全 文 ：海洋科学/2008年/第 32卷/第 7 期
条斑紫菜光系统Ⅱ反应中心蛋白编码 psbA和 psbD的表达分析
陈张帆1 , 2 ,王广策1
(1.中国科学院 海洋研究所 ,山东 青岛 266071;2.中国科学院 研究生院 ,北京 100049)
摘要:从条斑紫菜(Porphy ra yezoensis Ueda)的 3 个不同的生长阶段:壳孢子 、孢子体和配子体中提取总
RNA , 并用相应基因的引物扩增序列 ,用荧光定量 PCR技术检测条斑紫菜 3 个生长阶段中 psbA 和 psbD 的
转录水平变化。结果表明 , psbA 和 psbD 的变化趋势不一致 , 并且 ,在壳孢子内基因表达量相对较高。这说
明在细胞内 , D1 蛋白和 D2 蛋白并非同比例合成。壳孢子成熟发育成叶状体的过程要求光合作用提供更多
的能量 。
关键词:条斑紫菜(Porphy ra yezoensis Ueda);不同发育阶段;psbA;psbD;基因表达
中图分类号:Q945.11　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1000-3096(2008)07-0052-05
　　条斑紫菜(Porphy ra yezoensis Ueda)是太平洋
西部特有的物种 ,也是国内人工栽培的重要种类之
一。作为一种经济海藻 ,人们对条斑紫菜的生活史
研究得较为透彻 。其生活史包括二倍丝状孢子体和
单倍叶状配子体两个主要的多细胞阶段 ,且具有果
孢子 、壳孢子和单孢子 3个主要的单细胞阶段。成
熟的配子体即叶状体 ,雌雄分化并受精 ,形成果孢
子 ,果孢子萌发产生孢子体即丝状体 ,丝状体生长成
熟后产生壳孢子 , 壳孢子经过附着 、萌发产生叶状
体。在一定条件下 ,叶状体能形成单孢子 ,单孢子可
直接发育成叶状体[ 1] 。基于条斑紫菜的异型世代交
替的生活史 ,有人提出将其作为海藻模式生物 ,这对
海藻的研究有着重要的意义和作用[ 2] 。
条斑紫菜虽然是真核生物 ,但其捕光色素系统
与原核生物蓝藻极其相似 ,均含有藻胆体[ 3] 。在其
细胞的类囊体膜上同时存在光系统 I(PS Ⅰ)和光系
统Ⅱ(PS Ⅱ)膜蛋白复合体 。外周捕光色素系统———
藻胆体捕获光能后 ,通过内周捕光色素系统———叶
绿素 a-蛋白质复合物传递给 PS Ⅱ反应中心[ 4] 。PS
Ⅱ的两个反应中心蛋白 , D1 和 D2 ,分别由 psbA 和
psbD编码。反应中心蛋白结合 P680 、去镁叶绿素和
质醌等电子转移载体 ,将电子由 PS Ⅱ传递到 PS Ⅰ ,
以此产生 A TP 和 NADPH 还原 CO2生成碳水化合
物[ 5] 。因此 ,研究条斑紫菜的光系统作用对研究红
藻的光系统进化有着重要的意义。
在藻类发育的基础上 ,展开光合作用的研究是
有意义的 。条斑紫菜是很好的研究材料 ,其生活史
中包含单细胞和多细胞阶段 ,并且各个发育阶段的
形态特征明显。另外 ,每个发育阶段都可在实验室
条件下单独培养 ,易于取材 。虽然紫菜的孢子体和
配子体在生长环境 、藻体形态 、细胞结构和生理特性
等方面存在差异[ 6] ,但都进行光合作用 。有关紫菜
光合作用的研究 ,国内外已有报道[ 7 ～ 9] 。梁军等[ 10]
研究了在不同温度 、光强和 pH 下 ,条斑紫菜孢子体
和配子体 PS Ⅱ的活性变化 。柳葵葵等[ 11] 对条斑紫
菜的孢子体和配子体 PS Ⅱ的稳定性进行了研究 。
然而 ,对于其反应中心蛋白的研究较少 ,对其基因的
研究也未见报道 。
本实验选取条斑紫菜的 3个不同生长发育阶段
的壳孢子 、孢子体 、配子体为材料 ,对 psbA(编码 D1
蛋白)和 psbD(编码 D2蛋白)的表达量进行检测 ,研
究生长条件不同及细胞形态不同的情况下 , psbA 和
psbD mRNA转录水平的变化 ,以探讨 PS Ⅱ的活性
在条斑紫菜的不同生长阶段的变化。
1　材料和方法
1.1　细胞培养和材料采集
1.1.1　条斑紫菜壳孢子的采集
条斑紫菜壳孢子于 9月中下旬采自江苏省海安
县养殖场 ,离心收集 ,保存于-80℃冰箱中 。
1.1.2　条斑紫菜孢子体的培养
条斑紫菜孢子体培养于 PES海水培养基中 ,培养
光照为1 000 lx ,培养温度为 20℃±2℃,通气培养。
1.1.3　条斑紫菜配子体的采集
条斑紫菜配子体由江苏省海洋水产研究所提供 ,
收稿日期:2008-04-25;修回日期:2008-05-05
基金项目:国家科技支撑计划项目(2006BAD09A04);国家 863 计划
项目(2006AA10A413)
作者简介:陈张帆(1985-),女 ,上海人 ,硕士 ,研究方向为藻类遗传与
发育 , 电话:0532-82898575 , E-mai l:chenzhangfan@ms.qdio.ac.cn;
王广策 , 通讯作者 , 研究员 , 博士 , 电话:0532-82898574 , E-mai l:gc-
w an g@m s.qdio.ac.cn
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Marine Sciences/ Vol.32 , No.7/ 2008
使用前将阴干的紫菜静置于 PES 海水培养基中 ,复
苏 24 h后用于实验。
1.2　方法
1.2.1　RNA 提取
RNA 根据 T rizol Reagent (Invit rogen)的说明
书提取。称取 100 mg 材料 ,用液氮研磨 ,加入 1 mL
T rizol试剂 ,在室温下放置10 min后离心 ,12 000 g ,
4°C ,10 min ,取上清液 。在上清液中加入 200 μL 氯
仿 ,振荡 15 s ,在室温下静置2 ～ 3 min ,离心 ,12 000 g ,
4°C ,15 min ,取上清液 。在上清液中加入 500 μL 预
冷的异丙醇 ,在室温下静置 10 min ,离心 , 12 000 g ,
4°C ,10 min。在沉淀中加入 1 mL 预冷的 75%乙醇
洗涤沉淀 ,离心 ,7 500 g ,4°C ,5 min 。可以重复洗涤
一遍 。加入适量的 DEPC水溶解 RNA ,置于-80°C
保存 。电泳检测 。
1.2.2　cDNA 的合成
根据 RNA 的浓度 ,加入适量的 RQ1 RNase -
Free DN ase (Promega)消化总 RNA 中的基因组
DNA ,37℃反应 30 m in ,加入 1 μL Stop S olution ,
65℃反应10 min ,终止消化反应 。根据MMLV 逆转
录酶(Promega)的说明书 ,用随机引物将 RNA 反转录
合成 cDNA , cDNA稀释 1 000倍作为 PCR的模版。
1.2.3　引物设计
根据荧光定量 PCR的引物设计原则[ 12] ,利用
primer premier 5.0引物设计软件设计 18S rRNA 、
psbA 、psbD基因的特异性引物(表 1)。基因序列来
自 GenBank (www .ncbi.nlm.nih.gov)。为了确保
引物的特异性 ,在每一个 PCR反应之后进行熔解曲线
分析 ,曲线若为单一峰表明此 PCR反应具有特异性。
表 1　荧光定量 PCR引物
Tab.1　Real-time quantitative PCR primers
基因名称 序列号 引物 引物序列(5′※3′) 扩增序列长度(bp)
18S rRNA AY131005
正向引物
反向引物
CGACCGTTTACTGTGAAG
GACAATGAAATACGAATGCC
160
psbA AP006715
正向引物
反向引物
GAT TCGTT TTCGCTTGTT TCAC
TGGATTTCCGT TGCTT TTACTG
272
psbD AP006715
正向引物
反向引物
ACCAGCGAGTAAAACCTCC TTGA
GACGATTGGCTAAATAGAGACCGA
259
1.2.4　荧光定量 PCR
25 μL 反应体系中 包含 SYBR-Green mix
(TO YOBO)12.5 μL ,正向引物(5 μmol/L)0.5μL ,
反向引物(5μmol/ L)0.5μL ,模板 2.5 μL ,超纯水补
足 25 μL 。每个样品均重复 3管 ,每次设空白对照 ,
在 Bio-Rad IQ5 荧光 PCR仪上进行扩增和实时检
测。反应条件:94℃预变性 3 min;94℃变性 15 s ,
58℃退火 40 s ,72℃延伸 30 s , 35个循环;72℃延伸
5 min。反应结束后 ,进行 PCR产物的熔解曲线分
析:从 58℃到 95℃,每循环上升 0.5℃,持续信号采
集 30 s ,共 75个循环。
1.2.5　数据分析
根据■■CT 法[ 13] ,将每份样品进行归一化处理 ,
即每份 cDNA中的目的基因除以看家基因的量。归一
化后选取 T=0时刻的目的基因量作为基准 ,其他时刻
目的基因的量与选取的基准量值进行倍比分析。计算
psbA和 psbD的相对表达差异 ,两两比较用 t检验。
2　结果
2.1　RNA 的提取
图1中可以看出 , RNA中均有 18S 与 28S rRNA
的条带 ,略有拖尾的现象。孢子体的总 RNA 提取量
较配子体多。RNA 和标准分子质量的上样量均为
2 μL 。
图 1　条斑紫菜总 RNA 琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig.1 　The agaro se gel electropho resis o f RNA ext racted
f rom P.yezoensis
M.DL2000;A.孢子体 RNA;B.配子体 RNA
M.DL2000;A.RNA from sporophytes of P.yezoensis;B.RNA
from gametophytes of P.yezoensis
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2.2　引物的特异性检验
三对引物的特异性由熔解曲线检验。在图 2
中 ,纵坐标为荧光信号对熔解温度取微分 ,横坐标为
熔解温度 。18SrRNA , psbA , psbD 基因的产物均只
有单峰 ,且单一峰值出现在 83 ～ 87℃范围内 ,这表明
没有引物二聚体或其他非特异性扩增 ,三对引物均
可用于基因表达量检测。
图 2　PC R产物熔解曲线
F ig.2　The me lt curve o f PCR product
A.18S r RNA 产物;B.psbA 产物;C.p sbD产物
A.18S rRNA;B.psbA;C.psbD
2.3　psbA 和 psbD 的表达变化
如图 3 所示 , psbA 基因在配子体中表达量最
低 ,在孢子体中的表达量为配子体中的 1.45倍(P<
0.05)。在壳孢子中 , psbA 基因的表达量明显升高 ,
为孢子体中的 3.97 倍(P <0.01),为配子体中的
5.75倍(P<0.01),差异极显著 。
psbD基因在孢子体中的表达量最低 ,在壳孢子
中的表达量略有升高 ,为孢子体中的表达量的 1.77
倍(P <0.05),差异显著 。在配子体中 , psbD的表达
量最高 ,为壳孢子中表达量的 1.46倍(P<0.05),为
孢子体中的表达量的 2.59 倍(P <0.01),差异极其
显著。
图 3　Real-time PCR 检测条斑紫菜的不同生长发育阶
段细胞中 psbA 和 psbD基因的表达
F ig.3　The re lativ e amount o f the transcripts o f psbA
and psbD in Porphy ra yezoensis cells co llected
in different g rowth pha ses
3　讨论
紫菜中的多糖 、蛋白 、多酚等物质的含量较高 ,易
造成核酸降解或是与核酸形成难溶于水的复合物 ,并
且在提取 RNA的过程中 ,基因组 DNA的干扰也较为
严重 。因此 ,紫菜的 RNA 提取难度较大[ 14] 。本实验
中 ,通过 Trizo l法可以得到条斑紫菜的总 RNA 。虽
然点样孔有少许亮点 ,说明 RNA样品中仍混有多糖
或蛋白质未去除 ,但 18S 和 28S rRNA 的条带都较
为清楚 。不过在孢子体 RNA 样品中 ,存在少许拖尾
降解现象。另外 ,由于配子体的多糖及蛋白含量较
孢子体丰富 ,因此配子体的 RNA得率明显较孢子体
低 。
作为一种可以检测低丰度基因表达的技术 ,荧
光定量 PCR 的方法用于检测条斑紫菜 psbA 和
psbD基因在不同生长发育阶段的表达是可行的 。
SYBR Green染料法中 ,染料特异性地渗入 DNA 双
链中发生荧光信号[ 15] ,这个信号随着 PCR产物的增
加而增大。因着 SYBR G reen染料非特异结合所有
DNA双链 ,在实验中要避免产生非特异性扩增与引
物二聚体 ,以免产生的 Ct值 ,即每个反应管内的荧光
信号达到设定的域值时所经历的循环数 ,较实际的
低 。在本实验中 ,每个循环中的 72℃延伸 30 s ,在这
个过程中 ,荧光信号被采集 ,实时反映了 PCR 产物
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Marine Sciences/ Vol.32 , No.7/ 2008
量的增加;熔解曲线对 PCR产物的特异性进行了分
析。相对定量法使用内标基因 ,对加入的目的基因
的模板进行均一化处理 ,有效消除了各种误差 ,如细
胞数量或材料干重的误差 , RNA 提取效率的差异及
反转录效率的偏差。为了避免总 RNA 中少量基因
组 DNA 对检测带来的影响 ,本实验中用 Rnase-Free
DNase对提取的总 RNA 进行消化。
在本实验中 ,用荧光定量 PCR的技术检测了条
斑紫菜 3个不同的生长阶段中 , psbA 和 psbD 基因
的表达量。同为编码 PS Ⅱ反应中心蛋白的基因 ,
psbA和 psbD基因分别表现出不同的变化趋势 ,其
中 , psbA 在壳孢子中的表达最丰富 ,其次是孢子体 ,
配子体中表达最弱;psbD却在配子体中的表达最丰
富 ,其次是壳孢子 ,以孢子体中的表达为最弱。虽然
D1蛋白和 D2蛋白在 PS Ⅱ反应中心复合物中以同
比例装配 ,但是 psbA 和 psbD 基因的表达量变化趋
势并不同步。Kapoor 等[ 16] 在水稻的生长发育过程
中发现 ,虽然 psbA和 psbD基因的表达均增大 ,但是
它们的增大倍数不同;在光照条件下生长的水稻 ,其
psbA和 psbD基因表达量较在黑暗条件下生长的水
稻增大不少 ,但是它们的增大倍数仍存在差异。这
说明在细胞内 ,D1和 D2蛋白的合成并非是同比例 ,
这或许与蛋白的功能有关 。例如 ,强光照射下 , PS Ⅱ
复合体的损伤主要在于 PS Ⅱ反应中心 D1蛋白的降
解 ,而损伤的速率直接与光强有关 ,因此 , D1蛋白翻
译的调控受光强影响[ 17] 。PS Ⅱ复合体的修复包括
受损的 D1蛋白的降解以及新合成的 D1 蛋白的插
入[ 18 , 19] ,而 psbA 基因的 mRNA 翻译是 D1 蛋白合
成的关键调控步骤[ 20 ～ 22] ,所以 psbA 基因与 D1蛋白
的降解和合成有关。目前 ,有关蛋白功能和基因功
能的研究都比较少 ,因此 ,引起 psbA 和 psbD基因的
表达量变化趋势不一致的原因还有待进一步研究 。
在条斑紫菜的 3个生长阶段中 ,壳孢子的 psbA
和 psbD基因表达量相对较高。在壳孢子的放散过
程中 ,其 PS Ⅱ的活性会随时间而增加(实验室未发
表数据)。刚放散的壳孢子几乎没有 PS Ⅱ活性 ,而
在细胞内 ,色素体模糊 ,蛋白核分裂[ 23] ,这些形态的
变化均表明了壳孢子的光合作用并不完整 ,而细胞
内的储存物质为壳孢子的细胞壁形成和萌发供给能
量。在放散了一段时间的壳孢子中 ,色素体逐渐清
晰 ,PS Ⅱ活性也逐渐增加 ,光合作用增强为壳孢子的
成熟并发育成叶状体提供能量。因此 ,有关光合作
用的基因集中表达 ,壳孢子内的 psbA 和 psbD基因
表达量也就相对较高 。
由于条斑紫菜各个发育阶段的生长环境都不相
同 ,对于光合作用基因 psbA和 psbD来说 ,发育过程
及环境因素 ,如温度 、光照 ,均可能对它们的表达量
变化产生一定的影响。因此 ,在后期工作中 ,可以分
别着手发育过程及环境因素研究 psbA和 psbD基因
的调控 。例如 ,通过测定配子体干出和复水过程中
基因的表达 ,研究干出对光合作用的影响;通过在极
大光强或黑暗条件下测定基因的表达 ,研究光强对
某一生长状态下光合作用的影响。另外 ,也可以通
过取在实验室最佳培养条件下培养的孢子体及配子
体 ,研究发育过程对基因的调控 。
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Expression analysis of psbA and psbD genes of Por phyra
yezoensis in different developmental stages
CHEN Zhang-fan1 , 2 , WANGGuang-ce2
(1.Insti tute of Oceano logy , Chinese Academy of Sciences , Qingdao 266071 , China;2.Graduate University of
Chinese Academy of Sciences , Beijing 100049 , China)
Received:Apr., 25 , 2008
Key words:Porphy ra yezoensis;different developmental stag es;psbA;psbD;gene ana ly sis
Abstract:Pro teins D1 and D2 , respectiv ely encoded by psbA and psbD genes , comprise the PS Ⅱ reaction
center.They are co rrelative w ith PS Ⅱ act ivity , which is affected by light intensity and temperature.In this
study , t ranscription changes o f psbA and psbD genes in three different g row th phases of Porphy ra yezoen-
sis-conchospo res , sporophy tes and gametophy tes we re determined wi th real-time PCR.The resul ts show ed
that psbA expression changes were dif ferent f rom psbD expression changes , indicating the varia tion of D1
pro tein and D2 pro tein synthe sis.Bo th of the gene expressions w ere relatively high in concho spores , which
may be due to the higher requirement of energy pro vided by photosynthesis in concho spores than in gameto-
phytes.
(本文编辑:张培新)
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