全 文 ：植物盐胁迫应答蛋白质组学研究的技术策略*
张摇 恒1,2 摇 戴绍军1,2**
( 1东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心, 哈尔滨 150040;2东北油田盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室, 哈尔滨
150040)
摘摇 要摇 土壤盐渍化是限制植物生长和分布的关键因素之一.揭示植物响应盐胁迫的分子机
理是借助分子生物学手段提高植物耐盐性的基础,也是当前植物生理与分子生态学研究的热
点问题.高通量的蛋白质组学技术体系包括双向电泳技术、蓝色自然胶电泳技术、双向荧光差
异凝胶电泳技术、液相色谱技术,以及各种生物质谱技术,已经被广泛应用于植物应答盐胁迫
研究,为解析植物耐盐分子机制提供了重要信息.本文综述了应用于植物盐胁迫响应蛋白质
组学研究的技术策略.
关键词摇 植物摇 蛋白质组学摇 盐胁迫摇 技术策略
文章编号摇 1001-9332(2011)08-2201-10摇 中图分类号摇 Q94摇 文献标识码摇 A
Technical strategies in the research of plant salt鄄responsive proteomics: A review. ZHANG
Heng1,2, DAI Shao鄄jun1,2 ( 1 Alkali Soil Natural Environmental Science Center, Northeast Forestry
University, Harbin 150040, China; 2Ministry of Education Key Laboratory of Saline鄄alkali Vegeta鄄
tion Ecology Restoration in Oil Field, Harbin 150040, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2011,22(8):
2201-2210.
Abstract: Soil salinization is one of the key factors limiting plant growth and distribution. To explore
plant molecular salt鄄responsive mechanisms is the basis of enhancing plant salt tolerance in virtue of
molecular biological techniques, and also, the hotspot of plant physiology and molecular ecology.
High throughput proteomics approaches include two鄄dimensional electrophoresis ( 2鄄DE), blue鄄
native / SDS鄄PAGE (BN / SDS鄄PAGE), two鄄dimensional fluorescence difference gel electrophoresis
(2D DIGE), liquid chromatography (LC), and various mass spectrometry (MS) techniques, be鄄
ing widely applied in the research of plant salt鄄response and supplied important information for un鄄
derstanding plant molecular salt鄄tolerant mechanisms. In this paper, a review was made on the
technical strategies applied in the research of plant salt鄄responsive proteomics.
Key words: plant; proteomics; salt stress; technical strategy.
*国家自然科学基金项目(31071194)、黑龙江省杰出青年科学基金
项目(JC201011)、中央高校基本科研业务费专项(DL09DA03)和国
家博士后科学基金面上项目(第 48 批)资助.
**通讯作者. E鄄mail: daishaojun@ hotmail. com
2011鄄01鄄30 收稿,2011鄄05鄄16 接受.
摇 摇 土壤盐渍化严重地影响植物的生长发育和区域
分布[1] .一直以来,人们利用细胞学、形态学、生理
生态学和分子生物学等研究方法对植物盐胁迫应答
机制进行了分析,发现植物能够通过控制盐离子摄
入与外排、区隔化体内离子、合成渗透保护物质、增
强抗氧化酶活性等方式响应盐胁迫[2] . 同时,利用
基因克隆与转化技术,分析了部分盐胁迫应答基因
的功能[3-4],并利用基因芯片技术分析了拟南芥
(Arabidopsis thaliana) [5]、水稻(Oryza sativa) [6-8]和
盐芥(Thellungiella halophila) [9-10]等植物盐胁迫应
答转录组的变化特征,建立了盐胁迫应答相关的
cDNA文库和 EST 数据库. 近年来不断完善的蛋白
组学技术为深入分析植物盐胁迫应答的代谢和调控
机制提供了高通量的技术平台,利用此平台中的双
向电泳技术、凝胶染色技术、液相色谱技术、荧光 /同
位素标记技术,以及生物质谱技术能够系统地分析
植物体各器官、组织、细胞和亚细胞结构中盐胁迫应
答蛋白质组的变化,确定每种蛋白质的表达丰度、修
饰状态,以及蛋白质复合体组成等特征[11] . 此平台
不断被应用于植物盐胁迫应答蛋白质组学研
应 用 生 态 学 报摇 2011 年 8 月摇 第 22 卷摇 第 8 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Aug. 2011,22(8): 2201-2210
究[12-13] .然而,由于研究对象(包括物种、器官 /组
织、细胞和细胞器)的不同,选择何种研究策略更有
利于盐胁迫应答蛋白质组学研究是目前值得思考的
问题.本文通过综述近年来植物盐胁迫响应蛋白质
组学研究进展,着重分析了植物材料选择、蛋白质样
品制备与分离、蛋白质鉴定与生物信息学分析等的
技术策略.
1摇 研究对象选择的策略
1郾 1摇 已知基因组背景的模式植物
模式植物拟南芥与水稻的基因组背景清楚,基
因与蛋白质数据库信息量大,并且已经有了很好的
分子生物学研究基础,对其进行盐胁迫应答蛋白质
组学分析,可以结合转录组学和分子生物学研究结
果深入分析植物盐胁迫应答的调控机制. 目前人们
已经分析了拟南芥和水稻叶片[14-18]、根[19-23]、地上
部分[24-25]、花序[26]、悬浮培养细胞[27]、质外体[28]、
微粒体膜[14]和质膜[29-30]等器官 /细胞 /亚细胞结构
中 563 种盐胁迫应答蛋白质的表达模式变化(图 1
和表 1),发现参与碳和能量代谢(24郾 7% )、基础代
谢(16郾 9% )和胁迫防御(15郾 6% )等过程的蛋白质
在拟南芥和水稻盐胁迫应答过程中发挥了重要的作
用,并且不同器官 /细胞 /亚细胞结构的盐胁迫应答
具有特异性,如地上部分 /光合组织和悬浮培养细胞
中参与光合作用、碳和能量代谢、基础代谢过程的蛋
白质表达模式变化显著;根可以通过调控信号转导
和离子转运相关蛋白质感知 /传递盐胁迫信号,维持
离子平衡,并通过调节抗氧化酶以及碳和能量代谢
相关蛋白质表达提高植物抗胁迫能力,使其维持相
对正常的生长代谢活动;生殖器官(花序)通过改变
参与渗透胁迫调节、转录调控、蛋白质加工和活性氧
类物质(reactive oxygen species,ROS)清除等过程的
图 1摇 植物盐胁迫蛋白质组学研究技术路线
Fig. 1摇 Research strategy of salt鄄responsive proteomics in plants.
2022 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 22 卷
蛋白质表达模式应答盐胁迫;质膜和质外体中参与
维持细胞骨架稳定、物质 /离子转运、信号转导和
ROS清除过程的蛋白质在植物盐胁迫应答中具有
重要意义.
1郾 2摇 有价值的农作物与经济作物
农作物和经济作物多为甜土植物,土壤盐渍化
会导致作物严重减产[3] . 一直以来,人们采用种间
杂交、驯化筛选、诱变和标记辅助筛选等育种方法,
以及转基因策略来提高作物耐盐性[31],但是并不能
全面揭示作物的盐胁迫应答机制. 蛋白质组学研究
为深入分析作物的耐盐机制提供了丰富信息. 通过
对多种粮食作物[如小麦(Triticum aestivum) [32-35]、
玉米(Zea mays) [36-37]、大麦(Hordeum vulgare) [38]、
粟(Setaria italica) [39]和大豆(Glycine max) [40]]与经
济作物[番茄( Solanum lycopersicum) [41-42]、马铃薯
(Solanum tuberosum) [43]、花生(Arachis hypogaea) [44]、
豌豆 ( Pisum sativum ) [45]、 烟 草 ( Nicotiana taba鄄
cum) [46-47]和葡萄(Vitis vinifera) [48-49] ]的盐胁迫应
答蛋白质组动态变化进行分析(图 1 和表 1),结果
发现,这些作物与水稻和拟南芥相似,参与光合作
用、碳和能量代谢、胁迫防御、基础代谢和信号转导
等过程的蛋白质在盐胁迫应答过程中表达模式变化
明显.
1郾 3摇 盐生植物
与甜土植物相比,盐生植物具有特异的耐盐机
制和结构,能够在超过 200 mmol·L-1 NaCl 的环境
中完成生活史[3] . 形态学、生理学和分子生物学研
究表明,盐生植物不仅能够利用盐腺和盐囊泡等结
构增强盐离子的外排能力,还可以通过有效调节离
子转运、ROS清除和渗透物质合成等过程中相关基
因 /蛋白质的表达来适应盐胁迫环境[3] . 对木榄
(Bruguiera gymnorhiza) [50]、碱蓬 ( Suaeda aegyptia鄄
ca) [51]、盐角草(Salicornia europaea) [52]、盐芥[17]、小
立碗藓(Physcomitrella patens) [53]和杜氏盐藻(Du鄄
naliella salina) [54-55] 6 种盐生植物进行蛋白质组分
析,发现了205种盐胁迫应答蛋白质(图1和表1),表
明盐生植物中既含有与甜土植物相同(似)的抗逆基
因 /蛋白质,也具有自己独特的盐胁迫应答机制.
1郾 4摇 细胞 /亚细胞结构
各种细胞 /亚细胞结构,如悬浮培养细胞、愈伤
组织细胞、单细胞藻类、叶绿体、质膜和质外体等,应
对盐胁迫的蛋白质组也发生动态变化.植物细胞 /亚
细胞盐胁迫响应蛋白质组学研究不仅可以高通量地
揭示细胞 /亚细胞结构的盐胁迫响应特异机制[56],
而且有助于克服传统蛋白质组学研究方法中所存在
的一些障碍,提高低丰度蛋白质、小分子量蛋白质和
特殊性质蛋白质的检测效率. 人们利用蛋白质组学
技术分析了拟南芥悬浮培养细胞[16]、花生愈伤组织
表 1摇 植物盐胁迫响应蛋白质组学研究对象与方法
Table 1摇 Objects and strategies in plant salt鄄responsive proteomics studies
物种
Species
取材部位
Tissue
样品制备
Protein
preparation
样品分离
Protein separation
等电聚焦 IEF
IPG胶条
长度 Length
(cm)
pH
SDS鄄PAGE
浓度
Concentration
(% )
染色方法
Staining
鉴定与生物信息学分析
Identification and bioinformatic analysis
质谱
Mass spectrometry
数据库
Database
文献
Reference
拟南芥 A. thaliana 根 TCA /丙酮 24 3 ~ 10 NL 12. 5 CBB LC鄄MS / MS NCBInr [14]
幼苗 13 4 ~ 7 12 MALDI鄄TOF鄄MS [15]
悬浮细胞 TCA 18 4 ~ 7 12 DIGE, 银染 MALDI鄄TOF鄄MS [16]
拟南芥 A. thaliana、
盐芥 T. halophila
叶片
微粒体膜
酚 /乙酸铵鄄甲醇
丙酮
24 4 ~ 7 12郾 5 CBB MALDI鄄TOF / TOF鄄MS
LC鄄MS / MS
NCBInr [17]
水稻 O. sativa 花序 TCA /丙酮 18 4 ~ 7 12 银染 MALDI鄄TOF鄄MS,
MALDI鄄TOF / TOF鄄MS
NCBInr [21]
叶片 裂解液 12 3. 5 ~ 10,
5 ~ 8
15 (分离)+
5(浓缩)
CBB nESI鄄LC鄄MS / MS Swiss鄄Prot,
NCBI EST
[22]
叶片 酚 /乙酸铵鄄甲醇 17 3 ~ 10 12 CBB MALDI鄄TOF鄄MS [27]
叶鞘、盾片、根 TCA 11 3. 5 ~ 10,
6 ~ 10
15(分离)+
5(浓缩)
CBB Edman降解 Swiss鄄Prot, PIR,
GenPept, PDB
[18]
叶片核纤层 TCA /丙酮 24 4 ~ 7 12. 5 CBB MALDI鄄TOF / TOF鄄MS NCBInr [25]
根 TCA /丙酮 18 4 ~ 7 12 CBB MALDI鄄TOF / TOF鄄MS,
ESI鄄Q / TOF鄄MS
NCBI, Swiss鄄Prot,
EMBL, PIR
[26]
根 TCA 13 3. 5 ~ 10,
5 ~ 8
15(分离)+
(5浓缩)
CBB MALDI鄄TOF鄄MS NCBInr [23]
根 酚 /乙酸铵鄄甲醇 24 3 ~ 10 NL 12(分离)+
4(浓缩)
SYPRO Ruby,
Pro鄄Q Diamond
MALDI鄄TOF / TOF鄄MS NCBInr [20]
30228 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 张摇 恒等: 植物盐胁迫应答蛋白质组学研究的技术策略摇 摇 摇 摇 摇 摇
续表 1摇
Table 1摇
物种
Species
取材部位
Tissue
样品制备
Protein
preparation
样品分离
Protein separation
等电聚焦 IEF
IPG胶条
长度 Length
(cm)
pH
SDS鄄PAGE
浓度
Concentration
(% )
染色方法
Staining
鉴定与生物信息学分析
Identification and bioinformatic analysis
质谱
Mass spectrometry
数据库
Database
文献
Reference
根 TCA /丙酮 13 4 ~ 7 12 银染 MALDI鄄TOF / TOF鄄MS NCBInr [29]
根质膜 丙酮沉淀 18 4 ~ 7 11. 5 银染 MALDI NCBInr [24]
根质膜 裂解液 24 4 ~ 7 12 CBB MALDI鄄TOF鄄MS,
MALDI鄄TOF / TOF鄄MS
NCBInr [19]
根质外体 Tris鄄HCl缓冲液 13 3 ~ 10 12. 5 CBB MALDI鄄TOF鄄MS [30]
地上部分 TCA /丙酮 24 4 ~ 7 12. 5 CBB MALDI鄄TOF鄄MS NCBInr [28]
小麦 T. aestivum 叶片 TCA /丙酮 24 4 ~ 7 12. 5 CBB MALDI鄄TOF鄄MS MSDB, NCBInr [32]
叶片 TCA /丙酮 3 ~ 10 CBB MALDI鄄TOF鄄MS [35]
根 TCA /丙酮 17 5 ~ 8 10,12. 5 CBB, 银染 MALDI鄄TOF鄄MS,
MALDI鄄TOF / TOF鄄MS
NCBInr, MSDB,
Swiss鄄Prot
[34]
根、叶片 TCA /丙酮 17 5 ~ 8 10 银染 MALDI鄄TOF / TOF鄄MS NCBInr, MSDB,
Swiss鄄Prot
[33]
大麦 H. vulgare 根 TCA /丙酮 13 3 ~ 10 11. 25 CBB MALDI鄄TOF鄄MS,
nanoLC鄄ESI鄄Q / TOF鄄MS
TIGR [38]
玉米 Z. mays 叶绿体 TCA /丙酮 18 3 ~ 10 12 CBB MALDI鄄TOF鄄MS PPDB [36]
根, 地上部分 DTT鄄TCA /丙酮 11 4 ~ 7 12. 5 CBB MALDI鄄TOF鄄MS [37]
粟 S. italica 幼苗 TCA /丙酮 7 3 ~ 10 12. 5 银染 MALDI鄄TOF鄄MS NCBInr [39]
大豆 G. max 胚轴、根 TCA /丙酮 11 3. 5 ~ 10,
5 ~ 8
15(分离)+
5(浓缩)
CBB Edman 降解,
ESI鄄Q / TOF鄄MS
Swiss鄄Prot, PIR,
GenPept, PDB
[40]
葡萄 V. vinifera 芽尖 TCA /丙酮 11 4 ~ 7 12. 5 CBB MALDI鄄TOF / TOF鄄MS NCBInr, TIGR EST [49]
葡萄 V. vinifera 叶片,茎,根 酚 /乙酸铵鄄甲醇 3 / 10, 4 / 6,
5 / 7, 6 / 8
银染 Edman降解 NCBI [48]
豌豆 P. sativum 根 TCA /丙酮 7 4 ~ 7 13 CBB, 银染 ESI鄄Q / TOF鄄MS NCBInr [45]
花生 A. hypogaea 愈伤细胞 Bio Rad试剂盒 4 ~ 7 CBB, 银染,
Pro鄄Q Diamond
ESI鄄Q / TOF鄄MS [44]
烟草 N. tabacum 叶片质外体 丙酮 7 3 ~ 10 12 CBB LC鄄MS / MS NCBInr [46]
叶片 裂解液 3 ~ 10,
5 ~ 8
15(分离)+
5(浓缩)
CBB Edman降解,
MALDI鄄TOF鄄MS
Swiss鄄Prot, PIR,
GenPept, PDB
[47]
番茄 L. esculentum 叶片、根 TCA /丙酮 24 4 ~ 7 12. 5 DIGE, 银染 [42]
胚轴,胚根 酚抽提 13 4 ~ 7 12. 5 CBB, 银染 LC鄄ESI鄄 Q 鄄Trap鄄MS NCBInr [41]
马铃薯 S. tuberosum 地上部分、根 TCA 11 3. 5 ~ 10,
5 ~ 8
15(分离)+
5(浓缩)
CBB Edman降解 Swiss鄄Prot, PIR,
GenPept , PDB
[43]
盐角草 S. europaea 地上部分 BPP 24 4 ~ 7 12. 5 CBB MALDI鄄TOF / TOF鄄MS NCBInr [52]
碱蓬 S. aegyptiaca 叶片 TCA /丙酮 18 4 ~ 7 12. 5 CBB LC鄄MS / MS NCBI, EMBL [51]
木榄 B. gymnorhiza 根、叶片 Bio Rad试剂盒 7. 5 3 ~ 10 5-20 SYPRO Ruby LC鄄MS / MS NCBInr [50]
小立碗藓 P. patens 配子托 酚抽提 13 4 ~ 7 15 CBB LC鄄MS / MS NCBI [53]
杜氏盐藻 D. salina 悬浮细胞 酚 /乙酸铵鄄甲醇 18 3 ~ 10 NL 11 CBB MALDI鄄TOF鄄MS,
nanoLC鄄MS / MS
NCBI [55]
质膜 裂解液 BN / PAGE 6 ~ 18 CBB nanoLC鄄MS / MS MSDB,NCBI [54]
BN:蓝色自然胶 Blue native; BPP:硼砂鄄聚乙烯吡咯烷酮鄄酚抽提法 Borax鄄PVPP鄄Phe; CBB:考马斯亮蓝染色 Coomassie brilliant blue; DIGE:荧光差异
凝胶电泳 Difference gel electrophoresis; EMBL:欧洲分子生物学数据库 European molecular biology data library; ESI:电喷雾电离 Electrospray
ionization; IEF:等点聚焦 Isoelectric focusing; EST:表达序列标签数据库 Expressed sequence tag; IPG:固相 pH 梯度 Immobilized pH gradients;
iTRAQ:同位素标记绝对和相对定量 Isobaric tag for absolute abd relative quantification; LC:液相色谱 Liquid chromatography; MALDI:基质辅助激光解
吸附电离 Matrix assisted laser desorption ionization; MS:质谱Mass spectrometry; MSDB:伦敦皇家学院蛋白质组学数据库 Proteomics database of Impe鄄
rial College London; NCBInr:美国国立生物技术信息中心非单一蛋白质数据库 National Center for Biotechnology Information non identical; NL:非线性
Nonlinear; PDB:美国国家实验室蛋白质结构数据库 Protein data bank of America National Laboratory; PIR:蛋白质信息资源数据库 Protein information
resource; PPDB:植物蛋白质组数据库 Plant proteomics data bank; Q:四级杆 Quadrupole; SDS鄄PAGE:十二烷基硫酸钠鄄聚丙烯酰胺凝胶电泳 Sodium
dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis; Swiss鄄Prot:瑞士蛋白质序列数据库 Protein data bank of Swiss; TCA:三氯乙酸 Trichloroacetic acid;
TIGR:美国基因组研究所数据库 The America Institute of Genomic Research Database; TOF:飞行时间 Time of flight; Trap:离子阱 Ion鄄trap.
细胞[44]、杜氏盐藻细胞[55] 和质膜[54]、玉米叶绿
体[36]、烟草叶片质外体[46]、水稻根质外体[30]和质
膜[19,24]中盐胁迫应答蛋白质表达模式的动态变化
(图 1 和表 1),发现单细胞中参与光合作用、碳和能
量代谢和 ROS 清除过程的蛋白质表达丰度变化差
异显著;叶绿体通过增强光合作用、调节蛋白质的正
确降解和折叠,以及维持氧化平衡来响应盐胁迫;在
质外体应对盐胁迫过程中,细胞壁代谢、胁迫防御和
4022 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 22 卷
信号转导相关蛋白质受到了影响;质膜中参与维持
膜结构稳定、物质 /离子运输和信号转导过程的蛋白
质在植物盐胁迫应答过程中具有重要的作用.
2摇 蛋白质样品制备技术策略
植物蛋白质样品制备是进行蛋白质组学分析的
前提和关键.由于植物细胞中富含蛋白酶、多糖、多
酚、核酸、色素、有机酸及一些次生代谢物等,并且各
种成分的种类与比例又因发育时期和生长环境不同
而有所差异,因此针对不同材料,有效地去除(或抑
制)植物细胞中的蛋白酶、细胞壁多酚、多糖、淀粉、
脂类和多种次生代谢物质,减小对蛋白质分离和鉴
定的影响,成为蛋白质样品制备的关键[56] . 目前应
用于盐胁迫应答蛋白质组学研究的蛋白质样品制备
方法主要包括:三氯乙酸(TCA) /丙酮沉淀法、酚抽
提 /乙酸铵甲醇沉淀法以及两种方法的改良(图 1
和表 1).
2郾 1摇 三氯乙酸(TCA) /丙酮沉淀法
TCA /丙酮沉淀法基于酸性或者疏水条件下蛋
白质易于沉淀的特性来制备蛋白质样品,能够去除
色素、脂类等杂质,并且操作简单快捷,因此该方法
在盐胁迫蛋白质样品制备过程中被广泛应用,超过
60%的相关研究中采用了 TCA沉淀、丙酮沉淀或者
TCA /丙酮沉淀的方法制备样品. 但是,该方法对多
糖等物质的去除效果并不理想.
2郾 2摇 酚抽提 /乙酸铵甲醇沉淀法
酚抽提过程能够将蛋白质溶解于酚相,结合乙
酸铵 /甲醇沉淀可以有效去除脂类、多糖等杂质,因
此,酚抽提 /乙酸铵甲醇沉淀法已经应用在拟南
芥[17]、水稻[20,27]、葡萄[48]、番茄[41]和杜氏盐藻[55]
盐胁迫响应的蛋白质组研究. 然而,该方法与 TCA /
丙酮沉淀法一样,不能解决蛋白质干粉难以完全重
新溶解的问题,并且样品制备过程复杂,所需时间
长.此外,在盐胁迫响应蛋白质组学研究中,植物材
料中含有的高浓度盐分会影响电泳的等电聚焦过
程[57] .
2郾 3摇 上述两种方法的改良方法
Wang 等[57]改进的硼砂鄄聚乙烯吡咯烷酮鄄酚抽
提法(Borax / PVPP / Phe抽提法,BPP抽提法)所采用
的提取液中含有硼砂和聚乙烯吡咯烷酮,能够很好
地去除植物材料中的多糖、多酚以及酚醛类物质,同
时,提取液中的抗坏血酸和 茁鄄巯基乙醇作为强还原
剂能够抑制酚类物质氧化,而硼砂与抗坏血酸已经
被证实对多种植物的顽固组织( recalcitrant tissue)
和储藏器官蛋白质的分离提取具有较好的效果. 经
过这种抽提后,再利用饱和硫酸铵鄄甲醇沉淀的方法
能够使蛋白质沉淀更加完全. 该研究组应用此方法
对盐生植物盐角草幼苗中盐胁迫响应蛋白质组进行
分析,检测到 196 个盐响应差异蛋白质点.这些盐胁
迫应答相关蛋白质主要参与光合作用与碳和能量代
谢过程[52] .
3摇 蛋白质样品的分离与检测技术策略
3郾 1摇 双向电泳
双向电泳 ( two鄄dimensional gel electrophoresis,
2鄄DE)是一种高通量的蛋白质样品分离技术. 等电
聚焦(isoelectric focusing,IEF)和十二烷基硫酸钠鄄聚
丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate polyac鄄
rylamide gel electrophoresis,SDS鄄PAGE)可以分别根
据蛋白质的等电点和分子量对其进行分离.同时,双
向电泳仪器的改进和蛋白质凝胶染色技术的更新大
大提高了 2鄄DE 的重现性和分辨率,使之成为蛋白
质组学研究的重要技术平台之一.
3郾 1郾 1 IPG 胶条的选择 摇 近年来,随着商品化固相
pH梯度( immobilized pH gradient,IPG)胶条长度和
pH范围的不断完善,已经逐渐取代了自制管胶,成
为等电聚焦的重要载体材料. 在已报道的植物盐胁
迫响应蛋白质组学研究中,多种长度(7、7. 5、11、12、
13、17、18 或 24 cm)与 pH 范围(3 ~ 10、3. 5 ~ 10、
4 ~ 7或 5 ~ 8)的 IPG 胶条或自制管胶被使用(图 1
和表 1).增加胶条长度并 /或缩小胶条 pH范围有利
于分离并在双向电泳凝胶上获得更多的蛋白质斑
点. Pang等[17]采用 pH 4 ~ 7、24 cm 长的 IPG胶条对
拟南芥叶片蛋白质进行了分离,共检测到约 1100 个
蛋白质点,而在碱蓬叶片蛋白质组的研究中采用 pH
4 ~ 7 的 18 cm IPG 胶条检测到 700 余个蛋白质
点[51] .
3郾 1郾 2 SDS鄄聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( SDS鄄PAGE) 摇
SDS鄄PAGE凝胶浓度会影响蛋白质样品根据分子量
大小的分离.在植物盐响应蛋白质组学研究中多采
用均一浓度凝胶,凝胶浓度为 10% [33]、11% [38,55]、
11郾 5% [24]、 12% [15-16,19,21,26-27,29,36,46]、 15% [53] 或
12郾 5% [14,17,25,28,32,37,39,41-42,49,51-52](图 1 和表 1).较高
浓度的 SDS鄄PAGE凝胶有助于低分子量蛋白质的分
离. Wang 等[34]在对小麦耐盐蛋白质组研究中采用
了 12. 5%和 10%两种浓度的凝胶,10%的凝胶能够
分离蛋白质分子量范围为 31. 0 ~ 97. 4 kDa,而 12.
5%的凝胶可使检测的最低分子量达到 14. 4 kDa.
50228 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 张摇 恒等: 植物盐胁迫应答蛋白质组学研究的技术策略摇 摇 摇 摇 摇 摇
也有研究采用了分离胶与浓缩胶(浓度小于 5% )相
结合的方法[18,20,22-23,40,43,47](图 1 和表 1),希望能够
通过浓缩胶首先将蛋白质样品浓缩到一个小的区
域,之后再经过分离胶得到更好的分离效果. 然而,
在 2鄄DE分离过程中,等电聚焦过程已经利用非限
制性、低丙烯酰胺浓度的 IPG胶条取代浓缩胶,起到
了对蛋白质样品浓缩的作用[58],因此在 SDS鄄PAGE
过程中不再需要使用浓缩胶.
3郾 2摇 凝胶染色
蛋白质凝胶染色方法的灵敏度决定了蛋白质样
品的检测效率.目前盐胁迫应答蛋白质组学研究的
染色方法主要包括考马斯亮蓝( coomassie brilliant
blue,CBB)染色、硝酸银染色和各种荧光染料染色
(图 1 和表 1). CBB 染色法和硝酸银染色法是普遍
采用的两种染色方法.
3郾 2郾 1 考马斯亮蓝(CBB)染色摇 CBB 染色法经济实
用、操作简单、背景清晰,染色得到的蛋白质点可直
接被用于后续的质谱分析[58],但是其检测灵敏度
低、检测动态范围小,尽管经过不断地改进已经可以
对纳克(ng)级的蛋白质点进行检测[58-59],但仍无法
满足一些需要精确定量和低丰度蛋白质样品检测的
要求.
3郾 2郾 2 硝酸银染色摇 与 CBB 染色法相比,硝酸银染
色法检测灵敏度高,可以检测到 0. 1 ng 的蛋白质
点[58] . Wang等[34]在对小麦盐胁迫应答机制进行的
研究中采用了 CBB和硝酸银染色两种染色方法,分
别得到 650 和 1100 左右的蛋白质点.但是硝酸银染
色法操作复杂、重复性差、背景高,并且染色过程中
醛类物质的使用还会影响质谱分析的兼容性,限制
了该方法的应用[58-59] .
3郾 2郾 3 荧光染料染色摇 荧光染料可以提高对蛋白质
样品检测的灵敏度. 目前在植物盐胁迫应答蛋白质
组学研究中采用较多的主要是用于荧光差异凝胶电
泳( difference gel electrophoresis,DIGE)的 cy2、 cy3
和 cy5 染色技术[16,42]、SYPRO Ruby 染色技术[20,50],
以及用于磷酸化蛋白质分析的荧光染色技术.
2D鄄DIGE是“第二代冶蛋白质组学技术的代表
之一,该方法将不同荧光染料(cy2、cy3 和 cy5)分别
标记的对照与处理样品等量混合后进行 2鄄DE 电泳
分离,将所得蛋白质谱图应用 DeCyderTM差异图像分
析软件进行分析,实现了在同一张凝胶上同时对 2
种蛋白质样品进行分离和比对分析[60],最低可以检
测到 0. 25 ng 的蛋白质样品斑点,大大减小了实验
误差,提高实验的可重复性和定量的准确性. 因此,
2D鄄DIGE有利于低丰度蛋白质的检测和微量样品的
分析[61] . Ndimba 等[16]应用 2D鄄DIGE 对盐胁迫条件
下的拟南芥细胞悬浮培养物进行了蛋白质组学研
究,共检测到 2949 个蛋白质点,其中差异表达蛋白
质点为 266 个.此外,对番茄根的蛋白质组学研究也
采用了 2D鄄DIGE 技术,检测到包含 37 个差异点在
内的 384 个蛋白质点[42] .然而,由于通过 DIGE技术
得到的凝胶上的蛋白质点中所含有的蛋白质丰度不
足以进行质谱分析,因此还需要通过制备凝胶(pre鄄
parative gel)获得足够的蛋白质样品,从而获得差异
表达蛋白质斑点的胶粒来进行质谱分析[56] .
SYPRO Ruby是一种与 Edman降解测序和质谱
鉴定相兼容的荧光染色方法.该方法能够对 ng 级的
蛋白质样品进行检测,并且 SYPRO Ruby 与蛋白质
丰度成很好的线性关系. Tada 等[50] 应用 SYPRO
Ruby染料对盐胁迫条件下红树科植物木榄的蛋白
质组进行了分析,发现果糖鄄1,6鄄二磷酸醛缩酶和渗
调蛋白在盐胁迫应答过程中具有重要作用.
3郾 3摇 蛋白质翻译后修饰的研究方法
3郾 3郾 1 同工型蛋白质的研究方法摇 2DE 凝胶可用于
直接检测因翻译后修饰(尤其是磷酸化和糖基化修
饰)形成的多个同工型蛋白质斑点. Vincent 等[49]对
不同葡萄品种盐胁迫和水分胁迫蛋白质组的变化进
行分析,鉴定得到的 191 个蛋白质点中 43郾 5%为同
工型蛋白质,其中核酮糖鄄1,5鄄二磷酸羧化酶 /加氧
酶( ribulose鄄1,5鄄bisphosphate carboxylase / oxygenase,
RuBisCO)大亚基存在 5 种同工型,ATP合成酶 茁 亚
基、微管蛋白 琢 亚基和 TSR( transformer serine / argi鄄
nine鄄rich ribonucleoprotein)存在 4 种同工型,OEE2
蛋白(oxygen evolving enchancer protein 2)存在 3 种
同工型,肌动蛋白、抗坏血酸过氧化物酶、热激蛋白
70、RNA结合蛋白、NAD 依赖型山梨醇脱氢酶和翻
译调控肿瘤蛋白同源物各具有 2 种同工型. Ndimba
等[16]应用 DIGE 技术对盐胁迫和渗透胁迫条件下
拟南芥蛋白质组进行分析,鉴定得到的 75 种差异表
达蛋白质中 31 种为同工型蛋白质. 此外对小立碗
藓[53]以及小麦[32,34]等多个物种进行的盐响应蛋白
质组学研究也发现多种蛋白质被修饰. 这些被修饰
的蛋白质可能对于盐胁迫条件下调节蛋白质功能、
促进植物体对胁迫条件的应答具有重要作用.
3郾 3郾 2 磷酸化蛋白质的研究方法摇 磷酸化作为一种
重要的蛋白质翻译后修饰方式,在植物盐胁迫应答
的信号转导和转录调控过程中具有重要作用[62] .
Pro鄄Q Diamond荧光染料能够在无同位素标记和特
6022 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 22 卷
异性抗体结合的情况下直接对聚丙烯酰胺凝胶中的
磷酸化蛋白质进行染色,通过荧光扫描仪直接显示
和分析磷酸化蛋白质,并且可以根据荧光强度对蛋
白质磷酸化水平进行比较. Pro鄄Q Diamond 经常与
SYPRO Ruby配合使用,从而实现对磷酸化蛋白质
的检测. Chitteti等[20]应用这两种荧光染料对盐胁迫
应答过程中水稻根磷酸化蛋白质进行了研究. 在检
测到的 28 种差异表达磷酸化蛋白质中,54郾 5%的磷
酸化蛋白质定位于膜上,而 17郾 4%的蛋白质参与了
转运过程,并且具有核苷酸结合活性和催化活性的
蛋白质均为 21. 5% ,这表明盐胁迫过程中磷酸化蛋
白质可能具有特定作用.此外,Jain 等[44]应用 Pro鄄Q
Diamond染料对花生愈伤组织细胞盐响应过程中的
磷酸化蛋白质进行研究,鉴定得到了 RNA 结合蛋
白、14鄄3鄄3 蛋白、热激蛋白 70 和多种病程相关蛋白
质(pathogenesis鄄related protein,PR 蛋白),并对不同
磷酸化水平的 PR蛋白在盐胁迫响应过程中的作用
进行了深入分析.
3郾 4摇 定量蛋白质组学研究策略
2鄄DE对于极端性质蛋白质(如疏水性膜蛋白、
极酸性 /极碱性蛋白质、极高分子量 /极低分子量蛋
白质,以及低丰度蛋白质)的分离与定量仍具有一
定的局限性[56] . 同位素标记相对和绝对定量( iso鄄
baric tag for relative and absolute quantification,
iTRAQ)技术的出现一定程度上解决了疏水性膜蛋
白分离和蛋白质样品精确定量的问题[17,63] . iTRAQ
技术以标记伯氨基的方法对样品中的所有肽段或蛋
白质进行标记,通过肽段在二级裂解过程中的中性
丢失现象产生的质量数为 114、115、116 和 117 的小
分子质谱峰来定量,并可以进行多重定量标记[64] .
目前已经可以对 8 个样品同时标记,大大提高了分
析效率,减小了实验误差. Pang 等[17]采用 iTRAQ 结
合 LC鄄MS技术作为传统 2鄄DE 的补充,对 NaCl处理
的拟南芥、盐芥微粒体蛋白质组变化进行了比较
(图 1 和表 1),分别鉴定得到 32 和 31 种差异表达
蛋白质,其中大部分为叶绿体膜、线粒体膜和质膜相
关蛋白质.
3郾 5摇 蓝色自然胶 / SDS鄄PAGE电泳
蓝色自然胶电泳( blue鄄native / SDS鄄PAGE,BN /
SDS鄄PAGE)是分析蛋白质复合体的有效技术手段.
在样品制备和第一向电泳过程中均不含有 SDS 等
变性剂和二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)等还原剂,
保持了蛋白质复合体的天然状态,通过对不同样品
中蛋白质复合体稳定性和亚基组成的变化来解释不
同生长时期或者处理条件下蛋白质复合体的表达差
异.在第二向 SDS鄄PAGE 电泳时,结合使用变性剂,
将蛋白质复合体成员分离,从而明确蛋白质复合体
的组成. Katz等[54]采用此技术对盐胁迫条件下杜氏
盐藻质膜蛋白质组变化进行了分析(图 1 和表 1),
共鉴定到 55 种蛋白质,其中约 60%为膜整合蛋白
或者膜相关蛋白质,推测杜氏盐藻质膜相关蛋白质
复合体表达的变化可能有利于其在高盐胁迫条件下
维持膜结构的稳定性.
4摇 蛋白质鉴定与生物信息学分析技术策略
4郾 1摇 蛋白质 Edman降解鉴定技术
Edman降解法是传统的蛋白质鉴定方法,利用
三氟乙酸水解苯异硫氰酸酯与肽链 N鄄端氨基酸残
基形成的苯氨基硫甲酰衍生物释放出 N鄄端氨基酸,
经环化作用形成的苯乙内酰硫脲(phenylthiohydan鄄
toin,PTH)衍生物(即 PTH鄄氨基酸)可以通过高效液
相色 谱 ( high鄄performance liquid chromatography,
HPLC)技术进行鉴定,实现从蛋白质 N 端开始对序
列中氨基酸的逐个鉴定,从而获得完整序列信息.在
对盐胁迫条件下水稻叶鞘[18]、葡萄[48]和马铃薯[43]
蛋白质组的研究中采用了该方法进行差异点鉴定
(图 1 和表 1).但是此方法费时费力,难以实现高通
量分析,而且对于 N端封闭的肽段无法进行测序分
析[26] .因此也有研究同时采用了 Edman 降解和质
谱技术对差异蛋白质点进行鉴定. Aghaei等[40]对大
豆根和胚轴盐应答蛋白质组研究检测到了 7 个差异
表达蛋白质点,其中利用 Edman 降解技术测定了 6
个蛋白质斑点,另有一个 N 端封闭的肽段通过生物
质谱技术鉴定为胚胎发育晚期丰富蛋白( late em鄄
bryogenesis abundant protein,LEA蛋白).
4郾 2摇 蛋白质生物质谱鉴定技术
20 世纪 80 年代末,基质辅助激光解吸附电离
(matrix assisted laser desorption ionization,MALDI)和
电喷雾电离(electrospray ionization,ESI)这两种软电
离技术出现,并与各种质量分析器[如:四极杆(qua鄄
drupole,Q)、飞行时间( time鄄of鄄flight,TOF)或离子阱
(ion鄄trap,IT)]进行组合,产生了多种类型的生物质
谱仪(mass spectrometry,MS).生物质谱具有高灵敏
度、高通量等特点,可以对 pmol (10-12 mol)至 fmol
(10-15mol)水平的蛋白质(多肽)进行准确的质量数
分析,并且可以分析蛋白质表达丰度、翻译后修饰状
态 /位点,以及蛋白质相互作用,成为蛋白质组学研
究的核心技术.其中,MALDI鄄TOF MS / MS、ESI鄄Q鄄TOF
70228 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 张摇 恒等: 植物盐胁迫应答蛋白质组学研究的技术策略摇 摇 摇 摇 摇 摇
MS和 ESI鄄Q鄄Trap MS是目前植物盐胁迫蛋白质组学
研究中广泛应用的质谱仪(图 1 和表 1).
4郾 2郾 1 MALDI鄄TOF MS / MS 鉴定策略 摇 在 MALDI鄄
TOF MS / MS中,先将蛋白质(多肽)溶液与基质分
子混合形成晶体,通过激光照射使晶体中的基质分
子积蓄能量并迅速产热直至升华,致使基质和蛋白
质(多肽)分子离子化为单电荷离子,进而通过 TOF
将不同质量数的蛋白质(多肽)分子分离.此种质谱
仪自动化程度高、速度快,对蛋白质样品中去污剂和
盐离子的耐受性强[56],能够对大多数蛋白质(多肽)
进行高通量鉴定. 目前,大约有 50%的盐胁迫蛋白
质组学研究采用此技术对差异表达蛋白质进行鉴
定.但是,MALDI鄄TOF 鉴定技术对数据库的完整性
要求较高,适用于基因组或者 EST 数据库信息较为
详细完整的物种的鉴定[26],因此 MALDI鄄TOF 主要
应用于拟南芥[15-16]、水稻[19-21,23-25,27-30]和葡萄[49]等
基因组信息完整物种的盐胁迫差异蛋白质鉴定. 此
外,对小麦[32-35]、玉米[36-37]和粟[39]等禾本科植物以
及盐角草[52]的研究中也应用了 MALDI鄄TOF 质谱鉴
定技术.
4郾 2郾 2 ESI鄄MS / MS 鉴定策略摇 ESI 技术通过在毛细
管出口处施加高电压所形成的高电场,使从毛细管
流出的蛋白质(多肽)离子化,进而以多电荷或单电
荷离子的形式进入质量分离器,电荷数的增加降低
了检测样品的质 /荷比(m / z),从而扩展了分子量的
分析范围.在电喷雾电离源后面,将四极杆质量分析
器与飞行时间质量分析器或离子阱质量分析器串
联,可以将多肽进一步打碎为氨基酸,从而完成氨基
酸序列分析. 在对豌豆[45]、花生[44]、烟草[46]、番
茄[41]、碱蓬[51]、木榄[50]、小立碗藓[53] 和杜氏盐
藻[54]等非模式植物盐胁迫差异蛋白质的鉴定中,较
多地使用了 ESI鄄MS / MS鉴定技术.
4郾 2郾 3 联合使用 MALDI鄄TOF MS / MS 和 ESI鄄MS / MS
的鉴定策略摇 将 MALDI鄄TOF MS / MS和 ESI鄄MS / MS
两种质谱技术联合使用,更有利于通过不同的离子
化方式鉴定蛋白质.例如,Liska 等[55]用这种方法鉴
定了杜氏盐藻盐胁迫差异蛋白质组中约 80%的蛋
白质. 对水稻根[26]和大麦根[38]的盐胁迫差异蛋白
质组的研究中也采用了这种鉴定策略.
4郾 3摇 数据库搜索
随着蛋白质组学技术的不断发展,相应的蛋白
质组数据库也在不断地建立和完善. 目前在植物盐
胁迫蛋白质组学研究中所采用的数据库包括
NCBInr(National Center for Biotechnology Information
non identical,美国国立生物技术信息中心非单一蛋
白质数据库)、SWISS鄄PROT(瑞士蛋白质序列数据
库)、PIR(Protein Information Resource,蛋白质信息
资源数据库)、GenPept、PDB(Protein Data Bank,美
国国家实验室蛋白质结构数据库)、EMBL(European
Molecular Biology Laboratory,欧洲分子生物学数据
库)、MSDB(伦敦皇家学院蛋白质组学数据库)、
TIGR(The America Institute of Genomic Research Da鄄
tabase,美国基因组研究所数据库)等(图 1 和表 1).
其中约 50%的盐胁迫差异蛋白质组学研究中采用
了 NCBInr 数据库,该数据库中的条目按 GenBank
CDS 翻译库 ( GenBank 编码序列翻译库)、 PIR、
SWISS鄄PROT、PRF(日本蛋白质研究基金会数据库)
和 PDB编录,并且为这些数据库中的序列信息提供
了相互参照引用,避免了重复. 此外,为了得到更为
详尽、精准的蛋白质鉴定信息,研究人员在对小
麦[32-34]、大豆[40]、马铃薯[43]和碱蓬[51]等基因组信
息不清楚的植物进行的研究中,将质谱数据在多个
数据库进行搜索,提高了蛋白质的鉴定率.
5摇 存在的问题
植物耐盐性受到多基因网络体系的调控,各种
信号与代谢途径之间相互交错、彼此关联.蛋白质组
学技术体系为从整体上研究盐胁迫相关代谢和信号
网络提供了可能,但是由于受到技术方法的限制,仍
然存在如下不足:1)极端性质蛋白质的分离和鉴定
技术还不成熟.利用 2DE鄄MS技术,仅能够实现对参
与光合作用、能量和物质代谢、蛋白质代谢,以及胁
迫防御等过程的中高丰度蛋白质进行检测,而对参
与关键调控过程的转录因子、信号转导途径相关的
低丰度表达蛋白质检测效率低.此外,由于受到 IPG
胶条和 SDS鄄PAGE凝胶浓度的限制,对于膜蛋白、极
高(低)分子量蛋白质和极酸(碱)性蛋白质的分离
很难实现. 2)蛋白质翻译后修饰分析技术有待完
善.尽管通过双向电泳技术可以得到一些同工型信
息,并通过荧光染料染色技术可以对蛋白质修饰类
型进行推测,但是翻译后修饰种类众多,很难利用现
有技术高通量地分析某种特定的翻译后修饰. 目前
盐胁迫蛋白质组研究中仅对磷酸化修饰蛋白质在胁
迫应答过程中的表达丰度变化进行了分析[20,44],仍
缺乏对于修饰位点的准确分析. 3)由于不同实验室
使用的技术体系存在差异,很难进行实验室间研究
结果的比较.因此,进一步完善相关技术体系是今后
丰富植物盐胁迫响应蛋白质组学研究策略的前提.
8022 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 22 卷
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作者简介摇 张摇 恒,女,1983 年生,博士研究生. 主要从事分
子细胞生物学研究, 发表论文 5 篇. E鄄mail:hrb鄄zhang@ hot鄄
mail. com
责任编辑摇 李凤琴
0122 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 22 卷