全 文 ：Bt玉米秸秆杀虫蛋白对赤子爱胜蚓酶活性的影响*
舒迎花1,2,3 摇 马洪辉1,2,3 摇 杜摇 艳1,2,3 摇 王建武1,2,3**
( 1 华南农业大学热带亚热带生态研究所, 广州 510642; 2 华南农业大学农业部生态农业重点开放实验室, 广州 510642;
3 华南农业大学广东省高等学校农业生态与农村环境重点实验室, 广州 510642)
摘摇 要摇 Bt 玉米分泌的 Bt 蛋白可通过秸秆还田、根系分泌、花粉飘落等途径进入土壤.本文
模拟秸秆还田,在土壤中添加 5%或 7郾 5%的 Bt玉米及其同源常规玉米秸秆饲养赤子爱胜蚓,
分别于 7、14 d后检测蚯蚓总蛋白含量、乙酰胆碱酯酶(AchE)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH鄄
PX)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性. 结果表明:同一玉米品种,同一秸
秆添加量处理下,与培养 7 d相比,培养 14 d的蚯蚓总蛋白含量下降,AchE、CAT和 SOD酶活
性提高,GSH鄄PX酶活性降低.同一培养时间、同一秸秆添加量处理下,与常规相比,Bt 玉米培
养的蚯蚓 SOD活性提高,AchE和 GSH鄄PX活性下降,总蛋白含量和 CAT 活性无显著变化.表
明 Bt玉米秸秆处理对蚯蚓总蛋白没有抑制作用,能降低 AchE 和 GSH鄄PX 活性,对 CAT 没有
诱导作用,但在短时间内能诱导蚯蚓 SOD酶活性.
关键词摇 Bt玉米摇 赤子爱胜蚓摇 过氧化氢酶摇 谷胱甘肽过氧化物酶摇 超氧化物歧化酶摇 乙酰
胆碱酯酶
文章编号摇 1001-9332(2011)08-2133-07摇 中图分类号摇 Q958. 11摇 文献标识码摇 A
Effects of Bt corn straw insecticidal proteins on enzyme activities of Eisenia fetida. SHU Ying鄄
hua1,2,3, MA Hong鄄hui1,2,3, DU Yan1,2,3, WANG Jian鄄wu1,2,3 ( 1 Institute of Tropical and Subtropi鄄
cal Ecology, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2Ministry of Agricul鄄
ture Key Laboratory of Ecological Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou
510642, China; 3Key Laboratory of Agroecology and Rural Environment of Guangdong Regular
Higher Education Institutions, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China) .
鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2011,22(8): 2133-2139.
Abstract: Bacillus thuringiensis (Bt) proteins released from Bt corn can enter soil ecosystem via
returning straw into field, root exudation, and pollen fluttering鄄down. In this study, the straws of Bt
corn and its near鄄isogenic non鄄Bt line were added into soil with an application rate of 5% and
7郾 5% to breed Eisenia fetida, and the total protein content and the activities of acetylcholine ester鄄
ase (AchE), glutathione peroxidase ( GSH鄄PX), catalase ( CAT), and superoxide dismutase
(SOD) in E. fetida were determined after 7 and 14 days. Under the same application rate of the
straws, the total protein content and GSH鄄PX activity of E. fetida decreased while the AchE, CAT,
and SOD activities increased on the 14th day, compared with those on the 7th day. The Bt corn
straw increased the SOD activity and decreased the AchE and GSH鄄PX activities, but had less
effects on the total protein content and CAT activity, compared with non鄄Bt corn straw. All the re鄄
sults suggested that Bt corn straw had no inhibitory effect on E. fetida total protein but could inhibit
the AchE and GSH鄄PX activities, and could not induce CAT activity but induce SOD activity within
a short time.
Key words: Bt corn; Eisenia fetida; catalase (CAT); glutathione peroxidase (GSH鄄PX); super鄄
oxide dismutase (SOD); acetylcholine esterase (AchE).
*国家自然科学基金项目 (30770402 )、广东省自然科学基金项目 ( E039254,06025813,10451064201005413 )和广东省科技计划项目
(2006B50104002,07A020300009鄄1,2009A020101005)资助.
**通讯作者. E鄄mail: wangjw@ scau. edu. cn
2010鄄12鄄15 收稿,2011鄄05鄄04 接受.
应 用 生 态 学 报摇 2011 年 8 月摇 第 22 卷摇 第 8 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Aug. 2011,22(8): 2133-2139
摇 摇 20 世纪 90 年代以来,转基因作物的田间种植
规模逐渐扩大,其中全球转基因玉米的种植面积在
2009 年达到 4108 万 hm2,占全球转基因作物种植面
积的 30% ,超过了全球玉米种植面积的四分之
一[1] .抗虫转基因作物在一定程度上有效控制了靶
标害虫,减少了农药的使用,但可能引起多种生态安
全和环境问题,其中转基因作物对土壤生态系统影
响的研究被美国 EPA 列为生态风险评价的重要组
成部分[2] .
转 Bacillus thuringiensis(Bt)玉米释放的 Bt蛋白
可以通过根系分泌[3-6]、残茬分解或秸秆还田[7-9]、
花粉飘落[10-11]和取食 Bt玉米的动物排泄物[12]进入
土壤中.土壤具有胶体性质,且有许多腐殖质颗粒,
对外源物质吸附能力很强. 因此,Bt 蛋白能与土壤
结合,不易降解,长时间保持杀虫活性[7,13] . Zwahlen
等[7]研究表明,从 Bt玉米根部释放的和通过植株残
体进入土壤的毒蛋白在 180 d 后仍具有杀虫活性.
这意味着生活在土壤生态系统中,以土壤腐殖质、植
株残体为食的动物包括蚯蚓可直接接触到 Bt蛋白,
从而受到影响.
蚯蚓是土壤中生物量最大的动物类群之一,其
生物量占土壤动物总量的 60% .它促进有机质的分
解、促进土壤养分的循环与释放、改善土壤的理化性
状,在维持土壤生态系统功能中起着不可替代的作
用.同时,蚯蚓处于食物链的底端,对毒物敏感、体型
较大、分布广泛,被视为土壤区系的代表类群而用于
指示、监测土壤污染.目前最常用于土壤生态毒理试
验的蚯蚓是生活在腐殖质中的赤子爱胜蚓(Eisenia
fetida) [14-15] .目前,有关 Bt 玉米对蚯蚓的影响研究
结果显示不一致的现象,从没有影响、稍微的毒性效
应到微量的促进作用[16] .此外,Bt玉米释放的 Bt蛋
白可以通过蚯蚓的摄食和体表呼吸进入蚯蚓体内,
并可以在其肠道和粪便中检测到[17-18] .
Bt蛋白的杀虫机制主要是靶标害虫摄取杀虫
蛋白后,在昆虫中肠的高 pH 环境和蛋白水解酶的
作用下,杀虫蛋白晶体被溶解并激活,被活化的多肽
与肠道受体结合,使细胞膜形成孔道,引起上皮细胞
破裂,导致昆虫死亡[19-20] . Bt 蛋白的摄取常会引起
昆虫体内的解毒酶乙酰胆碱酯酶(AchE)和谷胱甘
肽鄄S鄄转移酶(GST)的变化[21] . 当昆虫摄取 Bt 作物
释放的 Bt蛋白而受到损伤后,体内保护酶包括超氧
化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)处于的动态
平衡状态可能受到破坏,从而过量 O2
-·对生物产生
损伤.肖能文等[22]模拟转基因棉的 Bt 毒素进入土
壤的发生程度,用含不同浓度 Bt 毒蛋白 Cry1Ac 的
人造土壤处理蚯蚓,测定蚯蚓体内总蛋白含量、
CAT、AchE、GST 和纤维素酶活性. 结果表明,Bt 毒
蛋白对蚯蚓的生物量和生理水平影响均不明显,不
存在急毒性和亚致死毒性影响.此外,Liu 等[15]研究
表明赤子爱胜蚓取食转 Cry1Ac 棉的叶片后,体内
SOD活性未受到影响. Bt 玉米秸秆释放的 Bt 毒蛋
白 Cry1Ab是否引起蚯蚓体内解毒酶和保护酶酶活
性变化还未见报道.
本试验通过模拟秸秆还田,在蚯蚓生活的土壤中
添加 5%或 7郾 5%的 Bt 玉米(5422Bt1 和 5422CBCL)
及其同源常规玉米 5422 秸秆,分别在培养赤子爱胜
蚓 7、14 d 后,检测蚯蚓总蛋白含量,以及解毒酶
(AchE)和 3 种保护酶———谷胱甘肽过氧化物酶
(GSH鄄PX)、CAT和 SOD 的活性,分析 Bt 玉米释放
的 Bt 蛋白对蚯蚓生理生化水平的影响,评价 Bt 蛋
白对土壤非靶标生物蚯蚓的生态风险.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 供试土壤、玉米和蚯蚓
供试土壤取自华南农业大学农场(23毅08忆 N,
113毅15忆 E),土层深度 5 ~ 25 cm,为水稻土,土壤类
型为红壤,质地为粘土.试验前该地未种植过任何转
基因作物.土壤于自然条件下风干,过 15郾 0 mm 筛
去除植物残渣、石头以及大的土壤块,再过 2郾 0 mm
筛,充分混匀后备用.土壤的基本理化性质:pH 5郾 9,
有机质 3郾 8% ,全氮 0郾 3 g·kg-1,全磷 0郾 9 g·kg-1,
全钾 32郾 3 g·kg-1 .
Bt 玉米品种 5422Bt1 (转化事件 Bt11 ) 和
5422CBCL(转化事件 MON810)及其同源常规玉米
品种 5422 均来自美国 Beck爷 s Superior Hybrids 公
司,由 Purdue 大学农学系 Cindy Nakatus 博士惠赠;
两种 Bt 玉米品种表达的杀虫蛋白均为 Cry1Ab. 在
玻璃温室内将 3 个品种玉米种植至乳熟期收获. 收
集每个品种玉米的秸秆(叶和茎),剪成 1 ~ 5 cm,冻
干粉碎,过 2郾 0 mm筛,充分混匀后放入-80 益冰箱
备用.秸秆的基本理化性状见表 1.
试验所用蚯蚓为赤子爱胜蚓大平 2 号,购自于
广东江门浩伦生态农业公司,未接触过转基因环境,
试验前驯养于试验土壤中,培养在人工气候箱中
(25 益,60%相对湿度,24 h避光避噪音),饲料为田
间种植的常规甜玉米秸秆.
1郾 2摇 试验设计
根据田间玉米秸秆的还田量( 3000 ~ 9000
4312 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 22 卷
表 1摇 3 个玉米品种秸秆的理化特征
Table 1摇 Characteristics of straws of the three corn cultivars (mg·kg-1 DM)
品种
Cultivar
可溶性糖
Soluble sugar
(n=9)
总蛋白
Total protein
(n=9)
总碳
Total carbon
(n=9)
总氮
Total nitrogen
(n=9)
总磷
Total phosphorus
(n=9)
总钾
Total potassium
(n=9)
Cry1Ab
(n=6)
5422 210郾 6依4郾 3a 69郾 6依8郾 4b 260郾 7依1郾 5a 48郾 7依5郾 5a 9郾 5依0郾 1a 19郾 3依1郾 1a -
5422Bt1 228郾 7依3郾 2a 96郾 6依8郾 2a 270郾 6依4郾 6a 28郾 0依3郾 6b 10郾 5依1郾 2a 12郾 9依3郾 5b 0郾 3伊10-3 依4郾 0伊10-5 a
5422CBCL 230郾 3依7郾 0a 88郾 5依3郾 3a 320郾 2依7郾 3a 35郾 9依7郾 4b 10郾 7依2郾 3a 15郾 7依1郾 7ab 0郾 2伊10-3 依6郾 0伊10-5b
同列不同小写字母表示差异显著(P<0郾 05) Different small letters in the same column meant significant difference at 0郾 05 level.
kg·hm-2) [23]和土壤量(2郾 3伊105 kg·hm-2) [15],每
200 g秸秆土壤混合物中秸秆最大含量为 3郾 9% .本
试验中,按照田间秸秆还田最大量的 1郾 3 和 2 倍,称
取适量玉米秸秆粉末与相应土壤充分混匀,使 200 g
土壤秸秆混合物中秸秆添加量达到总质量的 5%和
7郾 5% . 将土壤秸秆混合物放入塑料杯 (内径
8郾 5 cm,高 9郾 5 cm)中,加入无菌水使其相对湿度达
到 60% .
挑选出生 2 个月,具有生殖环,长势一致,体质
量 180 ~ 220 mg的蚯蚓,室温放置清肠 2 h 后,无菌
水洗涤,滤纸干燥,然后放置入塑料杯中单独饲养,
杯顶盖棉纱布,以防止蚯蚓逃逸并保持其呼吸通畅.
每个玉米品种每个秸秆添加量 30 个重复.培养条件
为 25 益,相对湿度 60% ,避光避噪音. 分别培养 7、
14 d后,每个处理从塑料杯中挑取蚯蚓 10 条,放置
在室温下清肠 2 h 后,用无菌水洗涤,滤纸干燥,称
体质量,-80 益冰箱备用.
1郾 3摇 蚯蚓总蛋白和酶活性测定
将 1 条蚯蚓剪成数段置于预冷的玻璃匀浆器
中,按体质量 1 颐 10 加入预冷的 0郾 9%生理盐水,匀
浆,4 益、3500 r·min-1离心 10 min,取上清液,放置
于-80 益冰箱中,待测.
总蛋白含量采用考马斯亮蓝(G鄄250)法测定.
乙酰胆碱酯酶(AchE)能够水解乙酰胆碱生成
胆碱及乙酸,水解产物胆碱的数量可反映胆碱酯酶
的活性,胆碱可以与巯基显色剂反应生成对三硝基
苯黄色化合物,根据颜色深浅进行比色定量.
过氧化氢酶(CAT)过氧化氢(H2O2)的反应可
通过加入钼酸铵而迅速中止,剩余的 H2O2 与钼酸
铵作用产生一种淡黄色的络合物,在 405 nm处测定
其生成量,以每毫克蛋白每秒分解 1 滋mol H2O2 的
量为一个活力单位(U),计算出 CAT的活力.
谷胱甘肽过氧化物酶(GSH鄄PX)可以促进 H2O2
与还原型谷胱甘肽(GSH)反应,GSH 和二硫代二硝
基苯甲酸作用生成五硫代二硝基苯甲酸阴离子呈现
稳定的黄色,在 412 nm处测量其吸光度的变化即可
计算出 GSH 的减少量. GSH鄄PX 活性可用其酶促反
应的速度来表示.
黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统可产生超氧阴
离子自由基(O2
-·),后者氧化羟胺形成亚硝酸盐,在
显色剂的作用下呈现紫色,可用可见光光度计测其
吸光度.当被测样品中含超氧化物岐化酶(SOD)时,
其对超氧阴离子自由基具有专一性的抑制作用,使
形成的亚硝酸盐减少,吸光值低于对照.
蚯蚓总蛋白、AchE、CAT、GSH鄄PX 和 SOD 活性
的测定具体操作步骤均按照南京建成生物工程研究
所研制的试剂盒的说明书进行.
1郾 4摇 数据处理
用 SAS 8郾 1(SAS Institute Inc. ,Cary,NC,USA)
进行数据单因素方差分析 ( SAS ANOVA). 采用
Student鄄Newman鄄Keuls检验(P<0郾 05)比较不同玉米
品种、不同秸秆添加量、不同培养时间蚯蚓总蛋白和
酶活性的差异显著性.
2摇 结果与分析
2郾 1摇 Bt玉米秸秆杀虫蛋白对蚯蚓总蛋白含量的影响
从图 1 可以看出,培养 14 d后,3 个品种玉米秸
秆处理的蚯蚓总蛋白含量较培养 7 d 减少,且 5%
5422CBCL和 7郾 5% 5422 秸秆处理在 7 d与 14 d间
差异显著. 秸秆添加量对蚯蚓总蛋白含量的影响不
显著. 在同一秸秆添加量、相同培养时间下,
5422CBCL 处理后蚯蚓的总蛋白含量比 5422 和
5422Bt1处理高.蚯蚓在 5% 5422CBCL 秸秆培养7 d
后,总蛋白含量为 105郾 5 g·L-1,分别是 5422 和
5422Bt1的 1郾 6和 1郾 8倍;蚯蚓在 7郾 5% 5422CBCL秸
秆培养 14 d 后,总蛋白含量为 73郾 9 g·L-1,分别为
5422和 5422Bt1 的 2郾 0 和 1郾 4 倍. 除 7郾 5% 5422Bt1
秸秆培养 14 d 蚯蚓总蛋白含量(54郾 0 g·L-1)显著
高于 5422 外,5422Bt1 其他处理的蚯蚓总蛋白含量
与 5422 差异不显著. 说明 Bt 玉米秸秆对蚯蚓总蛋
白没有抑制作用.
2郾 2摇 Bt玉米秸秆杀虫蛋白对蚯蚓 AchE活性的影响
从图 1 可以看出,培养 14 d后,3 个品种玉米秸
53128 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 舒迎花等: Bt玉米秸秆杀虫蛋白对赤子爱胜蚓酶活性的影响摇 摇 摇 摇 摇 摇
图 1摇 Bt玉米秸秆释放的杀虫蛋白对赤子爱胜蚓总蛋白含
量以及乙酰胆碱酯酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和
超氧化物歧化酶活性的影响
Fig. 1 摇 Effects of insecticidal proteins released from Bt corn
straws on the total protein content, AchE activity, CAT activity,
GSH鄄PX activity and SOD activity of Eisenia fetida.
玉: 秸秆添加量 5% ,培养 7 d 5% straw cultured for 7 days; 域: 秸秆
添加量5% ,培养14 d 5% straw cultured for 14 days; 芋:秸秆添加量
7郾 5% , 培养 7 d 7郾 5% straw cultured for 7 days; 郁: 秸秆添加量
7郾 5% , 培养 14 d 7郾 5% straw cultured for 14 days郾 不同小写字母表示
同一处理不同玉米品种间差异显著(P<0郾 05) Different small letters
indicated significant difference among corn varieties in the same treatment
at 0郾 05 level; 不同大写字母表示同一玉米品种不同处理间差异显著
(P<0郾 05) Different capital letters indicated significant difference among
different treatments in the same corn variety at 0郾 05 level.
秆处理的蚯蚓 AchE 活性较培养 7 d 增加,且 5422
秸秆培养的蚯蚓 AchE活性在 7 d 与 14 d 间差异显
著,但 5422Bt1 和 5422CBCL培养的蚯蚓 AchE 活性
在 2 个时间段没有差异. 玉米秸秆添加量的变化对
AchE活性无显著影响. 在同一秸秆添加量、相同培
养时间下,5422CBCL秸秆处理蚯蚓的 AchE 活性最
低,且培养 14 d 时与 5422 差异显著. 5422Bt1 秸秆
培养的蚯蚓 AchE活性虽然低于 5422,但 5%秸秆培
养 7 d及 7郾 5%秸秆培养 7 d和 14 d与 5422 差异不
显著. 5% 5422Bt1 秸秆培养 14 d后的蚯蚓 AchE 活
性为 1郾 5 U·mg-1prot,显著低于 5422,仅为 5422 的
73郾 9% .说明 Bt玉米秸秆能降低 AchE活性.
2郾 3摇 Bt玉米秸秆杀虫蛋白对蚯蚓 CAT活性的影响
无论是 Bt 还是非 Bt 玉米秸秆处理后,培养
14 d的蚯蚓 CAT 活性较培养 7 d 增加,且在同一品
种、同一秸秆添加量下,蚯蚓 CAT活性在 7 d与 14 d
之间差异显著(除 7郾 5%5422Bt1 外)(图 1). CAT酶
活性不随玉米秸秆添加量的变化而变化. 在同一秸
秆添加量、同一培养时间下,5422CBCL 秸秆处理后
蚯蚓的 CAT活性最低,且培养 7 d 后,5422CBCL 与
5422 差异显著.当蚯蚓在 5422CBCL 秸秆添加量为
5%和 7郾 5% ,培养时间为 7 d 时,CAT 活性分别为
41郾 3 和 88郾 1 U·g-1 Hb,分别是 5422 相应处理的
56郾 2%和 79郾 2% . 5422Bt1 玉米秸秆培养 7 d 后,
CAT活性略高于 5422,但两者差异不显著;蚯蚓培
养14 d后,5422Bt1 秸秆处理的蚯蚓 CAT 活性比
5422 处理低,两者差异也不显著.说明 Bt 玉米秸秆
对蚯蚓 CAT活性无显著影响.
2郾 4摇 Bt玉米秸秆杀虫蛋白对蚯蚓 GSH鄄PX 活性的
影响
无论是 Bt 还是非 Bt 玉米秸秆处理后,培养
14 d的蚯蚓 GSH鄄PX活性较培养 7 d降低,但同一玉
米品种、同一秸秆添加量处理在 2 个时间段差异不
显著.在同一秸秆添加量、同一培养时间下,生活在
添加了 Bt玉米秸秆土壤中的蚯蚓 GSH鄄PX 活性低
于非 Bt玉米处理(图 1). 除 5% 5422CBCL 秸秆培
养 7 d的蚯蚓 GSH鄄PX活性与 5422 差异显著外,其
他处理 GSH鄄PX活性两者间差异不显著. 当蚯蚓在
5% 5422Bt1 秸秆培养 14 d时,蚯蚓 GSH鄄PX酶活性
为 10郾 3 U·mg-1 prot,显著低于 5422,仅为 5422 的
45郾 4% .其他 5422Bt1 秸秆处理,虽然蚯蚓 GSH鄄PX
活性低于 5422,但两者间差异不显著. 虽然秸秆添
加量为 5% 、培养时间为 7 d 和秸秆添加量为
7郾 5% 、培养时间为 14 d 时,生活在添加了 5422Bt1
玉米秸秆的蚯蚓 GSH鄄PX活性高于 5422CBCL,但是
6312 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 22 卷
两者间差异不显著. 同样,虽然 7郾 5% 、7 d 或 5% 、
14 d处理后,生活在添加了 5422Bt1 玉米秸秆的蚯
蚓 GSH鄄PX活性低于 5422CBCL,但是两者间差异也
不显著.说明 Bt玉米秸秆能降低 GSH鄄PX活性.
2郾 5摇 Bt玉米秸秆杀虫蛋白对蚯蚓 SOD活性的影响
无论是 Bt 还是非 Bt 玉米秸秆处理后,培养
14 d的蚯蚓 SOD酶活性较培养 7 d升高,且 5422 和
5% 5422Bt1 秸秆处理的 SOD 活性在 2 个时间段之
间差异显著(图 1).培养 7 d后,7郾 5% Bt或非 Bt玉
米秸秆处理的蚯蚓 SOD 活性较 5%秸秆处理升高,
但两个添加量间差异不显著(除 5% 5422 外).在同
一秸秆添加量下,生活在添加 Bt玉米秸秆土壤中的
蚯蚓 SOD活性在培养 7 d后,显著高于非 Bt玉米处
理.培养 14 d 后,生活在添加 5422Bt1 玉米秸秆的
蚯蚓 SOD 活性虽然高于 5422,但 5422Bt1 与 5422
间差异不显著;5422CBCL 秸秆处理后的 SOD 活性
与 5422 差异也不显著. 说明 Bt 玉米秸秆能在短时
间内诱导蚯蚓 SOD活性.
3摇 讨摇 摇 论
Losey等[10] 发表了 Bt 玉米花粉对帝王斑蝶
(Danaus plexippus)毒害作用后,转基因抗虫作物对
非靶标生物的影响引起广泛的关注. 作为评价土壤
生态系统安全的指示生物蚯蚓同样被用于 Bt 作物
种植的风险评估. Liu 等[15,24]在室内通过模拟 Bt 棉
花田间释放 Bt 蛋白的方法,研究了 Bt 棉花对赤子
爱胜蚓生长发育的影响,结果表明蚯蚓取食转基因
棉花 GK19、Bt+CpTI 叶片后,存活率很高,体质量、
蚓茧数和后代数与常规棉花叶片培养差异不显著,
甚至某些处理的蚓茧数和后代数高于对照,这表明
Bt棉花对蚯蚓是安全的. 同样,许多研究表明 Bt 玉
米种植对蚯蚓的存活状况、生物量、生长发育和生殖
没有影响[5,16,24-28] . 王保民等[29]和张俊等[30]报道,
在 Bt 棉植株中检测到 Bt 蛋白的最高浓度为
5 mg·kg-1,其在土壤中的残留期长达 234 d. 本试
验中,Bt 玉米 5422Bt1 和 5422CBCL 秸秆中可检测
到0郾 3 滋g·g-1和 0郾 2 滋g·g-1(表 1),而且 180 d 后
在土壤中仍然可以检测到微量 Bt 蛋白. 虽然 Bt 作
物释放的 Bt蛋白对蚯蚓表征上(生长发育和生殖)
没有影响,但进入体内的 Bt蛋白是否引起其生理生
化的改变?
在本试验中,Bt蛋白没有引起生活在添加 Bt玉
米秸秆土壤中的蚯蚓总蛋白含量减少,反而
5422CBCL处理后蚯蚓总蛋白含量比 5422 高 (图
1),这表明 Bt玉米释放的 Bt 蛋白对蚯蚓总蛋白含
量没有抑制作用.培养 14 d后,3 个玉米品种培养的
蚯蚓总蛋白含量较培养 7 d 减少,这可能与玉米秸
秆在土壤中营养物质降解挥发,蚯蚓摄取的营养物
质减少有关.
蚯蚓体内含有多种保护自身机体的酶,如
SOD、CAT和 GSH鄄PX等.当蚯蚓受到外界环境中有
害物质胁迫时,其体内的保护酶会被激活而提高酶
活性,所以通过测定蚯蚓的保护酶可以评估外源物
质对蚯蚓的影响.在生物体细胞中这 3 种保护酶相
互关联,SOD是消除细胞内生物氧化时产生的超氧
阴离子自由基(O2
-·)的金属酶类,是生物体内重要
的氧自由基消除剂. SOD 活性的激活可以更好地抵
御氧化损伤,一旦生物体内超氧阴离子自由基过量,
则会抑制 SOD的活性[31] .另外,SOD 活性的增加会
导致 H2O2 含量的增加,因此 SOD活性被激活后,伴
随着去除 H2O2 的酶活性也会升高,如 CAT[32] . CAT
可以通过清除 H2O2 来减轻和阻断脂质过氧化反应
的引发作用,一旦 H2O2 含量超过一定范围,反而抑
制 CAT活性[33] .谷胱甘肽过氧化物酶(GSH鄄PX)是
生物体内广泛存在的一种催化过氧化物分解的酶,
能特异性地催化还原性谷胱甘肽(GSH)对过氧化
物的还原反应,能有效地消除 O2
-·、H2O2 和脂质过
氧化物,免除它们对生物细胞的毒害作用,从它的作
用来看,它是 CAT和 SOD的综合体.
在本试验中,蚯蚓生活在添加玉米秸秆土壤中
7 d后,Bt玉米处理的蚯蚓 SOD 活性高于 5422(图
1),可能是 Bt玉米释放的 Bt 蛋白对蚯蚓产生的毒
性激活了 SOD;但 CAT、GSH鄄PX 活性没有显著升
高,反而 5422CBCL 处理后 CAT 活性显著低于
5422,5% 5422CBCL秸秆处理后 GSH鄄PX 活性显著
低于 5422,5422CBCL 处理后这 2 种酶活性低于
5422 的原因可能是 SOD 活性的激活产生了过量的
H2O2,抑制了 CAT和 GSH鄄PX活性.如果导致 SOD、
CAT和 GSH鄄PX 活性改变的关键因子是 Bt 蛋白对
蚯蚓产生的毒性作用,根据表 1 中 5422Bt1 秸秆中
的 Cry1Ab含量高于 5422CBCL以及 5422 秸秆中未
检测到 Cry1Ab,3 个玉米品种秸秆处理后保护酶酶
活性应该为 5422Bt1 > 5422CBCL > 5422 或 5422 >
5422CBCL>5422Bt1.但本试验结果显示,5422CBCL
秸秆 7 d处理后蚯蚓 SOD 升高,CAT 和 GSH鄄PX 下
降,5422Bt1 处理与 5422 差异不显著,这些结果可
能与不同玉米品种秸秆中所含营养物质多少有关.
5422CBCL秸秆中的可溶性糖、总碳和总磷均比
73128 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 舒迎花等: Bt玉米秸秆杀虫蛋白对赤子爱胜蚓酶活性的影响摇 摇 摇 摇 摇 摇
5422 和 5422Bt1 高(表 1),说明生活在营养物质相
对丰富的土壤中保护酶活性相对没有升高.因此,除
了营养成分差别,可能还有其他原因,值得进一步研
究.
在 2 个不同培养时间,3 个品种秸秆处理后,蚯
蚓 SOD 和 CAT 活性升高,但 GSH鄄PX 活性没有升
高.蚯蚓 CAT 和 SOD 活性升高可能与土壤中营养
物质缺乏有关.随着培养时间的变化,秸秆中的营养
物质如糖、蛋白质、有机碳等随着蚯蚓的摄取而减
少,蚯蚓可能处于饥饿状态,从而体内 O2
-·含量逐渐
升高,因此 SOD和 CAT活性升高.
乙酰胆碱酯酶(AchE)是生物神经传导中的一
种关键性酶,在胆碱能突触间,该酶降解乙酰胆碱,
终止神经递质对突触后膜的兴奋作用,保证神经信
号在生物体内的正常传递. 当有毒物质进入蚯蚓体
内后通过占据乙酰胆碱受体,抑制神经传导而使其
处于麻痹瘫痪状态,最终导致死亡. Bt 蛋白的杀虫
机制是 啄鄄内毒素进入靶标害虫肠道中,与肠道受体
结合,使之麻痹致死,常常伴随着乙酰胆碱酯酶活性
的变化[20] . 本试验中,Bt 玉米秸秆处理后的蚯蚓
AchE活性低于非 Bt 玉米秸秆处理. 随着时间的变
化,培养 14 d蚯蚓 AchE活性较培养 7 d 增加,这与
Cry1Ab蛋白毒性无关,可能与不同品种玉米秸秆中
所含营养物质多少有关. 由表 1 所示,Bt 玉米秸秆
中总蛋白、可溶性糖以及其他营养物质比 5422 玉米
秸秆高,随着时间的延长,各个玉米品种中营养物质
被蚯蚓摄取或者挥发,没有足够的营养供给蚯蚓生
长.在蚯蚓处于饥饿胁迫下,体内发生一系列的生理
生化反应,其中也包括一些有毒物质的产生,从而诱
导了 AchE活性.
综上所述,蚯蚓生活在添加了 Bt玉米秸秆的土
壤中,蚯蚓总蛋白含量没有下降,短时间内蚯蚓体内
SOD酶活性被诱导,而保护酶 GSH鄄PX 和解毒酶
AchE活性降低,保护酶 CAT没有被诱导,这表明 Bt
玉米秸秆释放的杀虫蛋白不是引起蚯蚓体内酶活反
应的直接原因,蚯蚓生理生化的变化可能与 Bt玉米
引起的间接因素如营养成分的变化有关.由于 Bt玉
米秸秆在土壤中降解的周期较长,秸秆释放的杀虫
蛋白相应会在土壤中持续较长的时间,因此需要长
时间监测蚯蚓对 Bt 蛋白的生理生化反应. 另外,还
应该从生活史和适应性参数角度考虑转基因作物对
蚯蚓的影响,如寿命、从孵化到性成熟的时间、成蚓
产茧数量和后代的存活等;另外,新孵化的蚯蚓对
Bt毒蛋白的敏感性也需要进一步研究.
参考文献
[1]摇 James C. Global Status of Commercialized Biotech / GM
Crops: 2009, The First Thirteen Years, 1996 to 2009.
Ithaca: ISAAA, 2010
[2]摇 US EPA. Bacillus thuringiensis Plant鄄Pestcides Registra鄄
tion Action Document: Preliminary Risks and Benefits
Sections. Washington DC: U. S. Environmental Protec鄄
tion Agency, 2000
[3]摇 Saxena D, Flores S, Stotzky G. Insecticidal toxin in root
exudates from Bt corn. Nature, 1999, 402: 480
[4]摇 Saxena D, Flores S, Stotzky G. Bt toxin is released in
root exudates from 12 transgenic corn hybrids represen鄄
ting three transformation events. Soil Biology and Bio鄄
chemistry, 2002, 34: 133-137
[5]摇 Saxena D, Stotzky G. Bacillus thuringiensis (Bt) toxin
released from root exudates and biomass of Bt corn has
no apparent effect on earthworms, nematodes, protozoa,
bacteria, and fungi in soil. Soil Biology and Biochemis鄄
try, 2001, 33: 1225-1230
[6]摇 Wang J鄄W (王建武), Feng Y鄄J (冯远娇). Effects of
planting Bt corn on soil microbial activity and soil fertili鄄
ty. Acta Ecologica Sinica (生态学报), 2005, 25(5):
1213-1220 (in Chinese)
[7]摇 Zwahlen C, Hilbeck A, Gugerli P, et al. Degradation of
Cry1Ab protein within transgenic Bacillus thuringiensis
corn tissue in the field. Molecular Ecology, 2003, 12:
765-775
[8]摇 Wang J鄄W (王建武), Feng Y鄄J (冯远娇), Luo S鄄M
(骆世明). Studies on spatial鄄temporal dynamics of
insecticidal protein expression of Bt corn and its degra鄄
dation in soil. Scientia Agricultura Sinica (中国农业科
学), 2003, 36(11): 1279-1286 (in Chinese)
[9]摇 Wang J鄄W (王建武), Feng Y鄄J (冯远娇), Luo S鄄M
(骆世明). Effects of Bt corn straw decomposition on
soil enzyme activities and soil fertility. Chinese Journal
of Applied Ecology (应用生态学报), 2005, 16(3):
524-528 (in Chinese)
[10]摇 Losey JE, Rayor LS, Carter ME. Transgenic pollen
harms monarch larvae. Nature, 1999, 399: 214
[11]摇 Xing Z鄄J (刑珍娟), Wang Z鄄Y (王振营), He K鄄L
(何 康 来 ), et al. Field degradation dynamics of
Cry1Ab insecticidal protein in transgenic Bacillus
thuringiensis corn pollen accumulated in leaf axiles. Chi鄄
nese Journal of Applied & Environmental Biology (应用
与环境生物学报), 2008, 14(2): 163-166 ( in Chi鄄
nese)
[12]摇 Weber M, Nentwig W. Impact of Bt corn on the diplo鄄
pod Allajulus latestriatus. Pedobiologia, 2006, 50:
357-368
[13]摇 Tapp H, Stotzky G. Persistence of the insecticidal toxin
from Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki in soil. Soil
Biology and Biochemistry, 1998, 30: 471-476
[14]摇 Gong P鄄B (龚鹏博), Li J鄄X (李健雄), Guo M鄄F (郭
明昉), et al. Present status and development trend of
earthworm eco鄄toxicological test. Chinese Journal of
Ecology (生态学杂志), 2007, 26 (8): 1297 - 1302
8312 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 22 卷
(in Chinese)
[15]摇 Liu B, Wang L, Zeng Q, et al. Assessing effects of
transgenic Cry1Ac cotton on the earthworm Eisenia feti鄄
da. Soil Biology and Biochemistry, 2009, 41: 1841 -
1846
[16]摇 Icoz I, Stotzky G. Fate and effects of insect鄄resistant Bt
crop in soil ecosystem. Soil Biology and Biochemistry,
2008, 40: 559-586
[17]摇 Ahmad A, Wilde GE, Zhu KY. Evaluation of effects of
coleopteran鄄specific Cry3Bb1 protein on earthworms ex鄄
posed to soil containing corn roots or biomass. Environ鄄
mental Entomology, 2006, 35: 976-985
[18]摇 Schrader S, M俟nchenberg T, Baumgarte S, et al.
Earthworms of different functional groups affect the fate
of the Bt鄄toxin Cry1Ab from transgenic maize in soil.
European Journal of Soil Biology, 2008, 44: 283-289
[19]摇 Gill SS, Cowles EA, Pietrantonio PV. The mode of ac鄄
tion of Bacillus thuringiensis endotoxins. Annual Review
of Entomology, 1992, 37: 615-636
[20]摇 Tang M鄄J (汤慕瑾), Yu J鄄X (余健秀), Li J鄄H (李
建华), et al. Advances in studies on Bacillus thuring鄄
iensis insecticide Crystal protein by mutagenesis. Pro鄄
gress in Biotechnology (生物工程进展), 2001, 21
(4): 54-56 (in Chinese)
[21]摇 Liang G鄄M (梁革梅), Tan W鄄J (谭维嘉), Guo Y鄄Y
(郭予元). Comparison of some detoxification enzyme
and midgut protease activities between resistant and sus鄄
ceptible cotton bollworm population to Bt. Journal of
Plant Protection (植物保护学报), 2001, 28 (2):
133-138 (in Chinese)
[22]摇 Xiao N鄄W (肖能文), Ge F (戈摇 峰), Liu X鄄H (刘
向辉). Effects of Bt toxin Cry1Ac on biochemical re鄄
sponses of Eisenia fetida in an artificial soil. Chinese
Journal of Applied Ecology (应用生态学报), 2005, 16
(8): 1523-1526 (in Chinese)
[23]摇 Zeng M鄄X (曾木祥), Wang R鄄F (王蓉芳), Peng S鄄Q
(彭世琪), et al. Summary of returning straw into field
of main agricultural areas in China. Chinese Journal of
Soil Science (土壤通报), 2002, 33(5): 336-339 (in
Chinese)
[24]摇 Liu B, Cui J, Meng J, et al. Effects of transgenic Bt+
CpTI cotton on the growth and reproduction of earthworm
Eisenia foetida. Frontiers in Bioscience, 2009, 14:
4008-4014
[25]摇 Ahl鄄Goy P, Warren G, White J, et al. Interaction of an
insect tolerant maize with organisms in the ecosystem.
Proceedings of the Key Biosafety Aspects of Genetically
Modified Organisms. Blackwell, Berlin, 1995, 309:
50-53
[26]摇 Vercesi ML, Krogh PH, Holmstrup M. Can Bacillus
thuringiensis ( Bt ) corn residues and Bt鄄corn plants
affect life鄄history traits in the earthworm Aporrectodea
caliginosa? Applied Soil Ecology, 2006, 32: 180-187
[27] 摇 H觟nemann L, Nentwig W. Are survival and reproduc鄄
tion of Enchytraeus albidus (Annelida: Enchytraeidae)
at risk by feeding on Bt鄄maize litter? European Journal
of Soil Biology, 2009, 45: 351-355
[28]摇 Zeilinger AR, Andow DA, Zwahlen C, et al. Earth鄄
worm populations in a northern U. S. corn belt soil are
not affected by long鄄term cultivation of Bt maize express鄄
ing Cry1Ab and Cry3Bb1 proteins. Soil Biology and
Biochemistry, 2010, 42: 1284-1292
[29]摇 Wang B鄄M (王保民), Li S鄄H (李绍虎), Li B (李
斌), et al. Content and expression of Bacillus thuring鄄
iensis insecticidal protein in transgenic cotton. Journal of
Agricultural Biotechnology (农业生物技术学报 ),
2002, 10(3): 215-219 (in Chinese)
[30]摇 Zhang J (张摇 俊), Guo X鄄M (郭香墨), Ma L鄄H (马
丽华). Study on effects of different foreign Bt and
Bt+CpTI insect鄄resistant genes on bollworm resistance in
upland cotton (G. hirsutum L. ). Acta Gossypii Sinica
(棉花学报), 2002, 14(3): 158-161 (in Chinese)
[31]摇 Sun Y, Yin G, Zhang J, Yu H, et al. Bioaccumulation
and ROS generation in liver of freshwater fish, goldfish
Carassius auratus under HC Orange No. 1 exposure.
Environmental Toxicology, 2007, 22: 256-263
[32] 摇 Li Y, Zhou Q, Li F, et al. Effects of tetrabromobi鄄
sphenol A as an emerging pollutant on wheat (Triticum
aestivum) at biochemical levels. Chemosphere, 2008,
74: 119-124
[33]摇 Geret F, Serafim A, Barreira L, et al. Effect of cadmi鄄
um on antioxidant enzyme activities and lipid peroxida鄄
tion in the gills of the clam Ruditapes decussates. Bio鄄
markers, 2002, 7: 242-256
作者简介摇 舒迎花,女,1981 年生,博士.主要从事转基因作
物对非靶标生物安全性评价与分子生态学研究,发表论文
10 余篇. E鄄mail: shuyinghua@ scau. edu. cn
责任编辑摇 肖摇 红
93128 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 舒迎花等: Bt玉米秸秆杀虫蛋白对赤子爱胜蚓酶活性的影响摇 摇 摇 摇 摇 摇