全 文 ：·论著·
槐耳颗粒逆转人乳腺癌细胞 MCF-7耐药的
初步机制
李戎　谢莎　张莉　王先明
【摘要】　目的　研究槐耳颗粒逆转乳腺癌细胞株 MCF-7耐药的初步机制 。方法　使用四甲基偶氮
唑蓝(MTT)比色法测定敏感 /耐药乳腺癌细胞 MCF-7-S/A对单药阿霉素(ADM)和槐耳颗粒的药物毒
性 ,耐药倍数和槐耳颗粒对 MCF-7 /A的耐药逆转倍数 ,分别采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应和免疫
组化 SP法测定多药耐药基因 mdr1、多药耐药相关蛋白基因 MRP的 mRNA和其相应的表达产物 P-gp、
MRP蛋白 ,在 MCF-7 /S及非细胞毒性剂量的槐耳颗粒处理前后 MCF-7 /A上的表达 。结果　非细胞毒性
剂量(0.01 mg/ml)的槐耳颗粒能显著降低 ADM对 MCF-7 /A的 IC50(5.06μm),与逆转前 MCF-7/A的
IC50(25.8μm),相比差异有统计学意义(P<0.01),其逆转倍数为 5.1倍;0.01 mg/ml的槐耳颗粒使
MCF-7 /A细胞的耐药基因 mdr1、MDR-1的 mRNA以及相应的 P-gp、MRP蛋白的表达水平均下调 ,与未加
槐耳颗粒处理的对照组 MCF-7 /A相比有显著性差异(P<0.01)。结论　非细胞毒性剂量槐耳颗粒具有
逆转 MCF-7 /A细胞耐药性的作用 ,逆转机制和其耐药基因 mdr1、MDR-1的 mRNA以及相应的 P-gp、MRP
蛋白的表达水平下调相关 ,暗示槐耳颗粒是一种有潜力的耐药逆转剂 。
【关键词】　逆转耐药;MCF-7 /A;槐耳颗粒;多药耐药
Primarystudyonthemechanismofreversaldrug-resistanceofhumanbreastcancercellineMCF-7by
HuaierGranule　LIRong, XIESha, ZHANG Li, etal.ShenzhenSecondPeople sHospitalShenzhen
518035 , China
【Abstract】　Objective　Toinvestigatethemechanismofthereversaldrug-resistanceofhumanbreast
cancercelMCF-7byHuaierGranule.Methods　MTTmethodwasusedtodetecttheceltoxicity, drug-resist-
antmultipleandreversingmultiple;fluorescentquantitationreversetranscriptionpolymerasechainreactionand
immuno-histo-chemicalSPstainingwasusedtodetectthemRNAlevelofmultidrugresistance1(mdr1), multi-
drugresistance-associatedprotein(MRP)andtheircorrespondingproteinsP-gp, MRPexpressionofdrugsensi-
tivecellineMCF-7 /SanddrugresistantcelllineMCF-7/Abeforeandaftertreatedbynon-toxicitydoseof
HuaierGranule, respectively.Results　Non-toxicitydose(0.01 mg/ml)ofHuaierGranulecouldsignificantly
reducetheIC50(5.06μm)ofADMtotheMCF-7 /A, comparedtotheIC50(25.8μm)ofADMtotheMCF-7 /
Awithoutreverseing(P<0.01), itsreversingmultiplewas5.1 times.0.01 mg/mlHuaierGranulecouldre-
markablydown-regulatethemRNAlevelofmdr1 , MRPandtheircorrespondingproteinsP-gp, MRPexpression
ofMCF-7 /A, anditshowedsignificantreduction(P<0.01)comparedtotheirexpressionofcontrolgroupwith-
outHuaierGranuletreatment.Conclusion　Non-toxicitydoseofHuaierGranulecouldreversethedrug-resist-
anceofMCF-7 /A, andthereversalmechanismisrelatedtothedown-regulationofthemRNAlevelofmdr1 ,
MRPandtheircorrespondingproteinsP-gp, MRPexpression.ItimpliedthatHuaierGranulecouldbeapotential
reversalagentforclinic.
【Keywords】　Drug-resistantreversal;MCF-7 /A;HuaierGranule;MDR
　　作者单位:518035 深圳市第二人民医院乳腺疾病诊疗中心
　　化疗是乳腺癌治疗的重要手段 , 却常因多药耐药现象
(MDR)而失败 , 因此克服 MDR一直为人们关注。 已发现的
许多逆转多药耐药的药物 , 由于毒副作用大难以在临床上推
广应用。槐耳是一种药用真菌 , 槐耳颗粒是从槐耳菌质中提
取并作为国家中药一类新药 ,除了良好的促肿瘤细胞凋亡作
用和免疫增强剂作用 , 也能促进肺癌耐药细胞株耐药性发生
逆转 , 无毒副作用 [ 1, 2] 。本研究为验证槐耳颗粒在无毒剂量
时能否增强乳腺癌多药耐药细胞株 MCF27/A对阿霉素的敏
感性 , 进行体外实验并初步研究其逆转耐药所涉及的基因表
达。进一步发挥槐耳颗粒在乳腺癌化疗中的增强作用和提高
患者生存率提供依据 。
1　资料与方法
1.1　设备及主要试剂　槐耳颗粒由江苏启东盖天力制药有
限公司生产 , ADM来自广东金泰嵘医药科技有限公司 , 胎牛
血清和 RPMI1640购自 GIBCO, P-gp和 MRP蛋白检测试剂盒
来自达科为公司 , MTT为 Sigma产品 , 其余试剂均购自广州试
剂公司。塑料培养瓶和培养板均为美国 Costar公司产品 , 酶
标仪为 BioRAD公司产品 450型 , 实时检测 PCR仪为 ABI
Prism7000型。
1.2　细胞株及细胞培养　人乳腺癌细胞株 MCF-7/S及相应
的耐阿霉素细胞株 MCF-7/A均由中山大学肿瘤医院友情赠
送并由我研究室保存。在 37℃、 5%的 CO2饱和湿度培养箱
中 , 分别培养于含 10%胎牛血清 、青链霉素各 100 U的 RPMI
1640培养液中 , 2 ～ 3d传代一次。 MCF-7/A细胞除上述培养
条件外 , 需加入 1.0 μg/ml的 ADM, 以维持细胞的耐药性 , 但
MCF-7/A实验前 2周无药培养。
1.3　细胞毒性实验　用胰酶消化细胞后 ,调整敏感株和耐药
株细胞浓度为 2 ×104 /ml, 每孔 100μl接种于 96孔板中。实
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验分 4组 , 每组均设 3个平行孔 , 实验组为槐耳颗粒组和
ADM组 , 对照组为未加药的空白对照 , 实验组两组均分别从
第 1孔到第 12孔倍比稀释 , 每孔所加的药物最终为 100 μl。
将 96孔板置于 37℃、5%CO2孵箱中 ,培养 48 h后 ,每孔加入
MTT液 20 μl(生理盐水配制 , 5mg/ml), 每孔 20μl, 继续培养
4 h后 , 去掉上清液 , 显微镜下见细胞周围形成蓝紫色针状甲
簪结晶;加入二甲基亚砜(DMSO), 每孔 100 μl, 振荡溶解甲
簪 , 5 min内用全自动酶标仪测定每孔的 A560 nm值 ,取三个
平行孔的平均值 , 按公式计算细胞抑制率(IR):IR=〔1-实验
组 A均值 /对照组 A均值〕×100%, 并求出 IC50值(半数细
胞抑制剂量)及耐药倍数 (MCF-7/A的 IC50/MCF-7/S的
IC50)。选择细胞抑制率 <5%的药物浓度为槐耳颗粒的无毒
剂量。
1.4　MTT法测定耐药细胞对 ADM的敏感性:实验方法同 3,
只是细胞均为耐药细胞。实验设计分为 2组:①倍比稀释的
ADM组;②无毒剂量槐耳颗粒 +倍比稀释的 ADM组;以未加
药的细胞做空白对照。计算 IC50值 ,求出逆转倍数(未加槐
耳颗粒组的 IC50/加槐耳颗粒组的 IC50)。
1.5　荧光定量 PCR法测定 MDR1和 MRP基因表达水平　
细胞培养同前 , 实验分 3组:①敏感细胞 MCF-7/S组;②耐药
细胞 MCF-7/A组;③耐药细胞 MCF-7/A+无毒剂量槐耳颗粒
组。继续培养 24h后 , 用 PBS洗 3次 ,收集细胞 , 按荧光定量
RT-PCR试剂盒说明的条件操作 , 大致是:Trlzol试剂提取各
组总 RNA, 经 AMV逆转录酶系统合成 cDNA, 在 50μl反应体
系中扩增 , 测定各组 MDR1和 MRP基因表达水平。 Mdr1、
MRP引物 、探针由上海生工公司合成。 Mdr1上游是:cccatcat-
tgcaatagcagg, 下游是:gttcaaactctgctcctga, 探针为:atcgctactgaag-
caatagaaaacttcc;MRP上游是:tgacttcgtgtcagcc, 下游是:gtccat-
gatggtgttgagcc, 探针为:ctgccgtggcctcatccacaca;β-actin上游是:
gtcatcaccattggcaatgag,下游是:cgtcacactcatgatggagtt, 探针为:tc-
ctgggcatggagtcctg。引物 、探针序列方向是 5端至 3端。
1.6　免疫组化 SP法检测 MCF-7细胞 P-gp和 MRP蛋白的表
达水平　细胞培养同前 , 将所用细胞贴于无菌玻片制成细胞
爬片。实验处理分 3组:①敏感细胞 MCF-7/S组;②耐药细
胞 MCF-7/A组;③耐药细胞 MCF-7/A加无毒剂量槐耳颗粒
组。药物处理 24h后 , 用 PBS洗 3次 , 70%无水乙醇固定后
进行 SP法染色 , 按试剂盒说明的条件操作 , 检测各组细胞 P-
gp和 MRP蛋白表达水平。判断标准:以 ++++、 +++、
++、 +、-进行染色判定 , 超过 ++者为表达阳性。
1.7　统计学方法　全部资料用 SPSS12.0软件进行统计分
析 , 统计学比较用 t或 χ2检验。
2　结果
2.1　槐耳颗粒和 ADM对 MCF-7/S及 MCF-7/A生长的影响
　根据实验结果 ,槐耳颗粒对两种细胞株抑制率和其浓度呈
正相关。槐耳颗粒在 0.01 ～ 0.1mg/ml时 ,对敏感细胞 MCF-
7/S和耐药细胞 MCF-7/A均无明显的抑制作用 , 细胞存活率
>80%;当槐耳颗粒浓度为 0.01 mg/ml时 , 细胞存活率 >
95%, 故选择 0.01mg/ml槐耳颗粒作为 MCF-7/S和 MCF-7/A
非细胞毒性剂量。槐耳颗粒对 MCF-7/S和 MCF-7/A的 IC50
分别是 1.98 mg/ml和 2.23 mg/ml,差异无统计学意义(P>
0.05),说明 MCF-7/A细胞对槐耳颗粒不具有耐药性。 ADM
对 MCF-7/S和 MCF-7/A的 IC50则分别是 0.49 μm和 25.8
μm,耐药株较敏感株细胞对 ADM耐药倍数为 52.6倍。
2.2　0.01 mg/ml的槐耳颗粒对 MCF-7/A细胞 MDR的逆转
作用　根据结果 , 不加槐耳颗粒的耐药株对 ADM的 IC50是
25.8 μm, 经 0.01 mg/ml的槐耳颗粒与 ADM联合作用后 ,
MCF27/A对各组 ADM的敏感性均增强 , 其 IC50明显下降至
5.06 μm,逆转倍数为 5.1倍。
2.3　荧光定量 PCR测定 MCF-7细胞 MDR1和 MRP的 mR-
NA表达水平的变化　从结果看 ,多药耐药基因 mdr1和 MRP
的 mRNA在 MCF-7/A中的表达分别是其在 MCF-7/S的表达
强度的 128倍和 51倍 , 两者差异均有显著性(表 1)。 0.01
mg/ml槐耳颗粒处理 MCF-7/A细胞后 , 其 mdr1和 MRP的
mRNA的表达与处理前 MCF-7/A相比 , 都有显著性下调(P<
0.01),但仍然明显高于 MCF-7/S的细胞(P<0.01)。
表 1　无毒剂量(0.01 mg/ml)槐耳颗粒对 MCF-7细胞mdr1和 MRP的 mRNA表达水平的影响(x±s)
组别 细胞内 MDR1cDNA拷贝数 细胞内 MRPcDNA拷贝数
MCF-7 /S 5551±238.0 9054±107.0
MCF-7/A 710600±5102.0＊ 461800±2633.0＊
MCF-7/A+槐耳 293610±1600.0＊■ 186040±960.0＊■
　　注:＊与对照组 MCF-7 /S比较 , P<0.01;■与对照组 MCF-7/A比
较 , P<0.01
2.4　SP法检测 MCF-7细胞 P-gp和 MRP蛋白的表达水平　
从显微镜下观察染色结果看 , MCF-7/A中 P-gp和 MRP的蛋
白表达都呈强阳性 ,而敏感细胞 MCF-7/S中 P-gp和 MRP的
蛋白表达均为阴性(表 2);0.01mg/ml槐耳颗粒作用于 MCF-
7/A细胞后 , 其 P-gp和 MRP的蛋白表达比未处理的要弱 , 但
仍然是阳性表达。即 SP染色结果和荧光定量 PCR的检测是
一致的。
表 2　无毒剂量(0.01 mg/ml)槐耳颗粒对 MCF-7细胞P-gp和 MRP的蛋白表达的影响
组别 P-gp MRP
MCF-7 /S - -
MCF-7/A ++++ ++++
MCF-7/A+槐耳 ++ ++
3　讨论
近年来乳腺癌的发病率一直呈现上升趋势 , 也是引起女
性死亡的重要肿瘤之一 , 其中临床化疗过程中产生多药耐药
性(MDR)导致化疗失败是乳腺癌治疗的常见现象。 应用
MDR逆转剂是克服肿瘤细胞耐药 , 提高化疗效果的一种重要
手段。引起耐药的机制很多 , 目前研究最多的是多药耐药基
因(MDR1)及其编码的细胞膜 P-糖蛋白(P-gp)。但仍有研究
表明在乳腺癌的多药耐药机制中 , 除了 mdr1基因起主导作用
外 ,其它的耐药基因也很可能同时发挥着重要作用 [ 3] 。故单
单针对一种耐药因素比如 MDR1的干预 , 可能会引起肿瘤其
它耐药基因例如 MRP反馈式的表达增强 ,影响干预效果。
文献显示 MRP与 mdr1有相似之处 , 它们同属于 ABC家
族 ,两者有 15%的氨基酸序列相同 ,都有药物泵作用 , 但 MRP
与 mdr1作用的化疗药物明显不同 , 并且 MRP在乳腺癌组织
中的阳性表达率(70% ～ 100%)比 mdr1的表达率(50%左
右)还要高 [ 4] 。所以进行乳腺癌的多药耐药逆转研究时 , 除
了要阻断 mdr1基因的表达 , 同时也要考虑对 MRP基因的抑
制 , 或许能更全面地提高乳腺癌的化疗作用。
本研究的槐耳颗粒或许是这样一种可能的化疗耐药逆转
剂。槐耳颗粒是从槐耳菌质中提取的多种有效成分 , 其成品
(金克-槐耳颗粒 ,国家一类新药)对肝癌 、肺癌 、胃癌 、乳腺癌
均有独特疗效。过去认为其作用机制主要是提高机体自身免
疫力从而达到抑瘤作用 , 最近研究表明 ,槐耳颗粒还通过诱导
肿瘤细胞凋亡达到抑瘤作用 [ 5, 6] 。
本研究证实乳腺癌耐药细胞株 MCF-7/A较其敏感株
MCF-7/S细胞对 ADM的耐药倍数为 52.6倍, 其原因之一是
MCF-7/A表达的 mdr1和 MRP的 mRNA分别是其在 MCF-7/S
的表达强度的 128倍和 51倍;槐耳颗粒在无细胞毒性剂量
0.01 mg/ml时能增强 ADM对其耐药株 MCF-7/A细胞的毒性
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甲泼尼龙序贯治疗哮喘重度急性发作的
临床研究
李响　朱福音　陈萍　赵海涛　韩玉英
【摘要】　目的　评价甲泼尼龙局部序贯治疗哮喘重度急性发作的疗效 。方法　入选急性重度哮喘 52
例 ,随机分成 A组 28例与 B组 24例 ,两组均给于甲泼尼龙 80mg,静脉滴注 2次 /d,用 3d, A组序贯口服甲
泼尼龙片 16 mg, 1次 /d,用 5d, B组序贯口服甲泼尼龙片 8mg用 2 d同时吸入沙美特罗 /丙酸氟替卡松 50
μg/250 μg, 2次 /d,用 5d。结果　静脉治疗第 3天后 ,两组各项指标组内比较均明显改善 ,序贯治疗后则
进一步改善 。至第 8天 , A组的 PEF值分别由治疗前的(186±92)L/min,上升至(321±102)L/min(P<
0.05), FEV1由(1.32±0.43)L,上升至(1.87±0.52)L(P<0.05)。B组的 PEF值由(192±88)L/min,上升
至(335±115)L/min, FEV1由(1.41±0.39)L,上升至(1.93±0.72)L(P<0.05)。两组组间比较无显著差
异(P>0.05)。 A、B两组痰嗜酸细胞计数分别由(0.45% ±1.3);(0.51%±1.9)减少至治疗后(0.07% ±
2.8);(0.04%±0.1),两组间比较无显著差异(P>0.05)。结论　对哮喘重度急性发作应用口服或吸入激
素疗效相似且安全可行 。
【关键词】　哮喘;甲泼尼龙;糖皮质激素;序贯治疗
ClinicalResearchofMethylprednisoloneSequentialtreatmentofacuteseverepersistentasthma　LIXang,
ZHUFu-yin, CHENPing, etal.DepartmentofRespiratoryDiseasesCentralHospitalofFuShun, LiaoNingFuShun,
113006 , China
【Abstract】　Objective　Comparativesystemichormonetreatment, evaluationofmethylprednisolone/fluti-
casonepropionatelocalsequentialtreatmentofsevereacuteepisodeofasthmatreatment.Methods　Selectedse-
vereacuteasthmawere52cases.28weredividedintoGroupAandGroupBwere24.Bothgroupsweregivenin-
travenousmethylprednisolone80mgbid×3 d.Agroupsequentialoralmethylprednisolonetablets16mgqd×5d.
GroupBsequentialoralmethylprednisolonetablets8 mg×2 dAtthesametime, inhaledsalmeterol/fluticasone
propionate50μg/250μg, bid×5d.Results　Intravenoustreatmentofthe3 days, 2 indicatorscomparisongroup
weresignificantlyimprovedafterthesequentialtherapywasfurtherimproved.To8 days, AgroupofPEFRvalue
fromthepre-treatmentof186 ±92L/min, roseto321±102L/min(P<0.05), FEV1 from1.32±0.43L, roseto
1.87 ±0.52L(P<0.05).GroupBofthePEFRvaluesfrom192±88L/min, roseto335 ±115L/min, FEV1
from1.41±0.39L, roseto1.93 ±0.72 L(P<0.05).Betweenthetwogroupsshowednosignificantdiference
(P>0.05).Sputumeosinophilcountby0.45%±1.3;0.51%±1.9 aftertreatmentdecreasedto0.07%±2.8;
0.04%±0.1, betweenthetwogroupsshowednosignificantdiference(P>0.05)Conclusion　Severeacuteasth-
maatackoralapplicationorinhalationofsimilareficacyandsafetyofhormonepossible.
【Keywords】　Asthma;Methylprednisolone;Glucocorticoids;Sequentialtherapy
　　作者单位:113006 辽宁省抚顺市中心医院呼吸内科(李响　朱福音　韩玉英);
沈阳军区总医院全军呼吸变态反应疾病诊治中心(陈萍　赵海涛)
作用 ,其逆转倍数为 5.1倍 ,而荧光定量 PCR说明 0.01 mg/ml
槐耳颗粒处理 MCF-7/A细胞后 ,其 mdr1和 MRP的 mRNA的
表达与处理前 MCF-7/A相比, 都有显著性下调(P<0.01),暗
示 5.1倍的耐药逆转原因可能是 mdr1和 MRP的 mRNA的表
达下降;免疫组化 SP染色结果也说明这种逆转与槐耳颗粒下
调 MCF-7/A细胞的 P-gp和 MRP蛋白的表达相关。
总之 , 中药槐耳颗粒与化疗药合用不仅能增强机体免疫
力 , 还具有逆转多药耐药的功能 , 而且作用靶点多 , 毒副作用
小 , 具备作为 MDR逆转剂的必备特征。虽然其机制还未完全
明确 , 但对其进行深入研究可为拓展 MDR逆转剂领域 , 增强
肿瘤化疗效果提供了新的思路。
参　考　文　献
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