全 文 ：福建农林大学学报(自然科学版) 第 39卷 第 5期
JournalofFujianAgricultureandForestryUniversity(NaturalScienceEdition) 2010年 9月
收稿日期:2009-09-22　　修回日期:2010-03-10
基金项目:国家支撑计划项目(2007BAD07B01);福建省科技厅资助项目(K02058).
作者简介:郑诚乐(1963-),男 ,副教授 ,博士.研究方向:果树栽培.Email:zcl2003@126.com.通讯作者潘东明(1956-),男 ,教授 ,博士生导
师.研究方向:果树栽培生理及生物技术.Email:pdm6666@126.com.
锥栗果实双向电泳体系的建立
郑诚乐 , 钟凤林 , 潘东明 , 刘小芝
(福建农林大学园艺学院 ,福建 福州 350002)
摘要:通过对传统双向电泳技术进行改进和优化 , 包括对锥栗果实蛋白不同提取方法的优化和不同 pH值范围 IPG胶条的
比较等 , 以建立适于锥栗果实蛋白质组分析的双向电泳方法.结果表明 , 使用裂解液直接提取蛋白的方法所获得的双向电
泳图谱稳定性和重复性较好 ,分辨率较高 , 经银染后可分辨出 400多个蛋白点 ,其等电点主要分布于 pH4-7.
关键词:锥栗;蛋白质组;双向电泳
中图分类号:S664.2;Q946.33 文献标识码:A 文章编号:1671-5470(2010)05-0475-05
Establishmentoftwo-dimensionalelectrophoresissystemforchinquapinfruits
ZHENGCheng-le, ZHONGFeng-ling, PANDong-ming, LIUXiao-zhi
(ColegeofHorticulture, FujianAgricultureandForestryUniversity, Fuzhou, Fujian350002, China)
Abstract:Theconventionaltwo-dimensionalelectrophoresistechnologywasimprovedinordertodevelopanappropriateapproachfor
proteomicsofchinquapinfruits.ThestudywasdonebyoptimizingdiferentproteinextractionmethodsandcomparingIPGstripsat
differentpHvalues.Withtheimprovedproteinextractionmethod, astable, reproducibleandhighresolution2-Delectrophoresis
mapwasobtained.Aftersilverstaining, morethan400proteinspotsweredetected, withtheirisoelectricpoints(pI)mainlyatpH
4-7.
Keywords:chinquapin(CastaneahenryiRehd.＆Wils.);proteome;two-dimensionalelectrophoresis
双向电泳(two-dimensionalelectrophoresis, 2-DE)是蛋白质组学研究中的核心技术之一 ,是目前常用
的能够连续在一块胶上分离数千种蛋白质的方法 ,广泛应用于生物学研究的各个方面.双向电泳技术利用
蛋白质的等电点和相对分子质量差别将各种蛋白质区分开来 ,其通量高 、分辨率和重复性好以及可与质谱
联用的特点 ,使其成为目前最流行 、可靠的蛋白质组研究手段.对蛋白进行分离 、鉴定 ,分析特异蛋白的功
能及其作用机制已成为当今研究热点 [ 1-3] .
锥栗(CastaneahenryiRehd.＆Wils.)是我国南方栽培驯化最早 、利用最久的经济林树种之一 ,也是我
国古老的名特优稀落叶果树[ 4, 5] .锥栗果实外形光洁美观 、果肉细嫩香甜 ,含有淀粉 、糖 、蛋白质等主要营
养成分及 18种钙 、锌 、磷 、钾 、铁等矿物质 [ 6] .目前对锥栗果实营养品质的研究主要集中在成分分析方
面 [ 4-9] ,有关其营养品质的变异和相关性的研究尚未见报道.应用双向电泳对锥栗蛋白质组分进行质谱分
析在国内外都少见报道.因此 ,本试验通过建立适于处暑红锥栗果实蛋白质分离的双向电泳体系 ,对蛋白
质样品的制备 、电泳参数和固相 pH梯度干胶条等进行优化 ,以期提高锥栗果实蛋白质双向电泳的分辨率
和重复性 ,得到适于其分析的双向电泳试验条件.
1　材料与方法
1.1　试剂与仪器
丙烯酰胺 、甲叉双丙烯酰胺 、IPG胶条(pH3-10, 13、18 cm;pH4-7, 13、18 cm)、IPGbufer(pH3-
10;pH4-7)、胶条覆盖液(矿物油)、Pharmylte、碘乙酰胺 、CHAPS、二硫苏糖醇 (DTT)和 TEMED均购自
AmershamPharmacia公司;苯甲基磺酰氟(PMSF)购自 Sigma公司;其他试剂为国产分析纯.
DOI :10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2010.05.017
IPGphorⅢ , EtanDALTsix, MultiTempⅢ , EPS601, ImagescannerⅡ扫描系统 ,双向电泳分析软件
IMP6.0均为美国通用公司产品.
1.2　蛋白质样品的提取
2007年 8月 8日从建瓯采集正常发育与败育趋势的处暑红锥栗幼果果实 ,用液氮速冻 ,保存在 -40
℃下备用.
1.2.1　TCA-丙酮沉淀法的提取　称取 2 g果实样品 ,加入液氮研磨成细粉 ,装入离心管中 ,加入 8 mL冷
丙酮Ⅰ (含体积分数为 10%的 TCA、0.7 g· L-1 β -巯基乙醇),涡旋混匀后于 -20 ℃下静置 2-4 h,在
20000 g下离心 15min,弃上清液;取沉淀物 ,加入 8 mL冷丙酮Ⅱ(含体积分数为 0.07%的 β-巯基乙醇),
涡旋混匀后于 -20℃下静置 30min,在 20000g下离心 15min,弃上清液;重复上一步;沉淀中残留的丙酮
挥发干净后 ,于 -20 ℃保存[ 4] .称取 20 mg丙酮干粉 ,加 IEF,用 400 μL上样缓冲液溶解.缓冲液含 480 g
· L-1尿素 、50 g· L-1两性电解质(pH3-10)、20 g·L-1 NP-40、50g· L-1 β -巯基乙醇.涡旋混匀后于 37
℃下水浴 2h,在 15000g下离心 20min;取上清液加入 4倍体积的冷丙酮 ,室温沉淀 1 h,在 15000g下离
心 20min,弃上清液;沉淀加 IEF,用 50 μL上样缓冲液溶解 ,于 37 ℃下水浴 30min,在 15000g下离心 5
min,取上清液分装冻存.
1.2.2　裂解液提取　称取 1 g样品 ,加入液氮研磨成细粉 ,装入离心管中 ,加 IEF,用 3mL裂解液(与 1.2.1
的上样缓冲液成分一致)溶解.涡旋混匀后于 37 ℃下水浴 2 h,在 15000 g下离心 20 min;取上清液加入 4
倍体积的冷丙酮 ,室温沉淀 1 h,在 15000g下离心 20 min,弃上清液;取沉淀物 ,加入 8 mL冷丙酮Ⅱ(含体
积分数为 0.07%的 β-巯基乙醇),涡旋混匀后于 -20℃下静置 30min,在 20000 g下离心 15 min,弃上清
液;重复上一步骤 2次;沉淀中残留的丙酮挥发干净后 ,加 IEF,用 50μL上样缓冲液溶解 ,于 37℃下水浴
30 min,在 15000g下离心 5 min,取上清液分装冻存.
1.3　蛋白质含量的测定
蛋白质含量的测定采用 Bradford法 [ 10] .Bradford储存液由 100mL95%乙醇 、200mL88%磷酸 、350mg
考马斯亮蓝 G-250组成.工作液由 425 mL双蒸水 、15 mL95%乙醇 、30mL88%磷酸 、30mLBradford储存
液组成 ,经滤纸过滤 ,用棕色瓶保存于室温下.用 BSA做标准曲线.将 BSA用双蒸水配制为 1mg·mL-1的
标准溶液 ,吸取一定体积的标准溶液和样品液放入 5 mL的 Eppendorf管中 ,最大体积为 80 μL,不足 80μL
的添加双蒸水至终体积为 80 μL,再加入 4 mLBradford工作液混合均匀 ,在 2 min内测 D595nm ,测量在 1h
内完成.利用不同 BSA的光密度值作标准曲线 ,计算得到样品中蛋白质的含量.
1.4　锥栗蛋白质组的双向电泳
1.4.1　双向电泳　剥开 IPG胶条保护膜后 ,将 IPG胶条胶面朝下置于预先加好样品液的聚焦槽凹槽中 ,
矿物油覆盖后 ,室温水化 16-18 h(水化上样 240μg),然后进行等电聚焦(IEF)电泳.参照 Amersham公司
双向电泳手册 , IEF采用 IPGphorⅢ -第一向等电聚焦仪(AmershamPharmacia)进行 ,选用 13cm胶条(pH3
-10),蛋白 400μg泡涨上样.IEF参数设置:300 V12h, 500V1h, 1000V1 h, 5000V2h, 8000V持续至
总伏小时达 65000 h.
将聚胶好的胶条分别在含有 1%DTT和 2.5%碘乙酰胺的平衡液 (6 mol· L-1尿素 , 75 mmol· L-1
Tris-HCl, pH8.8, 29.3%甘油 , 2%SDS, 0.002%溴酚蓝)中平衡 20min.
1.4.2　银染　Bulm银染采用 40%甲醇 、10%乙酸固定胶 1 h, 30%甲醇洗胶 2次 ,每次 20 min.水洗 20
min.0.02%硫代硫酸钠增敏 1 min.水洗 3次 ,每次 20 s.冷的 0.2%AgNO3、0.02%冷甲醛在 4 ℃染色 20
min.水洗 ,每次 20 s.更换盛胶的容器.水洗 1 min.0.05%甲醛 , 3%Na2CO3显色.观察颜色的变化 ,在显色
液变黄时更换显色液 ,当染色完全时 , 5%乙酸终止显色.水洗 3次 ,每次 10s.1%乙酸 4℃保存.
1.4.3　凝胶图像分析　分析软件是 ImageMasterTM2DPlatinumsoftware,用 ImagescannerⅡ扫描系统成
像 ,激发光为 532nm激光 ,扫描分辨率为 10×10-6 m.利用 IMP6对凝胶图谱进行背景扣除 、标准化 、点探
测及匹配.
·476· 福建农林大学学报(自然科学版) 第 39卷　
2　结果与分析
2.1　2种蛋白质提取方法的比较
2种蛋白质提取方法的比较表明 , TCA-丙酮沉淀法获得了较大的提取物 ,但定量分析发现之中仍然有
大量的杂质 ,双向电泳结果较差 ,效果不理想(图 1).这是由于 TCA-丙酮沉淀法直接将干物质沉淀下来 ,
蛋白质与膜或者其他组分的结合并没有很好地分离 ,而锥栗果实中纤维素和多糖等非蛋白质成分含量特
别高 ,需要大量的裂解液才能从干粉中重新溶解蛋白质 ,因此 ,获得的蛋白质溶液浓度低 ,双向电泳检测不
到蛋白质点 ,而浓缩蛋白质不仅费事 ,而且会损失部分蛋白质.而利用裂解液提取蛋白质 ,能够把蛋白质与
纤维素 、多糖等成分很好地分离 ,大量的沉淀物丢弃后 ,得到的蛋白质粗提物含量高 ,经过沉淀 、溶解后得
到蛋白质浓度高(图 2),双向电泳结果表明其分离的蛋白质点多 ,蛋白质点清晰 ,杂质含量少 ,效果理想 ,
适合锥栗果实的蛋白质提取.
图 1　TCA-丙酮沉淀法提取的总蛋白电泳结果图
Fig.1　Theproteinsamplesextractedwithacetone
图 2　pH3-10蛋白质双向电泳扫描图谱
Fig.2　Imagesofproteinspotsfor2-DEfrompH 3-10 IPGstrips
图 3　软件分析 pH 3-10蛋白质图谱
Fig.3　Imageanalysisofchinquapinprotein
2.2　不同 pH值 IPG胶条的比较
　　为获得正常发育与败育趋势处暑红幼果果实蛋白
质差异表达的信息 ,分别将蛋白质样品在 pH3-10、pH
4-7的 IPG胶条进行 2-DE.在相同电泳参数条件下 ,
蛋白质样品在 pH3 -10的双向电泳分离得到蛋白质
点为 400±20(图 2、3);在 pH4-7的双向电泳分离得
到蛋白质点为 350±50(图 4、5), pH4-7的 IPG胶条
分离得到的蛋白质分布更加均匀 ,能够形成更宽 、更清
楚的 pH范围.因此 , pH4-7的 IPG胶条比 pH3-10
的得到的蛋白质信息量更大 ,更适合于锥栗幼果果实
功能蛋白质的分离.以上说明 , pH范围宽的 IPG胶条
适合于植物材料的初步筛选 ,而 pH范围窄的 IPG胶条
适合于植物材料功能蛋白质的分离.
2.3　正常果实与败育趋势果实的比较
通过 pH4-7的线性 IPG胶条对锥栗正常发育与
败育趋势幼果果实的蛋白质进行 2-DE比较分析 ,应用
ImageMasterTM2DPlatinum软件对蛋白质胶进行多项
分析检测 ,均可以获得高敏感 、高分辨的图像(图 4、5).
软件分析每块胶得到蛋白质点为 350±50.以锥栗正常
·477·　第 5期 郑诚乐等:锥栗果实双向电泳体系的建立
发育幼果果实的蛋白质胶作为参照胶 ,发现丰度变化在 2倍以上 、重复性好的差异表达蛋白质 60个.说明
本方法适合于锥栗幼果果实差异蛋白质组学的分析.
3　讨论
自 1975年 O′Farrel建立蛋白质双向电泳系统以来 ,经过不断改进和发展 ,现已成为大量 、快速 、高分
辨率地分离蛋白质的方法 ,是蛋白质组学研究最常用 、最有效的手段之一 ,可清楚 、直观地呈现每个蛋白质
的等电点和相对分子质量以及表达量 ,是其他分离方法所无法比拟的 [ 10] .
样品制备和溶解处理的好坏直接影响双向电泳的效果 ,是双向电泳最为关键的一步.选择适宜的提取
方法是成功的前提[ 11] .锥栗果实的多糖及淀粉等物质对 IEF干扰大 ,而 TCA-丙酮沉淀法对其多糖 、酚类
物质的去除效果有限 ,导致蛋白的丢失 ,因此 ,本试验采用缓冲液直接提取方法 ,简单快速 ,蛋白质点清晰
可见 ,蛋白分离效果佳.
IPG-DALT系统操作简便 ,分辨率高 ,重复性好.不同 pH范围的 IPG胶条得到的蛋白点数不同 ,要根
据情况加以选择 [ 12] .本研究表明 , pH4-7的 IPG胶条比 pH3-10的 IPG胶条得到的蛋白质信息量更大.
pH范围宽的 IPG胶条能反应锥栗胚胎蛋白质的特征 ,但难以有效区分等电点接近的蛋白.在 pH4-7分
离出大量的蛋白质 ,说明锥栗胚胎的功能性蛋白质主要分布在该区域.
·478· 福建农林大学学报(自然科学版) 第 39卷　
图像分析和数据处理是蛋白质组学研究的重要内容 ,可以将每个蛋白质的等电点 、分子质量 、表达量
等信息进行数字化 ,输入数据库 ,同时也是比较蛋白质组学进行差异表达分析的基础和前提 [ 13] .采用 Im-
ageMasterTM2DPlatinum软件对蛋白质胶进行多项分析处理 ,可获得高敏感 、高分辨的图像 ,并保证结果
的可靠性 ,适用于分离植物胚胎的蛋白质.本研究对正常发育与败育趋势锥栗幼果果实的蛋白质胶进行多
项分析处理 ,获得了丰度变化在 2倍以上 、重复性好的差异表达蛋白质 60个.
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(责任编辑:陈幼玉)　　
·479·　第 5期 郑诚乐等:锥栗果实双向电泳体系的建立