需的酶量为 1 个活性单位
（U）；PO 活性测定采用邻苯二酚法[11]，测定波长为 420nm，在室温、比色杯光径为 1cm 条件下，每毫升样品每分
钟引起 0.01 个 OD 值变化即为一个酚氧化酶活性单位（U）。 试验所得数据为 3 次重复的平均值，用 Microsoft
Office Excel 软件绘图，为便于比较，同时绘制酶活性差值（感染处理酶活性-对照处理酶活性）曲线。
2 结果与分析
2.1 ApNPV侵染对柞蚕蛹体内 SOD活性的影响
ApNPV接种感染对雌、雄蛹 SOD活性均有较大影响，其活性变化趋势相似，但程度不同（图 1）。感染后雌、
雄蛹 SOD活性均呈先下降后上升再下降的变化趋势，对照处理中雌、雄蛹 SOD 活性均呈反“S”形上升趋势，变
化趋势与病毒接种处理相比呈镜像对应关系。 ApNPV 接种感染与对照处理 SOD 活性差值揭示病毒侵染后因
病毒粒子增殖而导致的蛹体内酶系活性变化，其曲线亦呈先下降后上升又下降的变化趋势，接种后 48h 和 96h
是酶活性变化的两个转折点。接种后 48h雌蛹酶活性较对照低 986U·mL-1，雄蛹酶活性较对照低 258U·mL-1；接
种后 96h雌蛹酶活性较对照高 752U·mL-1，雄蛹酶活性较对照高 949U·mL-1。雌蛹酶活性变化幅度较大，雄蛹酶
活性变化幅度较小,表明雌、雄蛹对 ApNPV侵染的应激程度存在差异。
2.2 ApNPV侵染对柞蚕蛹体内 CAT活性的影响
雌、雄蛹 CAT 酶活性变化趋势相似但程度不同（图 2）。 ApNPV 接种感染及对照处理均使雌、雄个体 CAT
图 1 ApNPV接种后柞蚕蛹体内 SOD活性变化
Figure 1 Dynamic change of SOD of ApNPV injected
Antheraea pernyi pupa
图 2 ApNPV接种后下柞蚕蛹体内 CAT活性变化
Figure 2 Dynamic change of CAT of ApNPV injected
Antheraea pernyi pupa
626· ·
第 5期
活性呈先上升后下降再上升趋势，但对照处理 CAT活性影响的程度较小。ApNPV接种感染与对照处理 CAT活
性差值曲线只在接种后 48h 有小幅上升，雌、雄蛹 CAT 活性分别较对照高 301U·mL-1和 308U·mL-1，随后即下
降；接种 72h后呈平稳趋势，至接种后 96h雌蛹酶活性较对照低 198U·mL-1，雄蛹酶活性较对照仅高 41U·mL-1。
雌蛹 CAT 酶活性变化幅度大于雄蛹，亦提示雌、雄蛹对
ApNPV侵染的应激程度存在差异。
2.3 ApNPV侵染对柞蚕蛹体内 PO活性的影响
ApNPV 接种感染使雌、 雄蛹 PO 活性呈先上升后下
降趋势，对照处理中雌、雄蛹 PO 活性呈反“S”形上升趋
势（图 3）。 ApNPV 接种感染与对照处理 PO 活性差值曲
线亦呈先上升后下降变化趋势，接种后 48h 雌、雄蛹酶活
性分别较对照高 2372U·mL-1 和 1975U·mL-1； 接种后
120h雌、雄蛹酶活性则分别较对照低 924U·mL-1和 33U·
mL-1。 雌蛹酶活性变化幅度较大，雄蛹酶活性变化幅度较
小，表明雌、雄蛹对 ApNPV侵染的应激程度存在差异。
3 讨论
生物在逆境条件下，能产生具有很强氧化能力的生物自由基，对许多生物功能分子有破坏作用；正常情况
下生物体可通过保护酶（SOD、CAT、POD）使自由基维持在一个较低水平，防止自由基毒害 [8]，但 POD 活性在昆
虫体内常不易测得[6]。 在病原及化学物质等不利因素胁迫下，昆虫体内的保护酶活性将发生变化[12,6]，这与本研
究结果相同。 PO广泛存在于昆虫体内，是昆虫获得性防御的一个重要方面，常以酚氧化酶原形式存在，级联反
应后产生黑色素及粘附蛋白，可以覆盖在外源物表面，有助于血细胞对细菌等外源物的吞噬作用[13]，PO 与保护
酶一样亦受病毒增殖影响呈规律性变化，因此本研究也将 PO作为病毒与宿主间拮抗作用的指标之一。 在取样
时间上，本研究选择病毒接种后 24,48,72,96,120h 进行酶活性测定，这种选择符合杆状病毒在宿主体内侵染的
时间历程[14]，研究结果能够真实地反应病毒增殖与宿主防御之间的拮抗关系。 在病毒与宿主拮抗作用中，雌蛹
酶系活性变化幅度大于雄蛹，可能是由于雌、雄个体对病毒侵染存在抗性差异所致，但尚需进一步研究确定。
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[责任编辑 马迎杰]
图 3 ApNPV接种后柞蚕蛹体内 PO活性变化
Figure 3 Dynamic change of PO of ApNPV injected
Antheraea pernyi pupa
石生林等:ApNPV侵染对柞蚕蛹体内保护酶活性的影响 627· ·