全 文 ：基金项目:国家自然科学基金资助课题(30271537)
作者简介:冷萍 ,女 ,硕士研究生 *通讯作者:郭秀丽 ,女 ,副教授 ,硕士生导师 Tel:(0531)88382542 E-m ail:guox l@ sdu. edu. cn
羽苔素 E体外抗真菌活性及逆转氟康唑耐药的初步研究
冷萍 1, 2 ,郭秀丽 1* ,杨月 1 ,娄红祥 1(1.山东大学药学院 ,济南 250012;2.青岛大学医学院附属医院药剂科 ,山东 青岛 266003)
摘要:目的 评价白色念珠菌对羽苔素 E的体外敏感性 , 并观察羽苔素 E和氟康唑合用对白念敏感株和耐药株的联合抗真菌
作用。方法 采用微量稀释法 , 测定 15株白念敏感株和 4株白念耐药株对羽苔素 E的敏感性 ,以最低抑菌浓度(M IC)表示。
同时观察羽苔素 E与氟康唑合用对白念敏感株和耐药株的联合抗真菌作用。结果 羽苔素 E对敏感株的 M IC值为 16 m g
L - 1 , 对耐药株的 M IC值与敏感株基本一致。羽苔素 E与氟康唑合用 , 对敏感株和耐药株分别表现出相加和协同的抗真菌活
性 , 并明显减少氟康唑的用量。结论 羽苔素 E具有中等的抗真菌活性 , 与氟康唑合用对耐药菌株表现出协同的抗真菌作
用 , 提示羽苔素 E有较好的抗真菌作用并有逆转氟康唑耐药的潜力。
关键词:羽苔素 E;氟康唑;白色念珠菌;逆转耐药
中图分类号:R978.5 文献标识码:A 文章编号:1001 -2494(2007)05 - 0349 - 04
Prmi ary Study on AntifungalActivities and Reversal of F luconazole Resistance ofP lagiochin E
LENG Ping
1, 2 , GUO X iu-li1* , YANG Yue1 , LOU Hong-x iang1 (1. S chool of Pharm acy, Shandong University, J inan
250012, Ch ina;2.Affilia ted Hospita l of Q ingdao University, Qingdao 266003, Ch ina)
ABSTRACT:OBJECTIVE To investiga te the antifungal activ ity of plag ioch in E against the stra ins ofCandida a lbicans in vitro, and
the interac tions of fluconazo le w ith p lag iochin E aga inst the sensitive and resistan t strains.METHOD S A bro th m icro-d ilution me thod
w as used to de term ine theM ICs o f plag ioch in E for the fifteen sensitive and four re sistant stra ins. The com bina tion e ffect o f p lag iochin
E and fluconazo le w as also assessed.RESULTS The M IC of plag ioch in E w as 16 mg L - 1 aga inst the fifteen sensitive
stra ins.P lag iochin E had the sam eM IC aga inst resistan t strains. A fte r the adm in istra tion of p lag iochin E and fluconazo le at the same
tim e, M IC s of two drugs w ere lowe r aga inst bo th re sistant strains and sensitive one s. Add itive effec t on sensitive stra ins and syne rg ic
e ffec t on resistant stra ins w ere obse rved respective ly. CONCLUSION P lag iochin E ha s a m oderate but significant an tifungal action
on the sensitive and re sistant strains o f C. albicans, and show s additive or synergy effec t after the adm inistration of flucon-
a zole.P lagioch in E can be use fu l for an tifunga l therapy and has a po tentia l action on reve rsing the re sistance ofC. albicans against flu-
conazo le.
KEY WORDS:p lag io chin E;fluconazo le;Cand ida albicans;reve rsing re sistance
近年来真菌感染发病率逐年上升 。主要原因包
括广谱抗生素的滥用 、HIV感染 、癌症化疗和器官移
植引起的免疫抑制等 。特别是持续性免疫缺陷患
者 ,真菌感染率很高 [ 1] 。由于唑类药物尤其是氟康
唑 (FCZ)的疗程确切 ,耐受性好 ,因而在临床上广泛
应用。但随着氟康唑大剂量 、长疗效使用 ,使白色念
珠菌和非白色念珠菌感染的耐药率明显上升 ,临床
治疗失败日趋增多 。因此 ,新型有效的抗真菌药物
的研究和开发应用十分重要。
羽苔素 E(p lag ioch in E , PLE)是一种新型的双
联苄类化合物 ,是由苔藓植物中提取分离得到的一
系列天然植物酚类化合物之一 ,分子式:C28H24O4 ,
其母核为羽苔素 , 结构式如图 1。应用薄层色谱生
物自显影技术进行的活性筛选实验证实 ,羽苔素 E
具有抗白色念珠菌活性 。
图 1 羽苔素 E的结构
Fig 1 S tructure o f P lag iochin E
本研究测定了羽苔素 E对 15株临床新近分离
的白色念珠菌的最低抑菌浓度 (M IC);以抑菌浓度
分数 (FIC)指数评价了羽苔素 E与氟康唑的联合抗
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真菌作用。同时采用体外诱导的方法获得了耐氟康
唑的白念菌株 ,检测了羽苔素 E对氟康唑耐药株的
抗真菌作用 ,并观察了其与氟康唑合用对耐药株的
作用 ,以期观察羽苔素 E能否减少氟康唑的用量 ,
提高耐药株对氟康唑的敏感性 。
1 材 料
1.1 菌株
15株白色念珠菌均由山东大学第二医院检验
科从深部真菌感染的住院患者中分离培养;2株白
色念珠菌耐药菌 (山东省齐鲁制药厂真菌研究中
心 ),其中 1株来自阴道分离 , 1株来自痰培养;用于
药敏质控的标准菌株近平滑念珠菌 ATCC22019、白
色念珠菌 ATCC10231(山东省卫生防疫站 )。菌株
经特殊试验鉴定后保存在 - 80 ℃冰箱内直到使用 。
1.2 抗真菌药物
羽苔素 E由山东大学药学院天然药物化学实
验室提供 ,为羽苔素 E单体 ,无色块状结晶 ,熔点
194.8 ～ 195.8 ℃(甲醇)。氟康唑(山东省生物药物
研究院 ,批号 030301,纯度 99.8%)。用二甲基亚砜
(DMSO)将羽苔素 E配成 20 480 mg L -1 ,用无菌
蒸馏水将氟康唑配成 5 120mg L -1的贮存液 ,分装
后 -20 ℃冰箱保存待用。
1.3 培养基
沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA):取 65 g沙堡葡
萄糖琼脂 , 20 g琼脂放入 1 000mL去离子蒸馏水中
充分搅拌混匀后 ,高压灭菌 ,每培养皿加入 15 mL,
冷却后 4 ℃保存待用。酵母浸膏-蛋白胨-葡萄糖
(YEPD)液体培养基:2%葡萄糖 20 g, 2%蛋白胨 20
g, 1%酵母浸膏 10 g,加入 1 000 mL去离子水中 ,充
分搅拌后高压灭菌 ,冷却后 4 ℃保存待用。 RPM I-
1640培养液:取 RPM I-1640(G ibco)10.4 g, 用约
800mL去离子蒸馏水溶解 , 加入吗啡啉丙磺酸
34.53 g,混匀后用 1mo l L -1NaOH调 pH为 7.0后
定容至 1 000 mL,用 0.22 μm滤器滤过灭菌后 4℃
保存待用。
2 实验方法
2.1 羽苔素 E的体外敏感性实验(M IC测定)
按美国国家临床试验标准化委员会 (NCCLS)
推荐的 M27-A方案 ,采用微量稀释法测定实验菌株
对羽苔素 E的敏感性 ,测定时每孔中菌悬液终浓度
约为(0.5 ～ 2.5)×103 cfu mL -1 ,羽苔素 E的浓度
范围为 0.25 ～ 512mg L - 1。培养及折点判定标准
参照 M27-A方案 [ 2] 。
实验中观察了不同浓度的 DMSO溶液对白色
念珠菌生长的影响 ,结果发现 ,当 DMSO浓度低于
4%时 ,对白色念珠菌的生长不会产生影响。本实验
中羽苔素 E溶液中 DMSO的终浓度均低于 3.5%。
2.2 羽苔素 E与氟康唑联合应用的抗真菌实验
采用微量稀释法测定羽苔素 E、氟康唑单独应
用时各自的最低抑菌浓度值及二者联合应用时的最
低抑菌浓度值 。具体实验步骤如 “ 2.1”项。羽苔素
E与氟康唑联合应用的实验结果通过计算 FIC来评
价 , FIC =(M IC羽苔素 E ,联合应用 ) /(M IC羽苔素
E,单独应用 )+(M IC氟康唑 ,联合应用 ) /(M IC氟
康唑 ,单独应用 )。评价标准:FIC≤0.5,表现为协
同作用;0.5
指数越小表示两药协同作用越强 [ 3] 。
2.3 体外诱导氟康唑耐药株
挑选经传代纯化的白色念珠菌 SDEY-24和
SDEY-09,接种于 10 mL不含氟康唑的 YEPD液体
培养基中 , 30 ℃振荡培养 ,当培养液中细菌数达到
10
8
cfu mL -1(A600 =0.8)时 ,取 0.1mL菌液分别加
入 10 mL含氟康唑 16 mg L- 1的 YEPD液体培养
基中 ,在培养液中细菌数再达到 108 cfu mL - 1时 ,再
取 0.1 mL菌液转种至含相同浓度氟康唑的 YEPD
培养基中继续培养 ,同时将诱导后的各代菌株 ,以体
积分数 30%甘油保存于 - 80 ℃冰箱中 ,测定其
M IC ,观察氟康唑诱导后各代菌株 M IC的变化 [ 4] 。
2.4 羽苔素 E单用及与氟康唑合用对白念耐药株
的抗真菌作用
采用微量稀释法测定羽苔素 E对白念氟康唑
耐药株的最低抑菌浓度 。并检测羽苔素 E与氟康
唑合用对白念耐药株的抗真菌作用。
3 结 果
3.1 羽苔素 E对白色念珠菌的抗真菌作用
实验 所 测 的 质 控 菌 株 近 平 滑 念 珠 菌
ATCC22019和白色念珠菌 ATCC10231对氟康唑的
M IC值均与 NCCLS规定的 M IC值相符合 ,证实本实
验条件符合 NCCLS的有关规定 ,所测定的实验结果
可信 。
临床分离的 15株白色念珠菌对羽苔素 E的
M IC为:最小抑菌浓度 (M IC r)为:16 ～ 32 mg L - 1 ,
最小抑菌浓度几何均数 (M ICq)20.15, 90%的菌株
生长受到抑制所需的最小抑菌浓度 , (M IC90)为 16
mg L- 1。
3.2 羽苔素 E与氟康唑联合应用的抗真菌实验
实验结果表明 ,当羽苔素 E与氟康唑联合应用
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时 ,羽苔素 E和氟康唑对白色念珠菌的 M IC值均有
不同程度的降低。羽苔素 E和氟康唑合用可显示
出相加的抗真菌活性 。其实验结果见图 2,表 1。
图 2 不同浓度氟康唑与羽苔素 E联合应用对白色念珠菌
生长影响
X -轴 ,氟康唑浓度(mg L -1);Y -轴 ,羽苔素 E浓度(mg L - 1);Z -轴 ,
与生长对照相比白色念珠菌生长比例。设定 5个标准判定药物的联合抗真菌
作用。 0,视觉上澄清 ,白念菌株生长 100%受抑制;25%,只有轻微混浊 ,白念
菌株生长 75%受抑制;50%,与生长对照组相比明显降低混浊度 ,白念菌株生
长 50%受抑制;75%,与生长对照组相比轻微降低混浊度 ,白念菌株生长 25%
受抑制;100%,与生长对照组相比混浊度无改变 ,白念菌株生长没有受到抑制
F ig 2 Com bina tion effects of plag ioch in E w ith fluconazo le on
Cand ida a lbicans
X - ax is, fluconazo le concentra tion (g L - 1);Y - ax is, P lagiochin E concentra-
tion (mg L - 1);Z - axis, the medium o f pe rcentage o fC.albicans g row th com-
pa rison w ith the drug free contro l.The comb ina tion antifunga l effe cts are evalua ted
in five ranks. 0 optica l clear, it means the C.albicans is inhibited by 100%;
25%, slightly hazy, it means theC.albicans is inh ibited by 75%;50%, prom i-
nent decrease in turb idity, it means the C.albicans is inhib ited by 50%;75%,
slightly dec rease in turbidity, it means theC.albicans is on ly inhibited by 25%,
compa red with d rug-free contro l;100%, no dec rea se in turbidity compa red w ith
drug-free control, itmeans theC.albicans g rowth is asw ell a s control, no antifunga l
effects was observed
表 1 羽苔素 E与氟康唑的联合抗真菌作用 .n =15
Tab 1 Comb ination antifunga l effec ts o f plagiochin E w ith flu-
conazo le.n=15
T ested compound FIC ranged M ean F IC Conc lusion
FCZ+PLE 0.531 ～ 1.125 0.697 9 Additive
3.3 诱导耐药性实验结果
临床分离的两株敏感白色念珠菌 SDEY-24和
SDEY-09对氟康唑均敏感 ,以 16 mg L -1的氟康唑
体外诱导 ,经不同时间 ,均诱导出耐药性 ,但两株菌
株体外传代所需的时间不同 , SDEY-24和 SDEY-09
菌株分别于第 7代 (35 d)和第 8代(38 d)M IC达 64
mg L -1 ,呈耐药性 ,见图 3。
3.4 羽苔素 E单用及与氟康唑合用对白念耐药株
的作用
图 3 白色念珠菌 SDEY-24和 SDEY-09在含 16 mg L - 1氟
康唑培养基上传代的 M IC变化
1 - SDEY-24;2 - SEDY-09
Fig 3 Varia tions of fluconazo le M IC s fo r strains of SDEY-24
and SDEY-09 in medium con taining 16 m g L -1 o f fluconazo le
1 - SDEY-24 strain;2 - SEDY-09 stra in
对氟康唑耐药株 ,羽苔素 E单独应用仍能表现
出与敏感株相似的抗真菌作用 。羽苔素 E和氟康
唑合用 ,观察到羽苔素 E能明显降低氟康唑对耐药
株的用量 ,氟康唑的 M IC值可由 128 mg L- 1降至
32mg L - 1或由 64mg L - 1降至 16mg L - 1 ,且羽
苔素 E的 M IC值也有明显的下降(16 mg L -1降至
1 ～ 2 mg L- 1),二者合用对耐药株表现出协同的
抗真菌作用。实验结果见表 2。
表 2 羽苔素 E与氟康唑合用对白念氟康唑耐药株的抗真
菌作用 .m g L- 1
Tab 2 An tifunga l effects o f plagiochin E com bined w ith flucon-
azo le aga inst the fluconazo le-resistant strains.m g L- 1
Strains
M IC
PLE
(single)
PLE
(in com. )
FCZ
(sing le)
FCZ
(in com. )
F IC Conc lusion
QL-14 16 1 128 32 0. 312 5 Synergy
QL-28 32 4 128 32 0. 375 Synergy
SDEY-24 16 1 64 16 0. 312 5 Synergy
SDEY-09 16 2 64 16 0. 375 Synergy
注:in com. -联合应用
N o te:in com. - used in combination
4 讨 论
自 20世纪中后期以来 ,为了防治一些危害较大
的真菌病 ,抗真菌药物在不断发展 ,特别是从天然产
物中寻找具有抗真菌活性的天然有效成分 ,并进一
步开发应用成为非常重要的研究方向。地钱植物中
富含联苄及双联苄类化合物 ,国内外的学者对其化
学成分及生物活性进行了广泛的研究 ,并分离得到
了一些结构新颖 、活性较好的化合物 。羽苔素 E是
从苔藓植物地钱中提取的双联苄类化合物 ,初步活
性筛选实验证实具有抗真菌活性 。本实验依照 NC-
CLS建立的真菌敏感性测定方案 (M27-A)的微量稀
释法测定羽苔素 E的体外抗真菌活性 (以 M IC表
示)。实验测定了羽苔素 E对 15株临床新近分离
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的白色念珠菌的 M IC ,结果显示 ,羽苔素 E具有中等
的抗真菌活性 , M IC为 16 mg L- 1。
唑类是目前临床上治疗真菌感染的主要药物 ,
能特异性的抑制真菌的甾醇合成 ,抗菌谱广 ,抗菌活
性强。但随着唑类药物的大量使用 (其中以氟康唑
最为常用),真菌耐药性不断产生 ,其中念珠菌对唑
类药物产生耐药性是最常见的[ 5] 。M arr等 [ 6]研究
发现 ,氟康唑在治疗中有诱导菌株产生耐药性的作
用 ,即使仅应用 2 ～ 3周 ,菌株也可呈现耐药 。而目
前大量预防性使用氟康唑 ,尤其是在 A IDS等有长
期免疫缺陷的患者中长期应用 ,也是耐药菌株逐步
上升的主要原因之一 [ 7] 。本研究采用 16 mg L -1
的氟康唑进行体外诱导 ,诱导过程中菌株 M IC值上
升较快 ,经较短时间 , 菌株即呈现较高的耐药性 。
G raybill
[ 8]等研究发现 ,若因临床使用氟康唑诱导产
生的耐药念珠菌 ,很可能同时对其他的唑类药物产
生交叉耐药 ,此时不宜选用该类药物 ,应选用其他的
抗真菌药物 。有趣的是 ,本实验结果显示 ,羽苔素 E
对白念耐药株的 M IC与敏感株的 M IC基本一致 ,对
白念耐药株也保持了中等的抗真菌活性 ,与氟康唑
无交叉耐药性。这一发现提示 ,羽苔素 E是一种新
型的抗真菌化合物 ,可能与氟康唑具有不同的作用
机制 ,故不存在交叉耐药性。对羽苔素 E的作用机
制研究的结果提示 ,羽苔素 E能作用于几丁质合成
酶 ,抑制几丁质在真菌细胞中的生物合成 (数据尚
未发表 )。细胞壁中的几丁质缺少最终导致真菌细
胞渗透性溶解[ 9] 。
本实验中观察了羽苔素 E与氟康唑联合应用
的抗真菌作用 ,结果发现 ,对于白念敏感菌株和耐药
菌株 ,羽苔素 E均能明显降低氟康唑的用量 。特别
值得注意的是两药合用后对耐药菌株的抗菌作用呈
现协同作用 ,提示羽苔素 E和氟康唑有联合用药的
可能性 ,其潜在的机制尚需进一步研究 。
羽苔素 E具有明显的抗真菌活性及与氟康唑
联用时呈现的协同效应 ,提示它在真菌感染的治疗
及抗真菌耐药性方面有很大的潜力。对其抗真菌作
用的分子机制及其抗耐药作用机制我们将进行深入
的探讨。
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(收稿日期:2006-01-23)
●首届全国妇产科药学大会暨生殖内分泌药物与临床学术研讨会征文通知 为了促进我国辅助生殖技术的发展 ,分析交流
药物对生殖医学领域的影响 ,研讨生殖内分泌药物在临床应用的最新进展 , 同时探讨目前许多亟待解决的问题 , 中国药学会
医院药学专业委员会定于 2007年 4月在杭州召开 “首届全国妇产科药学大会暨生殖内分泌药物与临床学术研讨会 ”。会议
由中国药学会医院药学专业委员会主办 , 《中国药学杂志》编辑部 、《中国医院药学杂志》编辑部和浙江大学医学院附属妇产科
医院共同承办。现面向全国医院药师 、临床医生 、研究开发及医药相关领域人员征稿 ,欢迎大家踊跃投稿
1 征文范围 ①生殖内分泌药物的药动学和药效学研究;②保胎药物的合理使用及新剂型研究与开发;③多囊卵巢综合征
促排卵药物的应用;④多囊卵巢综合征相关代谢综合征的药物治疗;⑤促排卵药物与卵巢过度刺激综合征;⑥促排卵药物的
合理应用及相关医学伦理 、法律 、法规;⑦功能失调性子宫出血的药物治疗;⑧骨质疏松及性激素替代治疗;⑨实施辅助生殖
技术中抗生素的使用问题;⑩子宫内膜异位症的药物治疗;○1促排卵药物与女性生殖健康;○12使用尿促性腺激素和重组人促
卵泡激素等相关安全问题;○13储存条件对促排卵药物疗效的影响;○14妇产科药学学科建设的思考与体会;○15我国专科医院药
学工作的实践与思考;○16妊娠和哺乳期妇女用药。
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