全 文 ：甜叶菊是异花授粉植物， 植株多为杂合基因
型， 性状遗传较不稳定， 其有性后代很难保有原优
良性状， 另种子小， 生活力弱， 种子带菌还会导致
病害的发生 [1-2]。 现有有性品种性状严重退化， A3
甙、 总糖甙含量较低， 现有无性品种的叶产量较
低， 改善这一现状急需对甜叶菊品种进行遗传改
良 [3-4]。 现阶段， 结合化学诱变技术和植物组织培
养技术开展品种的改良工作， 具有一定的优势和发
展潜力。 NaN3 是化学诱变育种中常用的诱变剂之
一， 以碱基替换的形式导致 DNA 不能正常合成，
从而产生点突变， 在植物上已有广泛的应用[5-9]。
目前， 国内外对甜叶菊的研究主要集中在栽
培、 组培快繁、 糖甙鉴定和品种选育等方面 [3, 10-15]，
而利用 NaN3进行甜叶菊诱变及分子技术在甜叶菊
上应用的研究鲜有报道 。 因此 ， 在建立甜叶菊
NaN3 离体诱变体系基础上， 用简易分子操作技术
对再生植株进行初期鉴定， 可有针对性地选择突变
单株， 避免后期田间种植的盲目性。 现有的诸多分
子技术中， RAPD 和 SRAP 是无须知晓试验植物的
基因组序列信息即可开展 PCR 扩增的标记技术，
RAPD 已广泛用于突变体的鉴定分析和遗传多样性
研究， SRAP 则具有共显性高、 多态性强、 DNA 需
要量少、 可靠性和重复性好、 操作简单且花费少等
优点[16-17]， 都符合本研究要求。 本试验拟用不同浓
度的 NaN3对甜叶菊茎段进行不同时间诱变， 筛选
出离体化学诱变体系， 进而对该诱变体系处理下的
再生植株进行 RAPD 和 SRAP 分子技术鉴定， 从分
子水平上初步鉴定出突变植株， 为后续进行大规模
诱变和获得期望的突变株奠定技术基础。
1 材料与方法
1.1 材料
甜叶菊试管苗为安徽科技学院植物科学学院组
织培养室提供的 “皖甜 1 号-18”。
1.2 方法
1.2.1 NaN3诱变体系的筛选 甜叶菊茎段腋芽诱
热带作物学报 2012， 33（5）： 866-870
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期： 2012-03-02 修回日期： 2012-04-23
基金项目： 安徽科技学院青年基金项目（No. ZRC2011281）； 安徽省教育厅省级重点自然科学基金项目(No. KJ2010A073)； 安徽省甜叶菊工程
技术研究中心建设项目。
作者简介： 何克勤（1979 年—）， 女， 实验师， 硕士研究生。 研究方向： 实验管理及植物组织培养育种。 *通讯作者： 崔广荣， E-mail：
cuigr64@sina.com
甜叶菊离体诱变与分子初检
何克勤， 胡能兵， 周玉丽， 崔广荣 *
安徽科技学院植物科学学院， 安徽凤阳 233100
摘 要 以甜叶菊茎段为外植体， 用不同浓度的 NaN3对其进行不同时间的处理， 筛选出合适的离体化学诱变体
系， 并对该体系下的部分再生苗进行 RAPD和 SRAP检测。 结果表明： NaN3处理的半致死剂量为 9 mmol/L浸泡 4 h，
该处理下植株矮化、 腋芽数减少； 用 2种分子技术对该处理下 14株再生苗的进行检测， 结果表明， 共 28.6％再生苗
的 DNA序列发生了一定程度的变异， 这为使用 NaN3对甜叶菊进行大规模的离体诱变奠定技术基础。
关键词 甜叶菊； 离体培养； NaN3； RAPD； SRAP
中图分类号 S682.31 文献标识码 A
Mutating of Stevia Rebaudiana Bertoni in vitro
and Molecular Detection
HE Keqin, HU Nengbing, ZHOU Yuli, CUI Guangrong
College of Plant Science, Anhui Science and Technology University, Fengyang， Anhui 233100， China
Abstract The stem of Stevia rebaudiana Bertoni in vitro as explants, different concentrations of NaN3 and treating
time were used to optimize the mutation system. The results showed that the death rate about 50% appeared in
stem sections treated with 9 mmol/L of NaN3 for 4 hours. The new plantlets became dwarf and less axillary buds
appeared. And 14 plants tested by RAPD and SRAP indicated that the mutation rate reached 28.6%, which laid
the foundation for mutation of Stevia rebaudiana Bertoni in vitro in large scale.
Key words Stevia rebaudiana Bertoni； Culture in vitro； NaN3； RAPD； SRAP
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2012.05.016
第 5 期
处理号 处理时间/h NaN3浓度/（mmol/L）
A 4 3
B 4 6
C 4 9
D 6 3
E 6 6
F 6 9
G 8 3
H 8 6
I 8 9
J 10 3
K 10 6
L 10 9
CK 0 0
表 1 甜叶菊离体化学诱变的不同处理
引物 碱基序列 引物 碱基序列
AG CCGTCCCGCA B CGGAAGAGCC
U GGCATCCAAT AY GCGCCACGTA
AW AGTTCGCCAC BA TTTTAACCAA
W TGAATGGATC AL GGAGGGTCAC
表 2 RAPD 引物序列
前引物 碱基序列 后引物 碱基序列
F3 TGAGTCCAAACCGGAAT R3 GACTGCGTACGAATTGAC
F4 TGAGTCCAAACCGGACC R3 GACTGCGTACGAATTGAC
F4 TGAGTCCAAACCGGACC R6 GACTGCGTACGAATTGCA
F4 TGAGTCCAAACCGGACC R8 GACTGCGTACGAATTAGC
F5 TGAGTCCAAACCGGAAG R4 GACTGCGTACGAATTTGA
F6 TGAGTCCAAACCGGTAG R2 GACTGCGTACGAATTTGC
F6 TGAGTCCAAACCGGTAG R7 GACTGCGTACGAATTATG
F10 TGAGTCCAAACCGGGAC R8 GACTGCGTACGAATTAGC
表 3 SRAP 引物序列
导培养基为 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+琼脂
粉 5.0 g/L+蔗糖 30 g/L， 灭菌前调节 pH 6.0。 在预
备试验基础上， 设计 3 种 NaN3 浓度、 4 个时间共
12个处理优化离体诱变体系， 具体配方见表 1。
在超净工作台中将试管生根苗剪成带两侧芽长
约 1.0 cm 的茎段， 用 NaN3浸泡处理， 处理后用无
菌水漂洗 2次， 接种于腋芽诱导培养基中， 每瓶接
茎段 5 个， 每处理接 4 瓶， 3 次重复， 未经 NaN3
浸泡茎段组合为对照。 培养 30 d 后统计茎段死亡
率、 诱导腋芽数， 并描述腋芽生长状况。 其中， 茎
段死亡率=死亡茎段数/接种茎段总数×100％； 腋芽
诱导数=诱导腋芽数/接种茎段总数。 培养室温度：
（25±2）℃， 光照强度 2 000 lx 的光照 12 h/d。
1.2.2 DNA 提取 采用 CTAB法提取样品 DNA[18]，
用 0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 质量。
1.2.3 再生植株的 RAPD 检测 从处理C（9 mmol/L
NaN3浸泡 4 h）中随机选取14个再生植株进行RAPD
分析， RAPD反应体系为： Taq DNA聚合酶（5 U/μL）
0.2 μL， 10×DNA buffer（含15 mmol/L MgCl2）3.0 μL，
2.5 mmol/L dNTPs 1.2 μL， DNA模板 （20 ng/μL）
1.0 μL，10 μmol/L引物 1.0 μL， ddH2O 13.6 μL。
PCR反应程序为： 94℃ 4 min； 94℃ 30 s，35 ℃ 30 s，
72 ℃ 1 min， 40个循环； 72 ℃ 7 min， 4 ℃保存[19]。
以 100 条引物对 CK 再生苗的 DNA 进行筛选，
选择扩增条带较清晰、 干扰带较少的 8条引物对处
理 C 中的 14 个再生植株进行 DNA 多态性检测 ，
引物序列见表 2。 琼脂糖凝胶浓度为 1.2％， 100 V
恒压电泳 1.5 h。 统计有多态性条带的单株数目，
进行植株变异性分析。
1.2.4 再生植株的 SRAP 检测 对上述 RAPD 分
析的 14 个植株进行 SRAP 分析 ， 反应体系为 ：
Taq DNA 聚合酶 （5 U/μL）1.0 μL， 10×DNA buffer
（含15 mmol/LMgCl2）3.0μL， 2.5 mmol/L dNTPs 1.2 μL，
DNA模板0.5 μL， 10 μmol/L前、 后引物各0.75 μL，
ddH2O 12.8 μL。 PCR反应程序为： 94℃ 1 min， 35℃
1 min， 72 ℃ 1 min， 5个循环； 94 ℃ 1 min， 50 ℃
1 min， 72 ℃ 1 min， 35个循环； 72 ℃延伸10 min，
4 ℃保存。
以 80 对 SRAP 引物对 CK 再生苗的 DNA 进
行筛选 ， 选取条带较清晰的 8 对引物组合对处
理 C 中的 14 个再生植株进行 DNA 多态性检
测 ， 引物序列见表 3。 扩增后用 6％非变性聚
丙烯酰胺凝胶 150 V 恒压电泳分离 4 h， 电泳
后银染 ， 银染参照 Sanguinetti 的方法进行 [ 20 ] 。
统计有多态性条带的单株数目 ， 进行植株变异
性分析 。
何克勤等： 甜叶菊离体诱变与分子初检 867- -
第 33 卷热 带 作 物 学 报
说明： 同列数据后不同小写字母表示差异显著。
处理号 死亡率/％ 腋芽诱导数/个 苗生长状况
A 29.8 g 4.6 b 苗部分矮化、 生长较好、 少部分死亡
B 30.0 g 5.2 ab 苗矮化、 少许发黄、 少部分死亡
C 49.0 f 4.7 b 苗部分矮化、 长势良好、 将近一半死亡
D 57.9e 5.5 ab 苗较高、 少许发黄、 一半以上死亡
E 52.0 f 4.1 b 苗矮化、 少许发黄、 一半以上死亡
F 63.4 d 3.7 b 苗矮化、 少许发黄、 大部分死亡
G 67.7 d 1.4 c 苗矮化、 长势良好、 大部分死亡
H 89.1 bc 1.5 c 苗矮化、 长势部分发黄、 绝大部分死亡
I 92.4 ab 0.6 c 苗矮化较重、 发黄、 绝大部分死亡
J 85.3 c 2.1 c 苗矮化较重、 发黄、 绝大部分死亡
K 90.3 ab 1.2 c 苗矮化、 发黄、 绝大部分死亡
L 93.9 a 1.6 c 苗矮化、 发黄、 绝大部分死亡
CK 0.0 h 6.5 a 苗较高、 长势良好、 无死亡
表 4 NaN3处理对甜叶菊茎段诱导腋芽的影响
2 结果与分析
2.1 NaN3处理对甜叶菊腋芽诱导的影响
NaN3处理对甜叶菊茎段诱导腋芽的影响见表
4、 图 1。 由表 4、 图 1 可知， NaN3 处理时间、 处
理浓度的不同， 导致离体培养的甜叶菊茎段在死亡
率、 腋芽诱导数及再生苗的生长情况等方面存在较
大差异。 就单个效应而言， 不同处理浓度下， 随着
处理时间的延长（4~10 h）， 茎段死亡率由 36.3％增
加到 89.8％， 腋芽诱导数则从 4.8 个降至 1.6 个；
不同处理时间下， 随着处理浓度加大（3~9 mmol/L），
茎段死亡率由 60.2％增至 74.7％， 腋芽诱导数则从
3.4 个降至 2.6 个， 表明诱变时间的处理效应要大
于诱变浓度的处理效应。 总体而言， 随着 NaN3 处
理时间的延长和处理浓度的增加， 茎段死亡率和
腋芽诱导数分别呈现增加和减少的趋势， 处理L
（9 mmol/L NaN3 浸泡 10 h）导致最大茎段死亡率
（93.9％）， 处理 I 导致 0.6 个最少腋芽诱导数。 从
育种角度考虑， 在保证再生苗生长状况和一定死亡
率基础上， 以处理C（9 mmol/L NaN3浸泡 4 h）为最
佳诱变体系， 该处理下茎段死亡率达到 49％， 接
近一半， 且腋芽诱导数较多， 苗矮化但长势较正
常， 可用该处理进行大规模诱变研究。
2.2 DNA 提取质量结果
处理 C 再生 14 个单株 DNA 提取结果见图 2。
DNA 带型较整齐， 无降解现象， 根据分光光度法
检测结果， 将 DNA 浓度调整至 20 ng/μL。
868- -
第 5 期
引物名称 变异植株数 变异比率/％
F3R3 0 0
F4R3 1 7.1
F4R6 1 7.1
F4R8 1 7.1
F5R4 1 7.1
F6R2 2 14.3
F6R7 0 0
F10R8 1 7.1
表 6 SRAP 检测结果
引物名称 变异植株数 变异比率/％
AG 2 14.3
AL 1 7.1
AW 1 7.1
AY 0 0
B 2 14.3
BA 1 7.1
U 2 14.3
W 1 7.1
表 5 RAPD 检测结果2.3 RAPD分析结果
8 条 RAPD 随机引物对处理 C 再生 14 个植株
的 RAPD 扩增结果见表 5。 AL、 AW、 BA、 W 引
物使植株 1产生多态性， AG、 U 引物使植株 1、 2
产生多态性（图 3）， B 引物使 1、 5产生多态性（图
4）， 随机 8条引物使再生植株 1、 2、 5产生多态性
变化， 总的多态性比率为 21.4％。 部分扩增带的
缺失是产生植株多态性变化的主要原因（图 4 箭
头处）。
2.4 SRAP分析结果
8 条 SRAP 引物对处理 C 再生 14 个植株的
SRAP 扩增结果见表 6。 基因组 DNA SRAP 多态性
比率也不高， 不同随机 SRAP 引物产生多态性植株
也是不完全相同。 F5R4 使植株 1 产生多态性（图
5）， F4R3、 F4R6、 F4R8、 F10R8 引物均使得植株
12 产生多态性， F6R2 使植株 1、 12 产生多态性
（图 6）， 多态性比例为 14.3％。 RAPD 和 SRAP 共
检测出 1、 2、 5、 12 这 4 个单株产生多态性变化，
即C处理下的 14个植株的多态性比例为 28.6％。
3 讨论与结论
利用 NaN3进行离体化学诱变是诱变育种中的
重要方法之一， 将组织培养与诱变技术结合进行育
种研究， 具有诱导频率相对较高， 筛选较方便等优
势 [21-22]。 此前， 利用 NaN3 进行诱变在许多植物上
均有报道 [5-9]， 而诱变剂处理时间长短和浓度大小
的确定因所选材料不同而异， 通常最适条件为达到
半致死计量， 既要提高诱变频率， 又要减少对外植
体的伤害 [8]。 安学丽等认为用浓度 0.4％EMS 处理
种子 12 h 是对玉米诱变的较适合的浓度和时间，
可达 “半致死量” [23]； 陈超等认为 0.4％的 EMS 处
理蝴蝶兰 6~8 h是诱变最适处理， 可达半致死量[24]。
何克勤等： 甜叶菊离体诱变与分子初检 869- -
第 33 卷热 带 作 物 学 报
责任编辑： 高 静
本研究结果表明， 利用 NaN3对甜叶菊茎段进行离
体诱变的方法是可行的， NaN3处理可使甜叶菊腋
芽诱导数减少、 成苗率降低， 再生苗矮化现象较普
遍， 部分芽在成苗过程中发黄枯萎死亡， 这些效应
随着 NaN3浓度的增加和处理时间的延长而加强。
当 NaN3处理的浓度为 9 mmol/L浸泡时间为 4 h时，
有近一半茎段死亡。
RAPD 和 SRAP 技术是 2 种不同的分子标记技
术， 在对诱变单株进行检测上各有优劣 [16-17]。 本试
验在筛选合适诱变体系的基础上 ， 从处理 C
（9 mmol/L NaN3浸泡 4 h）再生植株中随机选取 14
株再生苗进行 RAPD和 SRAP 分子检测， 共同检测
出 4 个单株 1、 2、 5、 12 的 DNA 序列发生一定程
度的变异， 即变异率为 28.6％， 这为大规模进行甜
叶菊叠氮化钠离体诱变奠定了基础。 但必须注意的
是， 2 种分子技术检测的多态性仅反映 DNA 变异，
变异苗的稳定性及是否具有期望的优良性状或品
质， 需要开展田间种植， 并观察多代苗的性状表现
及测定、 比较鉴定品质指标等后续工作。
参考文献
[1] 娄玉霞， 宋 磊， 李新国， 等. 甜叶菊叶片离体培养及试管无
性系的建立[J]. 上海师范大学学报， 2000， 29（4）： 74-77.
[2] 沈秀丽， 徐 仲 . 甜叶菊组培培养条件的研究[J]. 中国糖料，
1996（3）： 24-26.
[3] 杨文婷， 蔡乾蓉， 徐应文， 等. 四川引种甜叶菊的糖苷含量变
异及优良单株筛选[J]. 中国糖料， 2010（2）： 27-30， 34.
[4] 张 志， 滕祥金， 郝再彬. 薄板层析法分析甜叶菊糖苷[J]. 中
国调味品， 2009， 34（3）： 94-95， 98.
[5] 张超美 . 叠氮化钠对小麦的诱变效应 [J]. 湖北农学院学报 ，
1994， 14（3）： 96-60.
[6] 曹 欣， 杨煜峰， 钱强华. 叠氮化钠对不同大麦品种的诱变效
应[J]. 浙江农业学报， 1991， 3（3）： 143-146.
[7] 姜振峰， 刘志华， 李文滨， 等. NaN3对大豆M1的生物学诱变
效应[J]. 核农学报， 2006， 20（3）： 208-210.
[8] 崔广荣， 张子学， 张从宇， 等. 蝴蝶兰NaN3离体化学诱变及再
生植株RAPD检测[J]. 热带作物学报， 2010， 31（4）： 592-599.
[9] 付凤玲， 李晚忱， 荣廷昭， 等. 用γ射线和 NaN3诱变的玉米愈
伤组织筛选耐旱和雄性不育材料[J]. 核农学报， 2005， 19（5）：
356-359.
[10] 张子学， 杨久峰， 檀赞方. 植物生长调节剂对甜叶菊增殖和生
根的影响[J]. 中国林副特产， 2008， 93（2）： 13-15.
[11] 董振红， 王贵民， 王彦超， 等. 甜叶菊茎尖组培苗生根及移栽
的研究[J]. 中国糖料， 2008（2）： 28-29.
[12] Sung J H. Rapid in vitro propagation and enhanced stevioside
accumulation in Stevia rebaudiana Bertoni [J]. Journal of Plant
Biology， 2006， 49（4）： 267-270.
[13] Ibrahim I A， Nasr M I， Mohammedm B R， et al. Plant
growth regulators affecting in vitro cultivation of Stevia
rebaudiana Bertoni[J]. Sugar Tech， 2008， 10（3）： 254-259.
[14] Sreedhar R V， Cenkatachalam L， Thimmaraju R， et al. Direct
organogenesis from leaf explants of Stevia rebaudiana and
cultivation in bioreactor[J]. Biologia Plantarum， 2008， 52（2）：
355-360.
[15] Ferrira C M， Walter H. Production maintenance and plant
regeneration from cell suspension cultures of Stevia rebaudiana
Bertoni[J]. Plant Cell Reports， 1988（7）： 123-126.
[16] 温 亮， 王中华， 霍雪梅， 等. 李属植物叶片红色性状RAPD
分子标记研究[J]. 河北农业大学学报， 2009， 32（4）： 43-45.
[17] 冯尚国， 赵红燕， 胡 旭， 等. SRAP和TRAP分子标记及其
在植物研究中的应用 [J]. 杭州师范大学学报 （自然科学版 )，
2010， 9（3）： 178-184.
[18] 胡能兵. 紫色辣椒再生体系的建立及种质亲缘关系分析[D]. 安
徽农业大学， 2008.
[19] 胡能兵 ， 何克勤， 张子学， 等 . 甜叶菊RAPD反应体系的优
化 [J]. 激光生物学报， 2011， 20（4）： 560-563.
[20] Sanguinetti C J， Dias Neto E， Simpson A J. Rapid silver
staining and recovery of PCR products separated on
polyacrylamide gels[J]. Biotechniques， 1994， 17（5）： 914.
[21] 刘进平， 郑成木. 诱变结合植物组织培养在植物育种中的应
用[J]. 上海农业学报， 2004， 20（1）： 19-21.
[22] Goh M W K， Kumar P P， Lin S H， et al. Random amplified
polymorphic DNA analysis of the mothorchids，Phalaenopsis
（Epidendroideae: Orchidaceae) [J]. Euphitica， 2005， 14 （1）：
11-22.
[23] 安学丽， 蔡一林， 王久光， 等. 甲基磺酸乙酯对玉米自交系诱
变效应的研究[J]. 玉米科学， 2003， 11（3）： 74-75.
[24] 陈 超， 王桂兰， 乔永旭， 等. 蝴蝶兰类圆球茎的化学诱变试
验[J]． 核农学报， 2006， 20（2）： 99-102.
870- -