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第 1 5卷 第 1 期
2013 年 1 月
辽 宁 中 医 药 大 学 学 报
JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCM
Vol. 15 No. 1
Jan .，2013
凤 尾 草（Pteris multifida Poir）为 凤 尾 蕨 科
（Pteridaceae）凤尾蕨属植物干燥全草，主产于贵州、
浙江、江苏、湖南、陕西等地。功效清热利湿，凉血止
血，消肿解毒 ；用于治疗菌痢，吐血，衄血，便血，尿
血，黄疸型肝炎，扁桃体炎，腮腺炎，肠炎，痈肿疮毒，
湿疹等[1]。在临床上将凤尾草与其他中草药配伍，
治疗食管癌、直肠癌和妇科肿瘤等[2]。凤尾草全草
含有黄酮类、萜类、甾醇、苯丙素类、挥发油类以及氨
基酸等化学成分[3]，黄酮类化合物为其主要化学成
分且含量高达3.2%[4]。近年来对凤尾草抗肿瘤作用
的研究主要是其抑制肿瘤的增殖[5]，未见关于其抑
制肿瘤细胞迁移功能研究的报道。本研究旨在观察
凤尾草总黄酮对骨肉瘤MG-63细胞体外迁移能力
的影响，并探讨其可能的机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株
人骨肉瘤MG-63细胞由承德医学院附属医院
中心实验室提供。
1.1.2 药物
凤尾草干燥全草，购自河北安国药材市场，由
承德医学院赵春颖副研究员鉴定为凤尾科蕨类植物
Pteris multifida Poir干燥全草，样品保留在承德医学
院中药研究所。
1.1.3 试剂
RPMI Medium1640培 养 基 干 粉 和 胎 牛 血 清
（FBS）购自GIBCO公司，胰蛋白酶购自Amersco公
司产品，IL-6及β-actin抗体购自Sigma公司，辣根
凤尾草总黄酮抑制骨肉瘤MG-63细胞迁移及其机制的初步研究
孔维鑫1，杨永明2，邹君3，曲杰3，田跃2
（1.承德医学院，河北 承德 067000 ；2.保定市第二医院，河北 保定 071000 ；3.承德医学院附属医院，河北 承德 067000）
摘 要：目的：观察凤尾草总黄酮对人骨肉瘤MG-63细胞体外迁移能力的影响，并探讨其作用机制。方法：利
用乙醇萃取法制备凤尾草总黄酮，通过划痕实验、Transwell实验观察不同浓度凤尾草总黄酮对同样条件培养下骨
肉瘤MG-63细胞迁移能力的影响，并采用Western blot方法检测不同浓度凤尾草总黄酮对MG-63细胞内白介素
6（IL-6）蛋白表达水平的影响。结果：同未加药物对照组相比，经高浓度凤尾草总黄酮（5与10 g·L-1）处理后，
MG-63细胞的划痕愈合能力明显减弱，穿膜细胞的数量显著减少；同时，细胞内IL-6蛋白的表达水平明显降低，
并与凤尾草总黄酮的浓度呈负相关性。结论：凤尾草总黄酮抑制了骨肉瘤MG-63细胞的迁移能力，其作用与抑制
MG-63细胞内的IL-6蛋白表达水平有关。
关键词：凤尾草总黄酮；MG-63细胞；IL-6 ；迁移
中图分类号：R282 文献标志码：A 文章编号：1673-842X (2013) 01- 0042- 03
收稿日期：2012-07-08
作者简介：孔维鑫（1986-），男，河北沧州人，2010级硕士研究生，研究方向 ：肿瘤细胞增殖和迁移方面研究。
通讯作者：田跃（1960-），男，河北保定人，教授、主任医师，硕士，研究方向 ：骨肿瘤临床治疗和肿瘤细胞迁移方面研究。
Effect of the Pteris Multifida Flavones on the Metastasis Ability
of Human Osteosarcoma Cell Line MG-63 Cells
KONG Weixin1，YANG Yongming2，ZOU Jun3，QU Jie3，TIAN Yue2
（1.Chengde Medical University，Chengde 067000，Hebei，China ；2.Second Hospital of Baoding，Baoding
071000，Hebei，China ；3.Affiliated Hospital of Chengde Medical College，Chengde 067000，Hebei，China）
Abstract ：Objective ：To investigate the effect of the Pteris multifida Flavones on MG-63 cells
metastasis of human osteosarcoma cell line in vitro and to explore the action mechanisms of the Pteris
multifida Flavones. Methods ：Pteris multifida preparation was made by ehanol，the effect of the different
concentrations of Pteris multifida Flavoneson the experimental metastasis ability of MG-63 cells was
observed by scratch test and Transwell metastasis experiments.The levels of IL-6 protein in MG-63 cells
were detected by Western Blotting. Results ：Comparing with control group，the Pteris multifida Flavones（5
and10 g·L-1）inhibited the MG-63 cells wound closure significantly at 24 hours time points and decreased
the number of cells passing through filter membrane. The levels of IL-6 protein in MG-63 cells were
decreased significantly after treated with the Pteris multifida Flavones. Conclusion ：The Pteris multifida
Flavones is able to inhibit the metastasis ability of MG-63 cells. The action mechanisms of the Pteris
multifida Flavones are related to the inhibition of IL-6 protein levels in MG-63 cells.
Key words ：Pteris multifida Flavones ；MG-63 cells ；IL-6 ；metastasis
DOI：10.13194/j.jlunivtcm.2013.01.44.kongwx.064
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1 5 卷 辽 宁 中 医 药 大 学 学 报
过氧化物酶标记的二抗购自北京中杉金桥公司。
1.1.4 仪器
Primo R型低温高速离心机（德国Heraeus公
司），CO2培养箱（美国Forma公司），倒置荧光显微
镜（Zeiss公司），HFsafe-1500 型生物安全柜（HEAL
FORCE公司），Transwell小皿（Millipore公司），3633
型 高 压 消 毒 锅（美 国Yamato scientificwc公 司），
HP-8453紫外-可见分光光度计（惠普公司），梅特
勒-托利多AG245电子分析天平（瑞士梅特勒-托
利多公司）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
MG-63细胞置37℃、5% CO2的培养箱，用含
10%胎牛牛血清以及青、链霉素各100 U·mL-1的
RPM1640培养液培养。倒置显微镜观察细胞生长
情况，0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞
用于实验。
1.2.2 凤尾草总黄酮制备
取凤尾草200 g，粉碎后，用体积分数70%的乙
醇溶液，料液比1∶20，在60℃温度下提取2次，每次
2 h[6]。合并提取液，经冻干得固体5.0 g，将其溶解于
500 mL PBS溶液，15000 r·min-1高速离心3次，每
次15 min，取上清液，经0.22 μm滤膜过滤除菌后4
℃冰箱保存。得到的溶液以芦丁为对照，NaNO2-A1
（NO）3-NaOH显色，利用紫外分光光度法测定总
黄酮含量[7]。最终将溶液配制成总黄酮含量为10
mg·mL-1（以芦丁计）保存备用。
1.2.3 细胞形态学观察
将MG-63细胞悬液接种于6孔培养板，每孔
1 mL，分别加入100 μL不同浓度（10、5、2.5、1.25
g·L-1）的凤尾草总黄酮溶液及等量PBS作为对照，
常规培养。培养24 h后于倒置相差显微镜下直接观
察培养板中肿瘤细胞形态特征。所有浓度下的培养
均重复3次，以典型结果作为最终数据。
1.2.4 细胞划痕实验
将MG-63细胞铺满6孔培养板，待细胞贴壁长
满后进行划痕，PBS洗1遍，更换为无血清培养基，
分别在0 h和24 h后观察划痕距离并拍照。
1.2.5 Transwell实验
取 指 数 生 长 期 的MG-63细 胞，胰 酶 消 化，
RPM1640培养基制备细胞悬液，细胞计数。调整细
胞数为每100 μL悬液含5×104个细胞进行铺板。
24孔培养板中每孔加入600 μL含15%小牛血清的
RPM1640完全培养基，在Transwell小室的上室分别
加入100 μL MG-63细胞悬液，各含5×104个细胞，
最后上室加入10 μL 1% BSA，使BSA最终浓度为
0.1%，以保持上室内的渗透压。加入不同浓度的凤
尾草总黄酮100 μL，37 ℃、5% CO2培养箱常规培养
15 h。取出小室用90％乙醇固定，0.1％结晶紫溶液
染色，置于显微镜下观察并拍照，随机选取4个低倍
视野（×400）进行细胞计数，并计算平均值。实验
重复3次。
1.2.6 Western blot实验
分别取凤尾草总黄酮处理前后的MG-63细胞
均约5×106个，加入300 μL细胞裂解液，冰上裂
解30 min后转移至1.5 mL EP管中，12000 r·min-1
4 ℃离心4 min，取上清液置于-20℃保存。BCA法
测定蛋白浓度。每个泳道上样蛋白量为40 μg，上
样于12%聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE电泳），
80 V电泳30 min，120 V电泳90 min，电泳完毕后，将
蛋白转移至PVDF膜，用新鲜配制的含5%脱脂奶粉
的PBST液摇床上封闭2 h，加入IL-6抗体（1∶500）
及抗β-Actin抗体（1∶500），4℃反应过夜。然后将
膜取出，用PBST液洗涤3次，每次15 min，辣根过氧
化物酶标记的二抗（1∶3000）室温封闭1 h，然后用
PBST液洗涤3次，每次10 min，最后用化学发光法检
测，X-光片记录结果。
1.3 统计学处理
试验数据用 x—±s表示，用SPSS 17.0进行数据处
理，组间比较用t检验，P<0.05和P<0.01分别代表差
异显著和差异非常显著，所有实验均重复3次。
2 结 果
2.1 肿瘤细胞形态学变化
正常培养条件下生长的MG-63细胞形态规
则，轮廓清晰，胞体透亮，贴壁良好 ；而以5 g·L-1
和10 g·L-1凤尾草总黄酮处理后，肿瘤细胞生长
缓慢，胞体皱缩，部分细胞破碎，总体呈分散悬浮生
长，贴壁现象减弱甚至消失。当使用较低浓度（2.5
与1.25 g·L-1）凤尾草总黄酮处理MG-63细胞时，
其生长表型同正常细胞没有明显变化（结果未给
出）。（图1）
0 g·L-1 5 g·L-1 10 g·L-1
图1 凤尾草总黄酮对人骨肉瘤
MG-63细胞生长表型的影响
2.2 划痕实验
划痕实验中通过划痕愈合程度的比较可以判
断凤尾草总黄酮对MG-63细胞迁移能力的影响
情况。相同条件培养24h后，未经凤尾草总黄酮
处理的MG-63细胞运动迁移基本完全覆盖了划
痕区域。相反的，加入凤尾草总黄酮以后，MG-63
细胞的迁移能力明显减弱，细胞间划痕的距离缩
短趋势减缓，并且凤尾草总黄酮浓度越高MG-63
细胞的迁移受阻越明显。当凤尾草总黄酮浓度
为10 g·L-1时，细胞覆盖区域面积占原有划痕的
55.7%。（表1）
表1 凤尾草总黄酮对人骨肉瘤MG-63细胞迁移能力的影响
MG-63细胞培
养时间（h）
凤尾草总黄酮浓度（g·L-1）
0 5 10
0 0 0 0
24 97.5% 72.3%b 55.7%c
注 ：表中数据代表MG-63细胞覆盖区域占起始划痕面
积的百分比。b和c分别代表P<0.05和P<0.01。
2.3 Transwell实验
相较于未进行药物处理的MG-63细胞，经5
g·L-1和10 g·L-1凤尾草总黄酮处理后，穿膜细胞
的数量分别减少到正常条件下的59.5%和20%（表
2）。
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辽 宁 中 医 药 大 学 学 报 1 5 卷
表2 凤尾草总黄酮对人骨肉瘤
MG-63细胞穿膜能力的影响
MG-63细胞培
养时间（h）
凤尾草总黄酮浓度（g·L-1）
0 5 10
0 0 0 0
24 100% 59.5%b 20%b
注 ：表中数据代表经凤尾草总黄酮处理MG-63细胞的
穿膜数量与对照组穿膜细胞个数百分比。b代表P<0.05。
2.4 Western blot
已有证据表明细胞因子IL-6参与肿瘤细胞的
迁移过程，本研究通过Western blot 对凤尾草总黄酮
处理的骨肉瘤MG-63细胞中IL-6蛋白水平的变化
进行了检测。结果显示，经凤尾草总黄酮处理过的
MG-63细胞中IL-6表达水平较对照组明显降低，其
蛋白总量随着凤尾草总黄酮浓度的增加而减少。（图
2）
0 g·L-1 5 g·L-1 10 g·L-1
图2 凤尾草总黄酮对人骨肉瘤MG-63
细胞中IL-6表达水平的影响
3 讨 论
骨肉瘤（osteosarcoma），是最常见的骨恶性肿
瘤，它来源于有成骨潜能的间叶细胞，由恶性增
殖的肉瘤细胞直接产生肿瘤性骨样组织或不成
熟骨。一般多发于15~25岁，但在任何年龄均可
发生，男性青少年多见，男女之比约为2∶1，最常
见发病部位依次为股骨远端、胫骨近端、肱骨近端
和骨盆，以干骺区发病为主，肿瘤还可穿过骨骺侵
犯关节。该瘤恶性程度甚高，预后极差，截肢后
3~5年存活率仅为5%~20%，近年来，随着手术、放
疗、化疗、免疫治疗等各种治疗方法的应用，骨肉
瘤患者的5年生存率有大幅度提高。然而，仍有
30%~40%的骨肉瘤患者发生转移，尤其是肺部转
移，引起患者死亡。骨肉瘤的转移是多因素、多步
骤、多阶段综合作用的结果[9-11]。肿瘤转移抑制基
因的发现对治疗方案的选择、肿瘤患者预后的评
估都有重要的意义。
众多研究表明，骨肉瘤细胞的转移过程伴随着
多种细胞因子的异常表达[10]。细胞因子是由多种细
胞产生，具有广泛调节功能的多肽分子，参与调控细
胞的增殖分化及细胞间的相互作用[11]。根据产生细
胞种类和功能的不同，细胞因子可分为多种，且肿瘤
细胞亦可合成或分泌其中部分种类的细胞因子[12]。
骨肉瘤细胞自身合成或分泌的细胞因子具有多种调
节功能，其中促进肿瘤细胞离散和迁移的因子，如白
细胞介素6（IL-6），成为当前研究的热点[13]。
IL-6是一种多效性的细胞因子，参与肿瘤细胞
的生长和增殖，并且能促炎、促迁移和促肿瘤血管生
成。已有实验及临床数据显示，IL-6及其受体的异
常高表达与肿瘤的发病相关，并应用于肿瘤的诊断、
治疗及预后[14]。
我国是天然药物大国，应用中草药治疗肿瘤
历史悠久，许多中药材因具有抗肿瘤作用被深入研
究[15-17]。现代药理研究表明，凤尾草具有抗肿瘤效
果，常与其他药物配合使用，应用于食管癌、直肠癌
及妇科肿瘤的治疗。凤尾草全草醇提取物主要成分
为凤尾草总黄酮，有多种生理活性，如抗菌、抗炎及
抗肿瘤等[2]。然而，对其抗肿瘤机制方面的研究较
少，本研究中，我们以骨肉瘤MG-63细胞为评价体
系，初步研究凤尾草总黄酮对骨肉瘤细胞转移能力
的影响，并对其中的相关机制做出了初步揭示。
结果显示凤尾草总黄酮对骨肉瘤MG-63细胞
的迁移有明显的抑制作用，且其与用药浓度呈正向
相关。同时，迁移能力减弱细胞中细胞因子IL-6的
表达被强烈抑制。据此，我们推测凤尾草总黄酮抑
制骨肉瘤MG-63细胞的迁移与其抑制细胞内IL-6
的蛋白表达水平有关，这也符合已有研究结果。关
于凤尾草总黄酮的化学结构与骨肉瘤MG-63细胞
核酸构成和蛋白质空间结构的改变正在进一步研
究。◆
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