全 文 ：生物物理学报 第 n卷 第 4期
AB T C A IOP E压 S IC A SP q C A
1竺廷巧年 2 1月
V谊 h 11沁 . 4D 伙 . 1臾巧
竹红菌甲素 ( H A)光敏致突作用的研究 *
许娜飞 曹恩华 * *李景福
(中国科学院生物物理研究所 北京 1的 10 1)
摘 要
以 中国苍鼠卵巢成纤维细胞 ( H C O)为材料 , 通过 HA光敏诱变 , 乌本武 ( 。呱加运 ) 筛选研究
了竹红菌甲素光敏反应对细胞 aN 十从 + A l r 酶基因的诱变致突作用 。 结果表明 H A 光敏反应可造成细
胞 aN + 爪十 A T P 酶基因点 突变 , 并具有遗传穗定性 。 另外通过浏 定光敏反应细胞脂质过氧化程度及其
产物与细胞 D N A 形成的荧光产物表明脂质过氧化在细胞 D N A 的损伤突变过程中 ,起着重要的作用 。
关键词 : 竹红菌甲素 光敏反应 C HO 细胞 基因突变 脂质过氧化
竹红菌甲素 (H A )是具有光敏活性的菲醒类衍生物 , 临床上治疗某些皮肤顽疾有显著疗
效 , 是一种新型的光敏剂及光疗药物 。 以前的实验已证明 , H A 经细胞吸收后 , 主要滞留在细
胞膜及胞浆中 ”` , 其光敏作用可引起膜蛋白交联 z31[ , 膜脂过氧化阅 , 膜流动性改变阎 等 。 本文在
上述研究的基础上 , 着重于 H A 光敏化作用于细胞 D N A 致突作用 的研究 , 为进一步 了解 H A
光敏损伤作用的分子机理提供实验依据 。
Na
+胜 + A T P 酶基因是一种必需基因 , Na 十床十A T P 酶在维持细胞内外 Na + 和 K 十 梯度及
细胞正常的生命活动方面起着极其重要的作用 。 此酶可被 。 ua ba in (简写 o ua )所抑制 , 而引起
死亡 。 研究发现 , 当此基因中编码 Na 十爪+ A T P 酶 “ 亚基上 o ua 结合位点的序列 发生点 突变
时 , 此酶功能可不被 o ua 抑制 , 因而使用 o ua 筛选时 , 正常细胞因 Na +爪十 A T P 酶受抑制而被
杀死 , 而只有编码 “ 亚基的序列发生点突变的细胞得 以生存 。
C H O 细胞可通过不同的物理和化学手段使其同步 , 且在适宜的培养条件下 , 克隆效率大
于 80 % , 并具有稳定而易于辨认的核型 , 这些使得 C H O 细胞成为研究基因突变及药物毒性 的
良好材料 网 。 本文选用 C HO , 通过 H A 光敏诱变及 o ua 选择性培养液的筛选 , 观察了 H A 光敏
反应对 Na +爪 + A T P 酶基因的致突作用 。
1 材料与方法
L l 试剂
竹红菌甲素由云南微生物所提供 , 纯化后溶于 二 甲基亚矾 , 配成 5 0gnI 阿 原液备用 。
o ua b a in 为 S IG M A 产品 , D T T 为 SE R V A 产品 , 其他试剂均为国产分析纯 。
1.2 方法
1
.
2
.
1 细胞培养
实验细胞选用 C H O 细胞 , 在 RP M I 164 0 培养液中
,
37 ℃ , 5% CO : 培养箱中培养 。 培养
液中含有青链霉素各 10 OU n lst 阿 , 谷氨酞胺 30 0 In g问 , 小牛血清浓度 10 % 。
* 国家自然科学基金资助项目 , * 通讯联系人 。
第 4期 竹红菌甲素 (H A )光敏致突作用的研究
1
.
2. 2 细胞活存分析
接种处于指数生长期的 C H O细胞 , 贴壁 h6 后 , 加人 H A, H A的终浓度依次为 0, 5, 10 ,20 ,40 ,
60 滩ulr/ , 此时培液 中小牛血清的浓度是 3% , 1h8 后 , 各组换 P sB , 加 H A 组进行照光处理 , 光源
为 220 V , r0 0 w 碘钨灯 , 照射强度为 60 L ux , 时间为 1分钟 。 对照组及经 H A 光照处理组细胞
按一定数目接种于含小牛血清 30 % 的培养液中 , 培养 or 天左右 (H A 处理组需避光培养 ) , 活
存细胞长成克隆 , 用 甲醇固定 , G lems a 染色
, 计数形成的克隆数 , 以细胞活存分数的对数为纵
坐标 , H A 的剂量为横坐标 , 绘制活存曲线 。
1
.
.2 3 H A 的诱变和突变细胞的筛选
据 C H O 细胞的活存曲线选取 5种 H A 浓度分别为 O, 5 , 10 , 20 , 40 雌阿 。 诱变条件分为 H A
照光诱变及 H A 避光诱变 , 每种诱变都相应按 5 种 H A 浓度接种细胞 , 吸收 H A 1h8 后 , H A 照
光组同上进行照光处理 , 之后各组细胞在含 30 % 的小牛血清培养液中继续培养 10 天左右 , 使
基因损伤固定 . 然后进行筛选 , 以含 1
~ 呱
o
ua 的选择性培养液作为筛选液 , 接种细胞继
续培养 , 4 周后 , 对 o ua 具抗性 的细胞长成克隆 , 计数每组形成的克隆数 , 计算出突变率 。
突变率 二 突变细胞克隆数筛选时接种细胞数 x 1 00%
1
.
.2 4 突变细胞的酶学鉴定
采用定磷法测定对照组及筛选的突变细胞的 Na +形 + A T P 酶的活性 闭 。 收集细胞 ; 以 PBS
洗 3 次 , 加人超声存碎缓冲液 ( 50 n 刀刀。 1压 T irS 一 H C I , 1
~
l压 ED T A , 1
~
1瓜 D l丁 , p H S .0) ,
在 30W , 5 秒振荡 , 10 秒间歇的条件下超声 1 分钟 , 细胞全部破碎 。 4 ℃ , 12 , 000 r mj/ n 离心
2伍in n , 收集膜成份 。 膜蛋白浓度按 B la d fo dr 法测定阁 , 酶活性按文献 7[] 测定 , 酶活性以单位时
间内每 grn 蛋白在加人和不加人 o ua 时分解 A T P 所产生的磷酸量 的差值来表示 。
1
.
2
.
5 H A 光照处理组细胞脂质过氧化程度的检测
选取 6种 H A 浓度 , 依次为 0, 5, 10 ,20 ,40 , 60 雌阿 , 同方法 2 进行细胞的 H A 光照处理 , 然后
收集细胞 , 并将各组细胞浓度都一致为 3 x 10 6lnI/
。
M D A 测定按文献 9[] 方法 , 各组细胞悬液
取 20 风 加人 1 . 8司 CT A 一珊A 一 H CI 液 .(0 9 2m o l瓜 三氯醋酸 , .0 02 6lr lo l压 硫代 巴 比妥酸 ,
.0 2 5onI 狐盐酸 ) , 于 10 ℃ 反应 30 分钟 , 冷却后 , 以 T C A 一BT A 一 H C I液为空 白 , 测定 5犯unI
处的吸光度值 (A 5 32) 。
1
.
.2 6 H A 光照处理 C H O 细胞脂质过氧化产物与细胞 D N A 形成荧光物质的观察
两组 H A 浓度分别为 40 , 60 雌问 的光照处理 C H O 细胞 , 采用酚 一 氯仿 (卜l) 法抽提 , 乙醇
沉淀 D N A , 用 R卜恤s e 去除 R N A , 用蛋白酶 K 去除蛋白质 , D N A 沉淀溶于 T irS 一 H Q 缓冲液
中 , 其中 A Z枷 /A~ > 1
.
85
, 在 H iat hic 850 荧光分光光度计上检测脂质过氧化荧光产物 。
2 结果与讨论
.2 1 细胞活存分析结果
图 1是 C H O 细胞的活存曲线 , 从图中可以看 出 , 随着 H A 浓度的递增 , 活存细胞随之减
少 , 当 H A 浓度为 20 咫阿 时 , 细胞的存活率约为对照组的一半 。 细胞的存活曲线表示 出细胞
暴露于不 同程度的损伤因素时 , 细胞的损伤程度 。 可 以明显看出细胞的损伤程度与 H A 的光
生 物 物 理 学 报 1卯 5年
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敏作用强度呈正相关 。
. 2 2细胞基因突变率与 HA的 t效关系
本实验中得到的 C HO细胞 N a十形 +A P T酶
基因的 自发突变率为. 0 7x 0l一 6, 与 众耐哪 y 和
oS p砂 报道的 .0 5一 3 X I护接近 。 H A 照光诱变
各组及不照光诱变各组的 Na +爪 + A T P 酶基 因的
突变率见表 1 , 由表 1 可知 , H A 照光诱变组中 ,
当 H A 的浓度低于 20 咫阿 时 , 突变率随着 H A
浓度的增加而变大 , 而 当 H A 的浓度增至 40 咫阿
时 , 突变率反而下降 , 这从 C H O 细胞的存活曲线
可得到解释 , 在 40 雌阿 的 H A 浓度下 , C H O 细
胞只有 16 . 5% 存活下来 , 大部分 已死亡 , 说明该
剂量对 C HO 细胞的损伤是致死性 的 , 而只有少
量未造成致死性损伤的 C H O 细胞生存下来 , 因
而造成了这种高剂量 , 低突变率的结果 。
经 H A 处理未光照组细胞 , 其 Na +爪 + A l …P 酶基因突变率结果亦见表 1 , 表中数据表明 , 随
着 H A 浓度的增加 , 突变率随之增加 。 但在相同的 H A 浓度下 , 光照组的突变率则大大高于不
照光组 。 这一结果表明 H A 的光敏化作用对细胞 D N A 具明显的致突作用 。
.2 3 C H O 突变细胞的 Na +瓜十A T P 酶飞b翻匕 1 11七 几以协 tio n 伪月送钊 c1 此 of Na 十派十 A l ,玲 s e
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活性分析
表 2 是对照组 C H O 以及 H A 光照
诱 变 o ua 筛 选 的 C H O 突 变 细 胞
Na
十形 + A T P 酶活性测定结果 。 对照组
Na
+瓜 + A T P 酶活力 为 52 . 4 n 江 10 1 iP . mg
P or et ln
一 1.
~
一 1, C H O 突 变 细 胞
Na
+胜+ A T p 酶 活力是 26 . 6 n 庄幻1 iP . gnI
Por et in
一 ` .
m in
一 。` 突变细胞酶活性受 。 ua
抑制程度大幅度下降 , 只是对照组受抑
制程度的 52 . 1% , 说明筛选得到的 C HO
细 胞 是 Na +从 + A T P 酶 基 因 突 变
细胞 。
另外 , 获得的该突变细胞在没有 o au 的 R P M I 164 0 培养基中 , 经两个月近 20 代的传代
培养后 , 再进行 Na +派 + A T p 酶活性测定 , 测得酶活结果为 14 .8~ 1 iP mg P or et i
n 一 `
~
一 ` , 酶活
受 。 ua 抑制程度为对照组的 28 % 。 这一结果表明经 H A 光照诱变的 C H O Na +爪+ A Tp 酶基因
突变细胞具有遗传稳定性 .
2 .4 不同浓度 H A 光照处理 C H O 细胞脂质过叙化程度检测
由于甲素经细胞吸收后主要分布于细胞膜和胞浆中 , 引起基因突变的原 因可能与脂质过
第 4期 竹红菌甲素 (H A )光敏致突作用的研究
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H A 40咫 nl/I + L吵 t 71 2 氧化有关 。 因此 , 我们对其光敏作用 与
H A 断心铂l十 L斌比 37 10 膜脂过氧化 的关系进行了分析测 定 .
一— 图 2 就是不 同浓度 H A 光照处理 细胞脂质过氧化程度测定结果 , 数据表明等量接种的 C HO 细胞经 H A 处理并光照后 , 脂质过氧化程度随 H A 浓度的加大即光敏作用的增强而加深 。
2 5
HA
一光敏作用后细胞脂质过氧化产物与细胞
~
形成荧光物质的观察
上面的实验结果表明 H A 光敏作用强度与细胞的脂质过氧化程度呈正相关 . 脂质过氧化
过程是相 当复杂的过程 , 它是脂中不饱和脂肪酸氧化降解的链反应过程 , 可产生一系列 的自
由基如咖 . , oL . 和 L . 等以及非 自由基小分子产物如丙二醛等 , 这些产物具有相 当的反应活性 , 特别是脂 自由基具有疏水性强及寿命较长的特点 , 在细胞内可扩散较长距离 , 是攻击细
胞 D N A 造成细胞 D N A 损伤的重要因素 。 我们实验室关于脂质过氧化与 D N A 的相互作用
作了一系列的工作 10[, ` l,lq , 并且实验结果均表明脂质过氧化对 D N A 具有 明显的损伤作用 。 在
此基础上 , 本文将对照组及两种浓度 H A (4 0, 60脂八d )处理的 C H O 细胞的 D N A提取出来 , 进
行荧光测定 , 以相对荧光强度表示荧光产物的产量 , 结果见表 3 。 荧光扫描发现经 H A 处理的
细胞存在两种荧光物质即荧光产物 1及荧光产物 2 , 并且高浓度 H A 组 , 其荧光物质产率较
高 , 其中以荧光产 物 1 的生成较多 。 荧光产物 1 的激发波长 exA 是 32 0n m , 发射波长 福 是
41 0n m
, 荧光产物 2 的激发波长 几是 39 0n nIL , 发射波长 几是 46 On m , 其中已知荧光产物 2 是由
脂质过氧化产物 M D A 与 D N A 形成的希夫氏碱复合物 , 荧光产物 1 则是由分子量大于 M D A
的拨基化合物与 D N A 形成的复合物 , 这一结果表明 , 脂质过氧化过程产生的多种小分子拨基
化合物参与了对细胞 D N A 的修饰 , 导致 D N A 荧光复合物的形成 。 在先前的工作中 , 我们已
证明在 妞 花生四烯酸标记的细胞中 , 脂质过氧化所产生的脂类 自由基等活性产物 与 D N A 形
成含脂的 D N A 加成物 13[] 。 并观察到 H A 光敏反应可引起细胞 D N A 链断裂和碱基损伤.1I 。 因
此 , 本实验结果进一步证实光敏作用导致的细胞膜脂质过氧化可能是造成细胞 Na 十形十A T p
酶基因突变的原因之一 。
印 8 生 物 物 理 学 报 19 5年
综上所述 , 各项实验结果证实甲素光敏反应对体外培养细胞具有诱变致突作用 , 能够引起
细胞 D N A 突变 , 并且此突变具有遗传稳定性 。 由于 H A 主要滞留在细胞膜中 , 直接作用于膜
中不饱和脂肪酸产生脂质过氧化 , H A 光敏反应荧光产物等分析结果提示 细胞脂质过氧化过
程所产生的活性产物可能是造成细胞基因突变 的重要原因之一 。
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本文于 1卯 5 年 7月 21 日收 。