全 文 ：树舌（Ganoderm applanatum）隶属于灵芝属的
药用真菌， 其子实体中含有糖类、 甾体化合物、 三
萜类及生物碱类等多种生物活性物质 [1]。 近代医学
证明子实体多糖有防止动脉硬化、 提高免疫力、 抗
肿瘤、 抗衰老等多种作用 [2]。 已有报道表明， 树舌
液体发酵产物菌丝体中和发酵液中具有与子实体相
同的成分， 且多糖具有较强的生物活性[3-4]。
锌是人体必需的微量元素之一， 参与人体的多
种代谢活动。 目前医学研究表明， 儿童缺锌发生率
较高， 适当补锌尤为重要， 但无机锌不利于吸收，
且过多对人体有毒害 [5]。 因此， 通过生物转化方式
将无机锌变为低毒、 利于人体吸收的有机锌， 是人
们研究的一个重点。
本研究对树舌进行深层富锌培养， 以制备富锌
多糖， 并对其体外抗氧化活性进行研究， 以期为树
舌富锌多糖药物的研究开发和利用提供一定的理论
依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌种 树舌, 购于广东微生物研究所。
1.1.2 发酵培养基 葡萄糖 30 g、 蛋白胨 5 g、 酵
母粉 5 g、 KH2PO4 3.0 g、 MgSO41.0 g、 水 1 000 mL。
1.1.3 主要设备 T6新世纪型紫外可见分光光度
计（北京普析通用仪器有限公司）， QYC211型恒温振
荡培养箱（上海福玛实验设备有限公司）， LDZX-
50KBS型立式蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂），
FA1004电子分析天平（上海精科天平有限公司 ），
FD-1真空冷冻干燥机（南京科尔仪器设备有限公
司 ）。
热带作物学报 2012， 33（5）： 890-893
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期： 2012-03-17 修回日期： 2012-04-20
基金项目： 安徽高校省级科学研究重点项目（No. KJ2012A063）； 安徽省自然科学基金项目（No.11040606M96）； 安徽科技学院生物学校级重
点建设学科项目（No. AKXK20102-1）； 安徽科技学院重点建设课程项目（No. ZDKC1110）。
作者简介： 李正鹏（1971 年—）， 男， 硕士， 副教授。 研究方向： 微生物生物技术。
树舌胞外富锌多糖体外抗氧化活性研究
李正鹏， 吴 萍， 孙玉军， 王松华
安徽科技学院生命科学学院， 安徽凤阳 233100
摘 要 利用树舌的深层发酵法获得胞外富锌多糖， 从抗油脂过氧化、 抑制羟自由基的产生、 清除 DPPH·和 O2·-
4 个方面， 探讨树舌胞外富锌多糖抗氧化活性。 结果表明： 树舌富锌培养基内 ZnSO4浓度在 200 μg/mL 时， 可以
显著提高胞外多糖的有机锌含量， 使有机锌含量达 0.67 mg/g， 比对照组提高 252％。 有机锌对提高胞外多糖抗
氧化能力有显著的效果， 在多糖浓度为 2.5 g/L， 对油脂过氧化的抑制、 清除羟自由基、 DPPH·和 O2·-的能力分别
比对照提高 12.5％、 26.83％、 30％ 和 20％。 胞外富锌多糖抗氧化活性与多糖浓度呈显著的量效关系。
关键词 树舌； 富锌多糖； 抗氧化活性
中图分类号 S567.3 文献标识码 A
Antioxidant Actibity in Vitro of Zinc Rich Exopolysaccharide
from Ganoderm applanatum
LI Zhengpeng， WU Ping， SUN Yujun， WANG Songhua
College of Life Sciences, Anhui Science and Technology University, Fengyang, Anhui 233100, China
Abstract Zinc-rich exopolysaccharide（ZEPS）was prepared by submerged fermentagtion of Ganoderm applanatum.
The antioxidant activities of ZEPS were evaluated by determining its inhibitory effect on peroxidation of oiol, its
scavenging hydroxyl radicals, DPPH·, superoixide anion. The result showed that the organic zinc reached 0.67 mg/g
at ZnSO4 200μg/mL, which was 252% higher than that of the control. The organic zinc could greatly enhance the antioxidant
capacity of ZEPS. Its capacities of the inhibition of linoleic acid autoxidation, the scavenging of hydroxyl radicals,
DPPH and O2·- were 12.5%, 26.83%, 30% and 20% higher than that of the control, respectively. The antioxidant
capacity of ZEPS displayed a dose-response relationship with the concentration of ZEPS.
Key words Ganoderm applanatum； Zinc-rich exopolysaccharide； Antioxidant activity
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2012.05.021
第 5 期
样 品 纯多糖含量/％ 多糖有机锌含量/（mg/g）
富锌培养 （94.254±0.245）* （0.67±0.012）*
对照培养 （89.838±0.648） （0.19±0.015）
表 1 精制多糖中多糖和有机锌含量
说明： 与对照组比较，*表示差异显著﹙p＜0.05）。
1.2 方法
1.2.1 富锌培养 将培养好的树舌液体种子按
10％的接种量接入 500 mL 装液量为 200 mL 液
体发酵培养基的三角瓶中 ， 其中 ZnSO4 含量为
200 μg/mL（由预备实验结果确定 ）， 于恒温振荡
器上， 28 ℃、 160 r/min 培养 7 d。 同时以不加锌
的培养作为对照处理组。
1.2.2 胞外多糖的制备过程 发酵液→离心→上
清液→醇沉→离心→沉淀物→冷冻干燥→粗多糖→
溶解→Sevag 法去蛋白→透析→浓缩→冷冻干燥→
精制多糖。
1.2.3 多糖含量的测定 硫酸-苯酚法[6]
1.2.4 多糖有机锌含量的测定 参见陈宏伟等[7]对
多糖样品的处理， 并利用原子吸收法测定。
1.2.5 胞外锌多糖抗油脂氧化能力的测定 采用
硫代巴比妥酸法[8]。 在 1.0 mL 的芝麻油中加入不同
浓度的多糖溶液 1 mL， 再加入 2.8 mg/mL 的硫代巴
比妥酸（TBA） 5 mL，在90℃恒温箱中保持6 h， 取出
后加入100 mg/mL的三氯乙酸 （TCA） 5 mL， 然后再
加入三氯甲烷 2 mL， 上下颠倒 10次， 静置 10 min，
取上清液在 532 nm 下比色。 以蒸馏水代替样品不
经烘箱处理为空白， 蒸馏水经烘箱处理代替样品为
对照。 抗氧化活性用对油脂过氧化的抑制率表示，
抑制率公式为：
抑制率/％=[(A0-A)/A0]×100 （1）
式中： A0为对照管的吸光值； A样品管的吸光
值。
1.2.6 胞外锌多糖清除羟基自由基的测定 取不
同浓度的多糖溶液 1mL于试管中， 依次加入 6 mmol/L
的硫酸亚铁溶液 2 mL 混匀， 6 mmol/L 的过氧化氢
溶液 2 mL 混匀， 静置 10 min， 再加入 6 mmol/L 的
水杨酸溶液 2 mL 静置 30 min 后于 510 处测其吸光
值[9]。 空白对照以蒸馏水代替多糖溶液。 清除率公
式为：
E（·OH）/％=[1-(Ai-Aj)/A0]×100 （2）
式中： E（·OH）为树舌多糖对·OH的清除率；
A0为空白吸光值； Ai为多糖的吸光值； Aj为双蒸水
代替无水杨酸时多糖的吸光值。
1.2.7 胞外锌多糖清除 DPPH·的测定 本实验
方案参照 Amarowicz 等的方法 [10]并加以改进。 准确
称取 DPPH标准品 4 mg， 用无水乙醇定容至 100 mL
备用。 取不同浓度的多糖溶液 2 mL 于试管中， 再
加入 2mL6.5×10-5mol/LDPPH溶液， 混合均匀， 反应
30min后以 3000 r/min的速度离心 10min， 取上清液
在 517 nm处测吸光值为 Ai， 清除率公式为：
E(DPPH·)/％=[1(Ai-Aj)/A0]×100 （3）
式中： E(DPPH·)为树舌多糖对 DPPH·的清除
率； A0为 2 mL DPPH·溶液+2 mL 双蒸水混匀测定
的吸光值； Ai 为 2 mL DPPH·溶液+2 mL 多糖溶液
混匀测定的吸光值； Aj 为 2 mL 无水乙醇+2 mL 多
糖溶液混匀测定的吸光值。
1.2.8 胞外锌多糖对超氧阴离子自由基清除能力的
测定 于各试管中分别加入 1 mL不同浓度的多糖
溶液， 再加 0.05 mol/L pH 8.2的 Tris-HCl溶液 3 mL，
各管用蒸馏水补齐到 6.5 mL， 37℃水浴 10 min， 最
后加入 37 ℃预热过的 7 mmol/L 邻苯三酚盐酸溶液
1 mL（用 10 mmol/L 的盐酸配制）， 混匀， 精确反应
6 min， 立即用 0.5 mL 8 mol/L 浓盐酸终止反应， 在
320 nm 处测吸光度。 以 Tris-HCl 缓冲液代替样品
作空白对照， 根据吸光度计算清除率[11]。 清除率公
式为：
清除率=[（A0-A）/A0]×100％ （4）
式中： A0 为空白对照管吸光度； A 为样品管
的吸光值。
1.2.9 统计方法 利用 DPS 数据处理软件的 LSD
法对实验结果进行显著性分析。
2 结果与分析
2.1 胞外多糖含量分析
根据硫酸-苯酚法和原子吸收法测定精制多糖
样品中纯多糖含量及多糖中锌的含量， 结果如表 1
所示。 由表 1 可知， 富锌培养的醇沉胞外多糖高
于对照培养的多糖产量， 有机锌含量也高于对照
组。 富锌培养的锌多糖含量比对照提高 252％。 由
此可见 ， 培养基内添加 ZnSO4 浓度为 200 μg/mL
时， 可以显著提高多糖的含量及胞外多糖的有机
锌的含量。
2.2 胞外锌多糖对油脂过氧化的抑制作用
由图 1可知， 在实验浓度范围内， 随多糖溶液
浓度的增加， 对油脂的抗氧化抑制作用逐渐增强，
且有锌多糖比无锌多糖对油脂过氧化的抑制要强，
呈现良好的量效关系， 在胞外锌多糖浓度为 2.5 g/L
时对油脂过氧化的抑制作用达 58.33％， 比对照组
提高了 12.5％。 2 种培养方式的胞外多糖对油脂过
李正鹏等： 树舌胞外富锌多糖体外抗氧化活性研究 891- -
第 33 卷热 带 作 物 学 报
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
多糖浓度/（g/L）
对照培养胞外多糖
富锌培养胞外多糖
清
除
率
/％
80
70
60
50
40
30
20
10
0
j
i h
g
f
de
b c
a
图 3 胞外多糖对 DPPH·的清除作用
对照培养胞外多糖
富锌培养胞外多糖
清
除
率
/％
70
60
50
40
30
20
10
0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
多糖浓度/（g/L）
i h
g
f
d
e
b c
a
d
图 4 胞外多糖对超氧阴离子的清除作用
对照培养胞外多糖
富锌培养胞外多糖
抑
制
率
/％
70
60
50
40
30
20
10
0
j
b i
f
g
d e
c
b
a
图中不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）。
图 1 胞外多糖对油脂过氧化的抑制作用
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
多糖浓度（g/L）
清
除
率
/％
70
60
50
40
30
20
10
0
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
多糖浓度/（g/L）
对照培养胞外多糖
富锌培养胞外多糖
j i
h
g f
d e
b c
a
图 2 胞外多糖对羟基自由基的清除作用
氧化抑制的半数抑制率分别为 IC50=2.24g/L 与 IC50=
2.47 g/L。 2种培养方式的胞外多糖对油脂过氧化抑
制作用存在显著差异。
2.3 胞外锌多糖对羟自由基的清除作用
由图 2可知， 羟自由基的清除率随多糖浓度的
提高而增加， 当富锌培养的胞外多糖浓度为 2.5 g/L
时， 清除羟自由基的能力达到 61.25％， 比对照组
培养提高 26.83％。 2种培养方式的胞外多糖对羟自
由基的清除作用的半数清除率分别为 IC50=1.92 g/L
与 IC50=2.61 g/L。 经方差分析， 2 种培养方式的胞
外多糖对羟自由基的清除作用存在显著差异， 可见
锌具有明显的提高多糖对羟自由基的清除作用。
2.4 胞外锌多糖对 DPPH·的清除作用
由图 3 可知 ， 随着多糖浓度增加 ， 清除
DPPH·的作用逐渐增强， 呈现一定的量效关系。 当
富锌多糖浓度达 2.5 g/L 时， 对 DPPH·清除率达到
72.34％， 比对照组提高了 30％。 2 种培养方式的
胞外多糖对羟自由基的清除作用的半数清除率分别
为 IC50=1.67 g/L 与 IC50=2.16 g/L。 经方差分析 2 种
培养方式的胞外多糖对 DPPH·的清除作用存在显
著差异， 可见锌具有明显的提高多糖对 DPPH·的
清除作用。
2.5 胞外锌多糖对O2·-的清除作用
由图 4可以看出， 树舌胞外多糖对超氧阴离子
自由基有良好的清除能力， 其效果与多糖添加量呈
正相关性。 当富锌多糖浓度达 2.5 g/L时， 对超氧阴
离子的清除率达到 60.28％， 比对照组提高了 20％。
2种培养方式的胞外多糖对超氧阴离子清除作用的半
数抑抑制率分别为 IC50=2.35 g/L与 IC50=1.92 g/L。 经
方差分析 2种培养方式的胞外多糖对超氧阴离子的
清除作用存在显著差异， 可见锌具有明显的提高多
糖对超氧阴离子的清除作用。
3 讨论与结论
超氧阴离子自由基与羟基自由基合称氧自由
基， 其对人体健康的影响很大， 如肿瘤发生、 心脑
血管疾病、 人体衰老等过程都涉及到自由基和活性
氧 [12]。 DPPH 是一种早期合成的有机自由基， 常用
来评估抗氧化物的供氢能力。 生物体中的细胞膜和
细胞器膜含有大量的不饱和脂肪酸， 很容易引起脂
质过氧化， 很多疾病与细胞衰老现象都与脂质过氧
化有关。 多糖是生物体普遍存在的一类生物大分
子， 具有特殊的生物活性和药理特性， 没有直接的
细胞毒性。 作为外源性抗氧化剂， 多糖在生物体内
的作用机理可能是直接清除活性氧自由基， 这种清
除能力可能与多糖含有大量游离羟基有关。 此外，
多糖有可能参与调动或激活机体内处于非活化状态
的内源性氧化剂， 使其数量和活性增强到机体需要
的水平， 从而避免或减轻自由基对机体的损伤[13-14]。
892- -
第 5 期
多糖的抗氧化活性， 可能是多糖抗衰老、 抗炎症、
抗肿瘤等功效的药理基础。 陈宏伟等 [7]的研究结果
表明有机锌可以显著提高蛹虫草胞外多糖对自由基
的清除能力。 李志洲[15]研究表明猪苓含锌多糖比猪
苓多糖的体抗氧化能力高。 张笑然等[16]的研究表明
富锌姬松茸胞多糖比不富锌的胞粗多糖肿瘤抑制率
有明显的提高。 这些结果与本研究获得的树舌富锌
胞外多糖具有很强的抗氧化活性基本一致。 这些结
果为今后深入研究锌元素在这些多糖(或糖-蛋白质
复合物)中的存在方式及其与富锌多糖样品抗氧化
作用之间可能存在的关系提供了参考。
本实验研究表明树舌富锌培养基内 ZnSO4浓度
为 200 μg/mL时， 可显著提高多糖的含量及多糖中
锌的含量， 使有机锌含量达 0.67 mg/g， 比对照组
提高 252％。 有机锌对提高胞外多糖抗氧化能力有
显著的效果， 在多糖浓度为 2.5 g/L， 对油脂过氧化
的抑制、 清除羟自由基、 DPPH·和超氧阴离子自
由基的能力分别是比对照提高 12.5％、 26.83％、
30％和 20％。 胞外锌多糖抗氧化能力与多糖浓度
呈一定的量效关系， 值得深入开发研究。
参考文献
[1] 周忠波 , 马红霞 , 图力古尔 . 树舌化学成分及药理学研究进
展[J]. 菌物研究, 2005, 3（1）： 35-42.
[2] 曹艳菲 , 宋高臣 , 刘 欣 , 等 . 树舌多糖GF抗肿瘤的研究进
展[J]. 牡丹江医学院学报, 2007, 28（3）： 96-99.
[3] 刘英杰， 李雨婷， 苏 玲， 等. 树舌灵芝液体深层发酵菌丝体
化学成分研究[J]. 中国生化药物杂志, 2011, 32（5）： 360-362.
[4] 李正鹏, 吴 萍, 吴苏青. 树舌胞内多糖抗氧化活性的研究[J].
食品工业科技, 2009, 230（6）： 108-110.
[5] 张建辉 . 冬虫夏草、 蛹虫草、 姬松茸的液体培养条件及其富
锌、 硒的研究[D]. 沈阳： 东北农业大学， 2003.
[6] 张惟杰 . 糖复合物生化技术 [M]. 杭州： 浙江大学出社 , 1999:
10-12.
[7] 陈宏伟 , 陈安徽 , 邵 颖 , 等. 蛹虫草胞外锌多糖抗氧化能力
的研究[J]. 食品与发酵工业, 2009, 35（6）： 54-58.
[8] 杨貌瑞. 食用油脂中过氧化脂质的快速测定法[J]. 食品与发酵
工业, 1994（3）： 57-59.
[9] 王宏勋, 张 雯, 颜克亮, 等. 复合枸杞灵芝胞内多糖体外抗
氧化作用初步研究[J]. 中国食用菌, 2007, 26（3）： 38-40.
[10] Amarowicz R, Naczk M, Shahidi F. Antioxidant activity of
various fractions of non -tannin phenolics of canola hulls [J].
Jagric Food Chem, 2000（48）： 2 755-2 759.
[11] 孙玉军 , 陈 彦 , 王松华 , 等. 胡萝卜多糖体外抗氧化活性研
究[J]. 热带作物学报, 2011, 32（3）： 403-406.
[12] Yen G C, Duh P D, Tsai C L. Relationship between
antioxidant activity and matrity of peanut hulls [J]. Agric Food
Chem, 1993, 41: 67.
[13] 陈 莲, 林河通 , 郭巧玲 , 等. 台湾青枣多糖抗氧化活性的研
究[J]. 热带作物学报, 2010, 31（5）： 863-866.
[14] 胡一鸿 , 叶 龙 , 朱术超 , 等. 番荔枝种子粗多糖抗氧化能力
研究[J]. 热带作物学报, 2011, 32（6）： 1 051-1 054.
[15] 李志洲. 猪苓多糖的提取及其锌配合物抗氧化性研究[J]. 食品
研究与开发, 2011, 32（2）： 45-50.
[16] 富锌姬松茸孢内多糖的分离及体内抑制小鼠肝癌的研究[J]. 食
品与生物技术学报, 2007, 26（2）： 43-48.
责任编辑： 凌青根
李正鹏等： 树舌胞外富锌多糖体外抗氧化活性研究 893- -