全 文 ：楚雄师范学院学报 2015 年第 9 期
薏苡叶黑斑病病原菌分离鉴定
和生物学特性的初步研究
*
李雪玲，杨海艳，陈华红
(楚雄师范学院化学与生命科学学院，云南 楚雄 675000)
摘 要:从发生叶黑斑病的薏苡叶片上分离到一株真菌，菌株编号记为 CX098。通过传统的形态学观
察与现代分子生物学技术相结合的手段进行了鉴定，并依据其形态特点对其培养性状进行了初步研究，结
果表明: (1)该病原菌为链格孢属真菌 (Alternaria sp. ) ，病原菌的种待定。(2)该菌对供试的 7 种氮源
和碳源均能利用，最适该菌生长的氮源是蛋白胨，最适该菌生长的碳源是葡萄糖;28 ℃时该病原菌最适生
长且其孢子也最适萌发;温度高于 45℃菌丝和孢子均不能继续生长和萌发;该菌菌落在 12 h 光 /暗交替条
件下生长良好，全光照和黑暗处理间菌落生长无显著差异，有无光照对分生孢子萌发影响差异不显著;菌
丝和分生孢子萌发适应的 pH值范围较广，对酸碱度反应不敏感，该菌生长最适宜的 pH为 6. 0—7. 0。(3)
本试验中供试的 5 种杀菌剂均对该菌有不同程度的抑制作用。
关键词:薏苡;叶黑斑病;病原鉴定;生物学特性
中图分类号:Q949. 714. 2 文章标识码:A 文章编号:1671 － 7406 (2015)09 － 0038 － 06
薏苡 ［Coix lachrymajobi L． var． mayuen (Ｒoman)Stapf］，禾本科草本植物。薏苡的营养价
值很高，被列为防癌食品之一［1］。作为一种营养价值较高的粮食作物和药用植物，薏苡在全国各
个地方都有广泛栽培。目前，对薏苡的研究主要集中在药用和保健方面的作用机理［2—6］、薏苡植
株中的提取物及其药效［7—9］和抗癌方面 ［10—12］，而对薏苡栽培过程中病害的研究相对较少［13］。近
几年来，随着薏苡经济价值的不断攀升，薏苡的栽培面积和栽培规模迅速扩大，导致薏苡黑斑病
的发生非常严重，使薏苡的产量和质量都受到了很大的影响。为此，要防治薏苡黑斑病，首要的
工作应对薏苡黑斑病病原菌进行分离鉴定，了解该菌的生长特性，以期对该病进行有效的防治。
1. 材料和方法
1. 1 病原菌的分离
薏苡黑斑病病叶采自云南省楚雄州元谋县，用组织分离法分离到一株真菌菌株，菌株编号
为 CX098。
1. 2 病原菌形态学和分子生物学鉴定［14］
1. 3 生物学特性研究［15，16］
1. 3. 1 不同碳源和氮源对菌落生长的影响
1. 3. 2 不同温度对菌落和分子孢子萌发的影响
1. 3. 3 不同 pH对菌落和分子孢子萌发的影响
1. 3. 4 不同光照处理
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第三十卷第九期 楚 雄 师 范 学 院 学 报 Vol. 30 No. 9
2015 年 9 月 JOUＲNAL OF CHUXIONG NOＲMAL UNIVEＲSITY Sep. 2015
* 基金项目:云南省教育厅项目，(2014Y443) ;云南省高校科技创新团队支持计划项目 (IＲTSTYN) ;
楚雄师院院级项目 (05 － YJＲC04)。
收稿日期:2015 － 07 － 15
作者简介:李雪玲 (1965—) ，女，副教授，研究方向:微生物。
楚雄师范学院学报 2015 年第 9 期
1. 4 不同杀菌剂对菌落生长的影响［17］
2. 结果与结论
2. 1 CX098 病原菌的鉴定
2. 1. 1 形态学鉴定
该病害发病初期叶片中部出现黑色小斑点，随着时间的推移，叶片逐渐分布到整个叶片，严
重时病斑相互汇合，使整个叶片枯萎掉落。在 PDA 培养基上，菌落边缘青绿色，最中心灰白色，
圆形、规则，菌丝絮状，边缘整齐;背面褐色，菌落生长缓慢，28℃培养 6 d 后直径 3. 7 ㎝ (图
1)。菌丝浅褐色到褐色，有隔。分生孢子梗短，简单，楔状，从菌丝侧面长出，近于无色，孢子
梗长 ×宽为 (6. 2 ～ 41)μm × (1. 8 ～ 6. 7)μm。分生孢子单生，顶生，大多为几个细胞 (多隔
孢子或砖隔孢子) ;形状大多为宽椭圆形，长圆形到梨形或不规则形状大小 3. 6 ～ 16. 3 × 2. 1 ～
8μm (平均 12. 6 × 4. 2μm) ;分生孢子通常由分生孢子梗的壁破裂而分离 (图 2，图 3)。
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Figy2 Conidia 0f pathogen
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图 1 病原菌在 PDA培养基上的菌落形态 (A:PDA培养基正面;B:PDA培养基背面)
Fig. 1 Conial morpholoy of pathogen on the PDA medium (A. The front of PDA medium;B. The back of PDA medium)
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图 2 病原菌分生孢子 图 3 病原菌分生孢子和分生孢子梗 (40 倍镜下观察)
Fig． 2 Conidia of pathogen Fig． 3 Conidiophores and conidia of pathogen
2. 1. 2 病原菌 rDNA—ITS序列分析
用 BioEdit、Clustal x和 MEGA 4. 1 软件采用 NJ 法进行系统分析，构建系统进化树 (图 4)。
结果表明与其遗传距离较近的有 5 个种，属内节点支持率为 1. 00，结合其形态特征的观察研究，
初步判断供试菌株 cx098 为链格孢属真菌 (Alternaria sp.)。
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图 4 基于 5. 8S rDNA － ITS碱基序列构建的系统树
Fig． 4 Phylogenetic tree based on 5. 8S rDNA － ITS sequence
2. 2 CX098 菌株对不同氮、碳源的利用
对供试的 7 种氮源和碳源 CX098 菌株均能利用。最适氮源和碳源分别是蛋白胨和葡萄糖。不
同氮源和碳源对 CX098 菌株生长速度有显著影响 (表 1)。
表 1 不同氮源和炭源对菌株生长速度的影响
Table 1 Effect of different nitrogen and carbon sources on the strain growth speed
N源 菌落直径 (cm) 显著水平 C源 菌落直径 (cm) 显著水平
硫酸铵 3. 4 ± 0. 15 d 葡萄糖 3. 87 ± 0. 14 a
硝酸铵 3. 82 ± 0. 04 dc D －果糖 3. 65 ± 0. 10 b
甘氨酸 4. 38 ± 0. 09 b 甘油 3. 18 ± 0. 54 b
L －苯丙氨酸 3. 68 ± 0. 07 d D －半乳糖 1. 70 ± 0. 20 c
牛肉膏 4. 67 ± 0. 14 bc 乳糖 3. 30 ± 0. 13 b
蛋白胨 4. 85 ± 0. 08 a 可溶性淀粉 3. 73 ± 0. 09 b
硝酸钠 4. 5 ± 0. 06 bc 蔗糖 2. 63 ± 0. 25 b
2. 3 CX098 菌株在不同光照下的生长状况
全光照、黑暗处理与 12 h光 /暗交替处理差异极显著，其中 12 h光 /暗交替处理能促进菌落生
长，全光照和黑暗处理菌丝生长相对较缓慢。分生孢子在有光或无光照条件下均能萌发 (表 2)。
表 2 不同光照对菌落和孢子萌发的影响
Table 2 Effect of different light on colony and the spore germination
处理条件
Treatments
菌落直径 (cm)
Colony
显著水平
Significance of difference
分生孢子萌发率 (%)
Spore germination rate
显著水平
Significance of difference
光照 1. 68 ± 0. 07 b 18. 33 ± 0. 33 a
光 /黑 1. 9 ± 0. 08 a 15. 33 ± 1. 45 b
黑暗 1. 53 ± 0. 02 b 2. 33 ± 0. 88 c
2. 4 CX098 菌株生长和孢子萌发在不同温度下的状况
试验结果表明，该病原菌在 15 ～ 40℃范围内均能生长，最适菌株的生长温度和孢子萌发温度
均为 28 ℃。温度高于 45℃菌丝和孢子均不能继续生长和萌发 (表 3)。
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表 3 温度对菌落生长和孢子萌发的影响
Table 3 Effect of temperature on mycelial growth and spore germination
温度
(℃)
菌丝生长速度 (cm)
Mycelial growth
差异显著性
Significance of difference
孢子萌发数 (个)
Spore germination
差异显著性
Significance of difference
5℃ 0. 00 g 1 ± 0. 58 gf
10℃ 0. 00 g 3. 67 ± 0. 33 ef
15℃ 1. 38 ± 0. 27 e 5. 67 ± 1. 20 e
20℃ 2. 37 ± 0. 31 d 5. 67 ± 1. 20 e
25℃ 3. 35 ± 0. 10 c 18 ± 0. 58 d
28℃ 4. 72 ± 0. 14 a 58. 33 ± 0. 88 a
30℃ 4. 13 ± 0. 15 b 6. 67 ± 0. 67 e
32℃ 3. 55 ± 0. 09 c 39. 33 ± 0. 67 b
35℃ 3. 22 ± 0. 04 c 21. 67 ± 1. 86 c
40℃ 0. 77 ± 0. 04 f 0. 67 ± 0. 67 gf
45℃ 0. 00 g 0. 00 g
2. 5 不同 pH对 CX098 菌落生长和孢子萌发的影响
试验结果表明，该菌生长最适宜的 pH为 pH6. 0 － 7. 0，与其他处理在 5%水平存在显著差异。
孢子适宜在微酸性环境下萌发，pH 6. 0 时孢子萌发率最高，pH 6. 0 时的孢子萌发率与 pH 5. 0、
pH 7. 0、pH 8. 0 时孢子萌发率在 5%水平存在显著差异，与其他处理达到极显著差异 (表 4)。
表 4 pH对菌丝生长和孢子萌发的影响
Table 4 Effect of pH on mycelial growth and spore germination
pH值
pH value
菌丝生长速度 (cm)
Mycelial growth
差异显著性
Significance of difference
孢子萌发数 (个)
Spore germination
差异显著性
Significance of difference
2. 5 3. 52 ± 0. 09 c 6. 33 ± 0. 67 g
3 3. 85 ± 0. 09 bc 10. 67 ± 0. 67 e
4 4. 45 ± 0. 09 abc 16 ± 1 ef
5 4. 7 ± 0. 32 ab 22 ± 1. 15 ab
6 4. 97 ± 0. 36 a 28. 33 ± 1. 67 a
7 5. 17 ± 0. 22 a 19 ± 0. 58 c
8 4. 32 ± 0. 13 abc 13. 67 ± 0. 67 d
9 4. 43 ± 0. 3 abc 9. 67 ± 0. 33 ef
10 4. 23 ± 0. 17 abc 7. 33 ± 0. 33 gf
10. 9 4. 15 ± 0. 12 abc 3. 33 ± 0. 33 h
2. 6 不同杀菌剂对 CX098 菌株的抑制作用
在供试的 5 种广谱杀菌剂处理条件下，CX098 菌株的生长均受到抑制。抑制效果为扑海因 ＞
代森锰锌 ＞百菌清 ＞恶霜锰锌 ＞敌克松。扑海因、代森锰锌的抑菌效果在 5%差异水平与恶霜锰
锌、百菌清达到差异显著，与敌克松达到极显著差异 (图 5)。
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Fig. 5 Effect of different getrmicides on mycelial growth
3. 结论
真菌的系统发育和分类鉴定研究中广泛应用核酸序列及其结构基因的分析［18］。本文中薏苡叶
片黑斑病病原菌的形态学特征观察与分子生物学分析结果相互吻合为链格孢属 Alternaria sp. 。供
试的所有碳源和氮源均能被该菌利用，光暗交替利于该菌的菌丝生长，最高温度为 28℃;光照和
微酸环境利于分生孢子萌发，扑海因和代森锰锌对其生长有明显的抑制作用，可选用此类药剂防
治由链格孢引起的薏苡黑斑病。
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北农林科技大学学报 (自然科学版) ，2003，31 (6) :187—192.
(责任编辑 徐成东)
Study on Pathogen Identification and Biological Characterstics of
the Leaf Spot of Coix lachryma － jobi
LI Xuelin，YANG Haiyan ＆ CHEN Huahong
(Department of Chemistry and Life Science，Chuxiong Normal University，Chuxiong，675000，Yunnan Province)
Abstract:Isolation and identification one fungal strains of Pathogen of leaf spot of Coix lachryma － jobi，
noted for CX098． Combined traditional morphologic observation with modern molecular biological tech-
niques，study on it，s culture traits and biological characterstical． The results showed that: (1)The pathogen
is Pithomyces Berkeley and Broome． (2)The best carbon and nitrogen source for CX098 growth were dex-
trose and peptone respectively． The approprate temperature for CX098 growth and spore germination were
28℃ respectively． Light and dark alternative was helpful to mycelial growth，photoperriod has little influence
on spore germination ． In laboratory test chlorothalonil as the best getrmicides on the tested．
Key words:Coix lachryma － jobi;leaf spot;pathogen identification;biological characterstics
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