全 文 ：三株降解芘的戈登氏菌鉴定及其降解能力*
胡凤钗1,2 摇 李新宇2 摇 苏振成2**摇 王秀娟2 摇 张惠文2 摇 孙军德1
( 1 沈阳农业大学土地与环境学院, 沈阳 110161; 2 森林与土壤生态国家重点实验室, 中国科学院沈阳应用生态研究所, 沈阳
110164)
摘摇 要摇 从沈抚灌区多环芳烃污染土壤中筛选出的芘降解菌 D44、D82S 和 D82Q,经形态观
察、生理生化试验和 16S rDNA序列分析确定均为戈登氏菌属(Gordonia sp. ) . 3 株菌的最适生
长 pH值均为 7,当 pH值低于 5 或高于 9 时,生长均受到明显抑制.降解试验表明,3 株菌能以
芘、苯并芘、蒽、萘、菲和荧蒽为唯一碳源和能源生长. 经过 7 d 的培养,3 株菌对初始浓度为
100 mg·L-1的芘的降解率均在 65%以上,对初始浓度为 50 mg·L-1的苯并芘的降解率分别
为 79郾 6% 、91郾 3%和 62郾 8% .通过 PCR检测发现 D82Q和 D82S含有烷烃单加氧酶基因 alkB.
关键词摇 戈登氏菌摇 多环芳烃摇 芘摇 生物降解
文章编号摇 1001-9332(2011)07-1857-06摇 中图分类号摇 Q939. 9摇 文献标识码摇 A
Identification and degradation capability of three pyrene鄄degrading Gordonia sp. strains. HU
Feng鄄chai1,2, LI Xin鄄yu2, SU Zhen鄄cheng2, WANG Xiu鄄juan2, ZHANG Hui鄄wen2, SUN Jun鄄de1
( 1College of Land and Environment, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China;
2State Key Laboratory of Forest and Soil Ecology, Institute of Applied Ecology, Chinese Academy of
Sciences, Shenyang 110164, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2011,22(7): 1857-1862.
Abstract: Three pyrene鄄degrading bacterial strains named D44, D82S and D82Q were isolated
from PAHs鄄contaminated soil in Shenfu Irrigation Area of Shenyang, Northeast China. The strains
were identified as Gordonia sp. , based on the morphological observation, physiological and bio鄄
chemical identification, and phylogenetical analysis of 16S rDNA sequences. For all the three
stains, their optimal pH was 7, and their growth was obviously inhibited when the pH was lower
than 5 or higher than 9. The three strains were capable of utilizing pyrene, benzo[a]pyrene, an鄄
thracene, naphthalene, phenanthrene, and fluoranthene as the sole source of carbon and energy.
After seven days incubation, the three strains could degrade more than 65% of pyrene with an ini鄄
tial concentration 100 mg·L-1, and the D44, D82S, and D82Q could degrade 79. 6% , 91. 3% ,
and 62. 8% of benzo[a]pyrene with an initial concentration 50 mg·L-1, respectively. PCR ampli鄄
fication indicated that the strains D82Q and D82S possessed alkane monooxygenase gene alkB.
Key words: Gordonia sp. ; polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs); pyrene; biodegradation.
*中国科学院知识创新工程重要方向项目(KSCX2鄄YW鄄G鄄053鄄2)资
助.
**通讯作者. E鄄mail: zhenchengsu@ yahoo. com. cn
2011鄄02鄄22 收稿,2011鄄04鄄20 接受.
摇 摇 随着石油工业的发展,石油在开采、运输和使用
过程中的泄露以及含油废弃物排放引起的土壤污染
问题日益严重.石油污染可改变土壤理化性质,危害
农作物,进而威胁人类健康,因而石油污染土壤的修
复技术研究日益受到重视. 生物修复技术在诸多治
理方法中最经济,且环境破坏性小,利用微生物降解
多环芳烃( polycyclic aromatic hydrocarbon,PAHs),
对 PAHs污染土壤进行生物修复被认为是最具应用
前景的修复技术之一,而选育 PAHs 高效降解微生
物并充分发挥其降解作用是该技术的核心和重要前
提[1-2] .
芘是难降解的具有 4 个苯环的典型稠环芳烃,
微溶于水,半衰期长,具有潜在毒性、致癌性及致畸
诱变作用,它普遍存在于环境中,而且它的一些衍生
物具有更强的毒性,所以芘常被用作监测 PAHs 污
染的指示物和其他 PAHs 光化学降解、生物降解的
模式化合物.但由于芘属于高分子量 PAHs,具有化
学稳定性,在土壤中很难被微生物所代谢利用,关于
芘的净化技术处于研究阶段,还没有成熟、高效且易
应 用 生 态 学 报摇 2011 年 7 月摇 第 22 卷摇 第 7 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Jul. 2011,22(7): 1857-1862
行的处理方法.国内外已报道的可降解四环芘的微
生物主要有分枝杆菌(Mycobacterium) [3-4]、诺卡氏
菌(Nocardia) [5]、红球菌(Rhodococcus) [6]、、假单胞
菌(Pseudomonas) [7]、芽孢杆菌(Bacillus) [8]、寡养单
胞菌 ( Stenotrophomonas ) [9] 和 戈 登 氏 菌 ( Gor鄄
donia) [10-11]等.
在放线菌中,戈登氏菌显示出了较强的代谢方
式多样性和遗传多样性,该属的多个成员已成为烃
类污染土壤生物修复的极具潜力的供选菌株[12-13] .
研究表明,一些戈登氏菌可降解或修饰芳香族和脂
肪族碳氢化合物、卤化的芳香族化合物、苯并噻吩、
腈、聚异戊二烯、二甲苯、橡胶等[13] . 本文以 3 株从
污染土壤中筛选出的戈登氏菌为试验对象,对其进
行初步鉴定,并研究其对 PAHs的降解能力.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 降解菌的分离和筛选
1郾 1郾 1 土壤样品采集摇 污染土壤样品采自沈抚石油
污水灌区渠首稻田(41毅50忆55义 N, 123毅44忆56义 E),该
灌区是中国最大的石油污水灌区之一,长期污灌造
成土壤 PAHs含量严重超标,对该地区的土壤生态
安全及居民健康造成极大威胁. 在灌渠附近的稻田
取 0 ~ 20 cm 耕层土壤,五点法采样,过 2 mm 筛后
彻底混合均匀,采集到的土样一部分风干后用于土
壤理化性质分析,一部分保存于-70 益冰箱内供基
因组 DNA提取及分析,一部分保存于 4 益,用于筛
选 PAHs降解菌. 土壤的基本理化性质及多环芳烃
污染情况见表 1.
1郾 1郾 2 菌株培养基摇 无机盐基础培养基成分及用量
(g·L-1):MgSO4·7H2O 0郾 2, CaCl2·2H2O 0郾 02,
FeSO4 ·7H2O 0郾 01, KH2PO4 0郾 4, Na2HPO4 0郾 6,
MnSO4·H2O 0郾 02, NH4NO3 1郾 0. 固体培养基中加
入 2%琼脂,芘用丙酮配制成 1000 mg·L-1的母液,
调 pH值接近污染土壤的自然 pH,121 益蒸汽灭菌
30 min.
菌株保藏用牛肉膏蛋白胨培养基,成分及用量
(g·L-1):牛肉膏 3,蛋白胨 10,NaCl 5,琼脂 20,调
整 pH 7郾 0 ~ 7郾 2.加入芘使其终浓度为 50 mg·L-1 .
1郾 1郾 3 芘降解菌的筛选摇 称取土样 5 g,放入 45 mL
无菌水中,摇床振荡 30 min 后,经过系列稀释到
10-7,各个浓度分别取 0郾 1 mL涂布到无机盐固体培
养基上,然后用升华法在培养基上加层芘膜.加膜方
法:在通风橱中,将芘配成 10000 mg·L-1的丙酮溶
液,吸取 2 mL移至平皿底中,待丙酮挥发完全,把接
种后的平皿倒扣到平皿盖上,并用封口膜将接口处
封闭,整体放到沙浴中加热,在平板上方放上冰袋,
使芘升华后遇平皿冷却而附着在固体培养基上. 制
备好的培养皿置入 30 益恒温箱培养,每日观察,挑
取能产生透明圈的单菌落在牛肉膏蛋白胨培养基上
多次划线纯化.纯化后的菌株再接种于含芘的无机
盐平皿上验证其降解能力.
1郾 2摇 菌株的鉴定
1郾 2郾 1 形态观察与生理生化鉴定摇 采用光学显微镜
进行革兰氏染色后观察,菌株鉴定的生理生化试验
参照文献[14]进行,主要进行淀粉水解、硝酸盐还
原和明胶液化等试验.
1郾 2郾 2 16S rDNA 序列的 PCR 扩增与测序 摇 使用前
引物 27F(5忆鄄AGAGTTTGATCMTGGCTCAG鄄3忆)和后
引物 1492R(5忆鄄TACGGHTACCTTGTTACGACTT鄄3忆)
(分别来源于大肠杆菌 16S rDNA 的 8鄄27 和 1492鄄
1513 基因片段)进行扩增[15] . PCR 反应程序如下:
在 96 益预变性 10 min,95 益变性 1 min,55 益退火
1 min,72 益延伸 1郾 5 min,35 个循环,最后 72 益延
伸 10 min.反应产物用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测,
经切胶纯化后送华大基因公司测序. 序列登陆
GeneBank进行 blast 分析,用 3 株戈登氏菌的序列
和下载的 16S rDNA 序列通过 clustalX 进行比对聚
类分析,应用 MEGA 4郾 0 软件、采用 Neighbor鄄Joining
方法和 Jukes鄄Cantor模式构建系统发育树.
1郾 3摇 降解能力的测定
1郾 3郾 1 菌株活化和菌体悬液的制备摇 取斜面菌株接
于 50 mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基, 30 益
150 r·min-1摇床培养 48 h,即得到活化菌株.取已活
化好的菌液50 mL,置于无菌离心管,5000 r·min-1
表 1摇 土壤基本理化性质和多环芳烃含量
Table 1摇 Basic physical and chemical properties and PAHs content of the test soil
沙粒
Sand
(% )
粉粒
Silt
(% )
粘粒
Clay
(% )
有机质
Organic matter
(% )
碳氮比
C:N
pH 多环芳烃 PAHs (滋g·kg-1)
2 ~ 3 环
2-3 rings
4 环
4 rings
5 ~ 6 环
5-6 rings
16 种多环芳
烃总量
Total 16
PAHs
63 27 10 47郾 9 14 6郾 24 1477 4503 2438 8417
8581 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 22 卷
离心 10 min,弃上清液,用磷酸盐缓冲液震荡重新悬
浮菌体,5000 r·min-1离心 10 min,如此反复两次,
最后用该磷酸盐缓冲液悬浮菌体得到菌体悬液,浓
度调至 6伊109 CFU·mL-1 . 此悬液不带有任何碳源
和氮源.
1郾 3郾 2 菌株的最适生长 pH 试验 摇 将牛肉膏蛋白胨
培养基调 pH 为 5、6、7、8、9,分别接入菌体悬液
1 mL,30 益150 r·min-1摇床培养,每日测定 OD600 .
1郾 3郾 3 烷烃单加氧酶基因 alkB 的扩增 摇 alkB 为烷
烃降解的关键基因,扩增采用前引物 alkB鄄1f (5忆鄄
AAYACNGCNCAYGARCTNGGNCAYAA鄄3忆) 和后引
物 alkB鄄1r ( 5忆鄄GCRTGRTGRTCNGARTGNCGYTG鄄
3忆) [16],PCR 体系为:1 伊 PCR 缓冲液,1 U 的 rTaq
DNA聚合酶,200 滋mol·L-1的 dNTP,25 pmol 的前
后两种引物,0郾 5 滋L 10 滋g·滋L-1的牛血清白蛋白,
0郾 5 滋L的 DNA模板(约 50 ng),用去离子水补充到
25 滋L.扩增程序为:95 益预变性15 min,94 益变性
1 min,55 益退火 1 min,72 益延伸1 min,此步骤共
39 个循环,最后 72 益延伸 10 min.
1郾 3郾 4 菌株对 PAHs降解能力的测定摇 PAHs残留量
的测定参照齐邦峰等[17]的紫外分光光度分析法.反
应瓶中加入 10 mL二氯甲烷,150 r·min-1摇床震荡
15 min,取萃取有机相于 25 mL容量瓶中,如此反复
萃取 3 次(第 2 次加入二氯甲烷 8 mL,第 3 次加入
7 mL),定容萃取液,摇匀后吸取 50 滋L 加于试管
中,待二氯甲烷挥发后加入 10 mL 甲醇溶解残留的
多环芳烃,待其完全溶解后以甲醇为对照在各多环
芳烃最大紫外吸收波长处测定其吸光度值,其中,芘
为 240 nm,萘为 275 nm,蒽为 254 nm,菲为 252 nm,
荧蒽为 232 nm,苯并(琢)芘为 296 nm.
1郾 4摇 数据处理
通过对标准浓度的 PAHs鄄甲醇溶液吸光度值的
测定,获得浓度为 X、吸光值为 Y 的标准曲线方程
Y=aX+b.测得不同时间的吸光值后,可得其残留浓
度 X=(Y-b) / a,降解率 D = (Xb -X) / Xb 伊100% ,Xb
为未接菌空白对照的 PAHs 残留浓度. 所有数据使
用 Excel 2007 软件进行分析和作图.
2摇 结果与分析
2郾 1摇 菌株的筛选与鉴定
经过多次分离、纯化和复验,从土壤中筛选到 3
株可以芘为唯一碳源和能源生长的菌株,分别命名
为 D44、D82S 和 D82Q. 3 株菌的菌落边缘整齐,表
面有光泽,呈圆形垫状,分别为品红色、粉红色和米
黄色(图 1).在显微镜下观察均为长杆状,革兰氏阳
性菌.其生理生化反应结果表明,这 3 株菌均能在
5% NaCl 下生长,过氧化氢酶为阳性,不能水解吐
温鄄80,硝酸盐还原和脲酶为阴性,吲哚试验为阳性,
能利用葡萄糖、麦芽糖和蔗糖等.
摇 摇 将 3 株菌的 16SrDNA序列与 GeneBank 中已知
序列进行比对,结果表明, D44 与 Gordonia al鄄
kanivorans strain DSM 44187 及 Gordonia alkanivorans
strain CC鄄JG39 的序列相似性为 100% ,D82S与分离
自石油严重污染土壤中的戈登氏菌 CC鄄MJ鄄33a的序
列相似性为 100% ,D82Q 与 Gordonia amicalis strain
CC鄄MJ鄄2a等菌株的序列相似性为 99% .结合生理生
化试验结果,确定 3 株菌均为戈登氏菌属.系统发育
关系见图 2.
2郾 2摇 3 株菌的最适生长 pH值
戈登氏菌在 pH为 5 ~ 9 范围均可生长,生长规
律为 pH 7>pH 8>pH 9>pH 6>pH 5,最适 pH为 7(图
3).这 3 株菌在 pH 5 时生长最缓慢,pH 6 其次,表
明其耐酸性很差,耐碱性较强.
图 1摇 3 株戈登氏菌的菌落形态
Fig. 1摇 Colony morphology of three Gordonia sp. strains.
95817 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 胡凤钗等: 三株降解芘的戈登氏菌鉴定及其降解能力摇 摇 摇 摇 摇 摇
图 2摇 邻位相连法建立的 3 株菌的系统发育进化树
Fig. 2摇 Phylogenetic tree of three strains conducted by neighbor鄄joining method.
图 3摇 3 株菌在不同 pH条件下的生长曲线
Fig. 3摇 Growth curve of three strains under different pH conditions.
2郾 3摇 烷烃单加氧酶基因 alkB的检测
在假单胞菌中,单加氧酶系统催化正烷烃降解
的第一步反应,烷烃单加氧酶( alkane hydroxylase,
alkB)是这个酶系统的主要部分[18],并且在烷烃降
解过程中发挥重要作用. 提高碳氢化合物的浓度或
向环境中添加碳氢化合物菌能导致 alkB 基因拷贝
数的增加,因此,alkB 基因可作为石油污染或生物
降解的重要生物指标[19] .
根据 Wasmund 等[16]设计的引物,通过 PCR 扩
增得到约 550 bp 的 DNA 片段,琼脂糖凝胶电泳结
果如图 4 所示,菌株 D82Q和 D82S均含有烷烃单加
氧酶基因 alkB,表明这两株戈登氏菌具有降解烷烃
的潜力.
2郾 4摇 3 株菌对芘和其他 PAHs的降解
3 株菌对芘的降解效果相近,随培养时间的增
加,降解率也不断增加.在生长延滞期芘的降解速率
较低,到对数期降解增快,之后降解速率下降,可能
是由于菌体的生长到了稳定期,碳源利用率下降.在
芘浓度为 100 mg·L-1的无机盐培养基中培养 7 d,3
株菌对芘的降解率分别达 65郾 4% 、 70郾 5% 和
67郾 5% .由菲的降解曲线可以看出,菌株 D82Q 对菲
的降解能力最强,从培养第 3 天起至试验结束,其对
菲的降解率一直最高,其次是 D82S,D44 的降解能
力最弱.在苯并芘的初始浓度为 50 mg·L-1的降解
试验中,3 株菌的降解情况较复杂,在试验的前 5 d,
菌株 D44 的降解效果好于菌株 D82S 和 D82Q,但在
此之后,菌株 D82S的降解速率显著增加,至试验结
束时,其降解率最高,菌株D44次之,D82Q降解曲
图 4摇 3 株菌烷烃单加氧酶基因 alkB检测结果
Fig. 4 摇 Detection result of alkane hydroxylase gene alkB in
three strains.
0681 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 22 卷
图 5摇 3 株菌对不同多环芳烃的降解能力
Fig. 5摇 Degrading ability of the three strains on PAHs.
a) 100 mg·L-1芘 100 mg·L-1pyrene; b) 200 mg·L-1菲 200 mg·L-1 fluoranthene; c) 50 mg·L-1苯并芘 50 mg·L-1 benzo[a]pyrene.
线最平稳(图 5).
摇 摇 采用同样方法,检测了 3 株菌对萘、蒽和荧蒽的
降解情况.结果表明: 3 株菌均可以萘、蒽和荧蒽为
唯一碳源和能源生长,但降解率较低.
3摇 讨摇 摇 论
对苯并芘代谢的研究大部分是由芘降解的相关
研究推动的,而且一般需要添加共代谢底物[20-21],
因为芘可以刺激 PAHs代谢酶,从而降解苯并芘.盛
下放等[22]从石油污染的土壤样品中分离筛选出一
株高效降解苯并芘的氮单胞菌属菌株 JL鄄14,在苯并
芘浓度为 20 mg·L-1条件下,降解率可达 27郾 6% ,
加入菲和蔗糖均可促进对苯并芘的降解.近几年来,
可以苯并芘为唯一碳源和能源进行降解的菌株陆续
被报道.苏丹等[23]筛选出 6 株真菌(产黄青霉、镰刀
菌、黑曲霉、木霉、毛霉和水霉)可降解芘和苯并芘,
它们的降解速率差异显著,但降解率相差不大. Ba鄄
cillus subtilis BMT4i (MTCC9447) [24]是最早报道的
可以苯并芘为唯一碳源和能源的细菌,在培养 24 h
后开始降解苯并芘,继续培养到 28 d 时可达到最大
降解率(84郾 7% ). Ochrobactrum sp. BAP5[25]是从海
洋沉积物中分离得到的可将苯并芘降解的细菌,培
养 2 周可降解 20%以上的苯并芘.可以苯并芘为唯
一碳源和能源生长的菌株还有 Mycobacterium sp.
NJS鄄1[26]和假单胞菌 SL鄄1[27],然而可降解苯并芘的
戈登氏菌还未见报道.
戈登氏菌是一类具有较高底物降解多样性的微
生物,能够代谢多种环境有毒污染物.对一些代表性
的分离株的鉴定结果表明,戈登氏菌属与分枝杆菌、
红球菌同属于诺卡氏菌型放线菌,是土壤中具有代
谢 PAHs能力的主要微生物类群之一[28] .刘磊等[10]
从石油污染土壤中分离出具有 PAHs代谢活性的戈
登氏菌 He4,该菌株可降解正十六烷、苯、萘、蒽、菲
和芘. Gordonia sp. strain JE鄄1058[29]可产生生物表面
活性剂,具有清洁海洋和海滩上泄漏石油的潜力.
目前,已经从烃类化合物污染土壤中分离出多
株放线菌类降解菌,其中一些菌株的降解特性、降解
途径及相关降解基因已有报道,但关于 Gordonia 属
细菌的代谢规律和机理研究较少.
4摇 结摇 摇 论
从石油污染稻田土壤中分离得到 3 株芘降解细
菌 D44、D82S 和 D82Q,通过形态观察、生理生化反
应和 16S rDNA 基因序列分析,初步确定均为戈登
氏菌,其生长最适 pH 值为 7.降解能力测试结果表
明,3 株菌对浓度为 100 mg·L-1芘的降解率均超过
60% ,D82Q降解菲的能力最强,D82S对 50 mg·L-1
苯并芘的降解率高达 90% ,同时 3 株菌还可以萘、
蒽和荧蒽为唯一碳源和能源生长,菌株 D82Q 和
D82S含有烷烃降解基因 alkB. 3 株戈登氏菌能降解
多种 PAHs,可作为生物修复 PAHs污染土壤的潜在
菌种资源.
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作者简介摇 胡凤钗,女,1983 年生,硕士研究生.主要从事环
境微生物及 PAHs 污染修复研究. E鄄mail: hufengchai0314@
126. com
责任编辑摇 肖摇 红
2681 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 22 卷