全 文 ：·变应原实验研究·
大籽蒿花粉变应原提取液双向电泳
蛋白质组分分析
孙劲旅　张宏誉　应万涛　钱小红
【摘要】　目的　探讨用双向电泳(Two dimensional electrophoresis , 2-DE)对大籽蒿花粉提取液蛋白
质组分进行分析的可能性及其实用价值。方法　按常规方法提取大籽蒿花粉变应原 ,经 SDS-聚丙烯
酰胺凝胶电泳及双向电泳对大籽蒿花粉提取液变应原进行蛋白质组分分析。结果　单纯聚丙烯酰胺
电泳结果可见有 4个较明显的条带 , 分子量分别为62kD , 52kD , 43kD和 25kD。经双向电泳蛋白组分分
析 ,发现大籽蒿花粉提取液有 85 种蛋白组分。其中 ,第 139点的分子量为 31.49kD ,等电点为5.39;第
143 点的分子量为 31.86kD , 等电点为 6.38。这两个点与文献所报道组分 A2c的蛋白质分子量为
31kD, 等电点分别为 5.3和 6.35 一致。结论　双向电泳对大籽蒿花粉提取液蛋白质组分进行分析具
有实用价值 ,并可进一步用于变应原致敏组分的研究。
【关键词】　大籽蒿花粉变应原;双向电泳;蛋白质组分分析
Two dimensional electrophoresis analysis of protein components in Artemisia allergen extract　SUN Jinlu ,
ZHANGHongyu , YING Wantao , et al.Department of Allergy , Peking Union Medical College Hospital , Chinese
Academy of Medical Sciences , Beijing 100730
【Abstract】　Objective　To study possibility of two dimensional electrophoresis(2-DE)in protein analysis
of Artemisia allergen extract.Methods　Artemisia allergen extract was prepared with routine method , SDS-polyac-
rylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE), two dimentional electrophoresis(2-DE), laser imagescanning , 2-DE gel
analysis software were used to analyzing its protein components.Results　There were four obvious bands in SDS-
PAGE , their molecular weights were 62kD, 52kD , 43kD and 25kD respectively.Artemisia pollen allergen had 85
protein components , whose molecular weights(MW)and isoelectric points(pI)were demonstrated in our table 2
in this paper.Our results had good repetition with our previous paper.Conclusions　Two dimensional electro-
phoresis(2-DE)is a good method in protein analysis of Artemisia allergen extract , its potential value in allergic
components needs to be further studied.
【Key words】　Artemisia;Two dimentional electrophoresis;Protein analysis
作者单位:100730北京 ,中国医学科学院 中国协和医科大学 北
京协和医院变态反应科(孙劲旅 ,张宏誉);国家生物医学分析中心
(钱小红 ,应万涛)
　　蒿属花粉是我国主要的致敏花粉〔1〕 ,为深入对
蒿属花粉的致敏组分进行研究 ,我科〔2〕曾于 1992年
采用硫酸铵盐析 、DEAE 纤维素柱及 Sephadex-G-100
柱层析方法对蒿属花粉进行了分离纯化 。目前 ,双
向电泳是蛋白质研究领域广泛使用的蛋白质分离检
测技术 ,它拥有其它方法无法替代的高分辨能力 ,现
在正迈向国际标准化 ,国外也正在探讨采用双向电
泳对变应原进行分析的可行性〔3, 4〕。迄今为止 ,用双
向电泳对大籽蒿花粉变应原进行蛋白组分分析 ,少
见报道。为探讨聚丙烯酰胺与等电聚焦电泳相结合
的双向电泳对大籽蒿花粉提取液蛋白质组分进行分
析的可能性及其实用价值 ,本文对我国华北地区秋
季花粉症的主要致敏物质———大籽蒿花粉进行双向
电泳 ,并初步分析其蛋白组分 。
材料与方法
1.大籽蒿花粉变应原的提取〔5〕:将去脂大籽蒿
花粉按 1∶25比例加入 Coca s液(氯化钠 5g ,碳酸氢
钠2.75g ,结晶酚 4g ,加蒸馏水至 1 000ml , pH8.2),搅
拌提取72 h ,静置 0.5 h后 ,上清液经直径 0.22μm的
滤器过滤 ,蒸馏水透析 ,聚乙二醇浓缩 ,使其终浓度
为5mg ml。以上均在 4℃进行 。
2.电泳
(1)试剂:30%丙烯酰胺(acrylamide) 甲叉双丙烯
酰胺(30∶0.8 ,2.7%C)、甘氨酸(glycine)、三羟甲基氨
基甲烷(Tris)购自 Bio-Rad 公司 , 四甲基乙二胺
(TEMED)、CHAPS 购自 Sigma 公司 , 超纯脲(ultra
urea)、IPG缓冲液 、IPG覆盖液 、IPG 干胶条(pH=3.5
～ 10和 4 ～ 7 , L =7cm)、低分子量标记物和 Pharma-
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lyte(pH =3 ～ 10)购自 Amersham Pharmcia Biotech 公
司 ,二硫苏糖醇(DTT)购自Promega公司 ,十二烷基磺
酸钠(SDS)购自日本 Nacalai Tesque 公司 ,碘乙酰胺
(iodoacetamide)购自 Fluka 公司 ,PMSF 购自 Sigma 公
司 ,其余均为国产试剂。
(2)设备:IPGphor、附件和循环水浴(Amersham
Pharmacia),垂直电泳仪miniVE(Amersham Pharmcia),
ImageScanner光密度仪(Amersham Pharmcia),PentiumI-
II 微处理器 (Dell),高速低温离心机(贺利氏), 550
型酶标仪(Bio-Rad), 双向电泳图象分析软件 Im-
ageMaster Elite 3.01(Amersham Pharmcia)。
(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳:将制成的大籽蒿花粉
变应原提取液以冷丙酮沉淀后进行聚丙烯酰胺凝胶
电泳(SDS-PAGE),160V恒压电泳 ,固定染色。
(4)双向电泳〔6〕
①第一向固相 pH 梯度等电聚焦:取适量样品以
1∶4冷丙酮沉淀(-20℃)过夜 ,12 000×g 离心 10min ,
4℃,弃去丙酮 ,凉干 , 再加入 Rehydration(+DTT +
IPG Buffer)使蛋白全部溶解 ,静置 1 h。等电聚焦条
件如表1 。
表 1　IPGphor等电聚焦系统中固相干胶条 IEF参数
Step Voltage(V) Step duration(h) Volt-hours(Vh)
Rehydration 30 12 360
1 200 1 200
2 500 1 500
3 1000 1 750
4 8000 4 32000
　　②平衡:将等电聚焦后的 IPG 胶条放入平衡液
(1.5mol L Tris 1.34ml , Urea 14.14g , Glycerol 12ml ,
SDS 0.8g , 痕量溴酚蓝)40ml 中 ,于摇床上振荡 15
min×2。其中 ,第一种平衡液中含 DTT 200mg , 而第
二种平衡液内由碘乙酰胺 0.9g 取代 。
③第二向垂直平板 SDS-PAGE:根据 IPG conver-
sion Kit的体积 ,配制大小为 100×100×1mm , 12.5%
的均匀胶。将平衡后的 IPG胶条移至凝胶的上方 ,
用0.5%的琼脂糖封闭 。电泳缓冲液为 Tris-Glycine-
SDS , 在 14 ～ 15℃时 ,以每一胶条 15mA恒流电泳 ,直
至溴酚蓝前沿距玻璃板下缘为止。
④染色:电泳结束后 ,待分析的凝胶入固定液
(50%无水乙醇 、10%冰醋酸),至少 3 h 或过夜;之
后 ,弃固定液 , 更换增敏液(30%无水乙醇 、0.25%戊
二醛 、0.2%硫代硫酸钠 、6.8%无水醋酸钠)30 min;
弃增敏液 ,去离子水清洗 3×5 min;随后 ,加入 0.1%
硝酸银溶液(含 0.02%甲醛)20 min;弃银溶液 ,加入
显色液 (2.5%无水碳酸钠和 0.01%甲醛)3 ～ 10
min;最后加入终止液(1.46%乙二胺四乙酸二钠),10
min后 ,终止反应 。银染在 20℃振荡下进行〔9〕 。
3.图象分析:利用 ImageScanner 光密度仪 , 在
300dpi的分辨率下 , 对银染的凝胶进行扫描 。在
Pentium Ⅱ微处理器 (Dell)下运行 ,分析蛋白图谱。
利用双向电泳图象分析软件的点检测(spot detec-
tion),背景消减(background subtraction)测得所检测点
的个数。
结 果
1.大籽蒿花粉提取液聚丙烯酰胺凝胶电泳结
果:大籽蒿花粉提取液经单纯聚丙烯酰胺电泳 ,有 4
个较明显的蛋白条带 ,分子量分别为 62kD , 52kD ,
43kD和 25kD(如图1所示)。
图 1　大籽蒿花粉提取液单纯聚丙烯酰胺电泳扫描
2.大籽蒿花粉提取液双向电泳蛋白组分分析:
双向电泳见图 2 ,进行计算机扫描和图象分析 ,可得
知各蛋白组分的分子量和等电点(见表 2)。我们发
现大籽蒿花粉提取液有 85种蛋白组分 ,各组分的分
子量和等电点如表2所示 。其中 ,第139点的分子量
为 31.49kD , 等电点为 5.39;第 143 点的分子量为
31.86kD ,等电点为 6.38。这两个点与文献〔2〕所报
道组分 A2c的蛋白质分子量为 31kD ,等电点分别为
5.3和 6.35是一致的。并且 ,双向电泳的计算机扫
描图中 ,我们还可以判断其具体的第 139点和第 143
点的位置(如箭头所示)。
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　　表 2　大籽蒿花粉变应原浸液双向电泳凝胶计算机扫描
和图象分析后 ,各蛋白组分的分子量和等电点
图 2　大籽蒿花粉提取液双向电泳蛋白组分扫描
讨 论
大籽蒿花粉变应原提取过程中 ,我们并没有按
Pharmacia公司使用手册〔6〕推荐的方法(先用纤维素
酶消化细胞壁 ,然后再提取变应原),而是使用我们
的常规提取方法 。其原因是大籽蒿花粉过敏原存在
于细胞壁外 ,所以 ,用常规提取方法即可〔1 , 5〕 。
从大籽蒿花粉提取液单纯聚丙烯酰胺电泳图中
可见有 4 个较明显的条带 , 分子量分别为 62kD ,
52kD ,44kD和 25kD ,包含了文献〔2〕所报道蛋白质条
带。但是 ,由于文献〔2〕所报道组分A2c的蛋白含量
仅占提取液总蛋白含量的 1.71%,因此 ,单纯聚丙烯
酰胺电泳不能明确显示组分 A2c的蛋白条带和其它
含量较少的蛋白条带 。
双向电泳于 1975 年由 O Farrell〔7〕建立 ,其基本
策略是首先通过等电聚焦(isoelectric focusing , IEF),
即通过等电点分离蛋白之后 ,再通过聚丙烯酰胺凝
胶电泳(SDS-PAGE),根据分子量分离蛋白。等电聚
焦技术是双向电泳的基础 。80 年代初 ,固相 pH 梯
度(immobilized pH gradients , IPG)〔8〕代替经典的载体
两性电解质 pH 梯度 ,使实验室间的重复性(run-to-
run reproducibility)和分辨率提高 、样品负荷量增加 ,
并使在碱性 pH 范围内分离蛋白成为可能〔9〕。近几
年来 ,对 IPG技术的改进 ,如重泡胀方式 、加样方式
及 IPGphor的出现 ,使双向电泳技术进一步达到标准
化和简单化。
本实验室采用Amersham Pharmcia Biotech的 IPG-
phor进行等电聚焦 ,重泡胀和等电聚焦在同一容器
中进行 ,内置 8 000V电源和恒温装置 ,是新一代的专
用等电聚焦设备 。一方面 ,采用 IPGphor分体的陶瓷
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重泡胀容器 ,节省了重泡胀溶液 ,提高了样品溶解
性 ,增大了样品量 ,防止交叉污染 。另一方面 ,将样
品直接加入重泡胀溶液(in-gel sample application)的
技术 ,避免了样品杯的使用 ,从而 ,避免在胶面某一
点加样所致蛋白沉淀的产生 ,可以提供较高的分辨
率 、较大的重复性和较高的样品量〔10 , 11〕 。此外 ,电压
升至 8 000伏 ,为原等电聚焦仪(MultiphorII)的 2 ～ 3
倍 ,聚焦时间缩短为原来的 1 3 ,提高了工作效率。
在 1995 年 , Kawaguchi等〔12〕发现:在应用 IPGphor 比
Multiphor Ⅱ进行双向电泳时 ,在凝胶面积较小的前提
下 ,有更高的电泳分辨率 。
本文通过双向电泳发现大籽蒿花粉提取液中存
在85种蛋白组分。其中 ,编号为 139的点分子量为
31.49kD ,等电点为 5.39;编号为 143的点分子量为
31.86kD ,等电点为 6.38。这两个点与我科文献〔2〕所
报道组分A2c的蛋白质分子量为 31kD ,等电点分别
为5.3和 6.35是一致的 。由于我们与文献〔2〕所采
用的提取方法一样 ,且同为大籽蒿属花粉 。因此 ,我
们可以说:这两个组分就是我科文献〔2〕所报道对应
的组分 A2c 中的两个组分 。并且 ,从双向电泳的计
算机扫描图中 ,我们还可以判断其具体的第 139点
和第 143点的位置。由于等电聚焦电泳的 pH 范围
为3 ～ 10 ,等电聚焦中等电点 3.08在电极处 ,因此 ,
双向电泳时不能将文献〔2〕所报道组分 A2c蛋白质
中等电点为3.08 、分子量为 31kD的组分聚焦后显示
出来 。
综上所述 ,经采用聚丙烯酰胺电泳与等电聚焦
电泳相结合的双向电泳显示 ,大籽蒿花粉提取液有
85种蛋白组分存在 ,其中 ,第 139点和第 143点的分
子量和等电点与文献所报道组分 A2c 蛋白质中等电
点和分子量一致。其余 83 种蛋白组分是我们以前
还未曾研究的蛋白组分 ,下一步 ,我们拟应用免疫印
迹探测相对应的过敏原组分 ,它们在大籽蒿花粉变
态反应中的地位和作用正在进一步研究之中。此
外 ,双向电泳作为一项正进行国际标准化的实验及
检验技术 ,可在变应原的科研和制剂质量检验中推
广使用。
参 考 文 献
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(收稿日期:2001-02-26)
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