全 文 ：福建林学院学报　 2001, 21 ( 1): 32～ 35
Journal of Fujian Colleg e o f Fo restr y　
锥栗种子离体胚超低温保存脱氢酶活性研究
陈礼光 , 郑郁善
(福建林学院 , 福建 南平 353001)
摘要: 运用超低温 ( - 196℃ ) 保存手段 , 通过对锥栗种子离体胚超低温保存后脱氢酶活性的方
差分析和 Q检验法多重比较分析 , 对其长期保存的可行性进行研究 , 结果表明: 含水量是影响
锥栗种子离体胚超低温保存的重要因素 , 超低温保存应进行适度脱水 . 无防冻剂预处理 , 20%
含水量 , 缓冻缓解方式条件下 , 离体胚脱氢酶活性最高 .
关键词: 锥栗 ; 种子贮藏 ; 离体胚 ; 超低温保存 ; 脱氢酶活性
中图分类号: S722. 1　　　　文献标识码: A　　　　文章编号 : 1001-389X ( 2001) 01-0032-04
Study on Dehydrogenase Activity of Excised Embryos of
Castanea Henryi Seeds after Cryopreservation
CHEN Li-guang , ZHENG Yu-shan
( Fujian College of Fores t ry, Nanping 353001, China)
Abstract: By applying cr yopreserv ation ( - 196℃ ) tr ea tment and using the methods of va riance analysis and multiple
comparison o f Q test of TTCH content o f ex cised embryo s after cr yopr eserva tion, dehydro genase activity o f ex cised
embryos w as ana ly sed and long-te rm sto rag e feasibility was studied. The results show ed moistur e content ( M C) wa s the
main fac to r s a ffec ting th e cryopreserv ation o f C. henryi excised em bryo s, and the m ea sur es desiccating a little dow n to a
medium MC should be taken in cryopreserv ation. Unde r th e conditions of no cryopro tectants pre treat ment, 20% M C, mild
fr eezing , and quick thawing , the dehydrogenase ac tiv ity o f excised embryos w as the highest.
Key words: Castanea Henryi; Seeds sto rag e; Cryopreserv ation; Excised Embryo s; Dehydro genase activity
锥栗 (Castanea Henryi ) 是一种原产于我国的著名干果 [1 ] , 其种子属顽拗性种子 , 在常规保存的手
段下 ,其保存期只有 3～ 4个月 ,且对零下低温和脱水敏感 .目前尚无进行锥栗种子长期贮存的成功报道 .
超低温保存是近年来飞速发展起来的一种种质保存新技术 , 在超低温 ( - 196℃ )状态下 , 一切的生理代
谢和分裂活动基本上都处于静止状态 [2～ 3 ] ,可能是锥栗种子长期保存的唯一出路 . 通过适度脱水 ,来保证
超低温冷冻或解冻过程中避免或减轻低温伤害是超低温保存的成功关键 [4～ 6 ] ;和种子相比 ,种胚具有较高
的脱水耐性和较弱的低温敏感性 , 而且蕴含了种子绝大部分的遗传信息 , 体积小 , 是超低温保存的理想
材料 [5～ 9 ] . 种子脱氢酶活性的测定方法 , 即 TTCH含量测定 , 是快速测定种子活力常规重要的方式之
一 [10 ] . 因此 , 利用锥栗种子为实验材料 , 试图通过对锥栗离体胚进行超低温保存试验 , 采用不同的含水
量水平 ,运用不同的冷冻和解冻方式 ,探讨在保存过程中脱氢酶活性随各因素和水平变化的内在规律 ,为
锥栗种子的长期种质保存提供理论依据和参考 .
1　材料和方法
1. 1　含水量
将锥栗种子 , 在其种胚部不伤及胚的前提下 , 切取约 5 mm× 5 mm× 5 mm大小的胚方 , 用 30℃+
硅胶条件下使其失水至相对含水量为 25%、 20%、 15%、 10% 、 5%等各含水量梯度 , 不失水的为自然含
水量 , 以不经液态氮处理的为对照 .
　　　　种子的各梯度含水量ω= 100- 最初重量× ( 100-相对含水量 )最后重量
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 ( 39670608) .
第 1作者简介: 陈礼光 ( 1974-) , 男 , 福建闽清人 , 助教 , 硕士 , 从事森林培育研究 .
收稿日期: 2000-06-29; 修回日期: 2000-08-08
DOI : 10. 13324 /j . cnki . jfcf . 2001. 01. 007
1. 2　冷解冻程序
按正交试验设计 L18 ( 61× 36 ) [11 ] , 因子水平安排 , 见表 1, 采用有、 无防冻剂预处理方法对材料进行
各种冷冻处理 , 然后进行液态氮保存 , 各种解冻处理后 (图 1) , 进行脱氢酶活力测定 .
表 1　因子水平和 L18 ( 61× 36 ) [11 ]正交试验设计
Table 1　 Arrangem ent of facto rs levels and o rthogonal ex perim en t design of L18 ( 61× 36)
水平 因　　素含水量 冷冻 解冻 试验号
因　　　素
1 2 3 4 5 6 7
试验号 因　　　素
1 2 3 4 5 6 7
1 5% 快冻 快解 1 1 1 3 2 2 1 2 10 4 1 1 1 3 1 3
2 10% 缓冻 缓解 2 1 2 1 1 1 2 1 11 4 2 2 3 2 2 2
3 15% 慢冻 慢解 3 1 3 2 3 3 3 3 12 4 3 3 2 1 3 1
4 20% 4 2 1 2 1 2 3 1 13 5 1 3 3 3 2 1
5 25% 5 2 2 3 3 1 1 3 14 5 2 1 2 2 3 3
6 自然 6 2 3 1 2 3 2 2 15 5 3 2 1 1 1 2
7 3 1 1 3 1 3 2 16 6 1 2 2 1 2 3
8 3 2 2 2 3 1 1 17 6 2 3 1 3 3 2
9 3 3 3 1 2 2 3 18 6 3 1 3 2 1 1
图 1　冷 解 冻 程 序
Fig ure 1　 Freezing and thawing process
1. 3　脱氢酶活性测定
T TC染色法 [9 ] . 取待测离体胚 4个重复 , 每重复 25粒种子 , 在 45℃温水浸种 24 h (以增强离体胚
的呼吸强度 , 使显色迅速 ) , 取胚 , 然后按 “ TTC定位图形法” 作种子生活力鉴定和分光光度计法定量测
定 TTCH含量 .
2　结果与分析
2. 1　超低温保存前
　　锥栗离体胚在 30℃+ 硅胶条件下失
水至各含水量过程中 , 其 TTCH含量变
化规律是随脱水程度增加 , 其 T TCH含
量是不断降低的 , 降低速度呈指数形式
(表 2) .
新鲜锥栗种子 TTCH含量极高 , 达
104. 29μg· mL- 1· ( 10胚 ) - 1 ,脱氢酶活
性强 ,种子呼吸作用旺盛 ,代谢能力强 ;自
然状态下放置 15 d后 , 种子 TTCH含量
与含水量呈线性相关 ,即随含水量的下
表 2　各含水量离体胚 TTCH含量
Table 2　 T TCH conten t of excis ed em bryos wi th dif f erent water con tent
含水量 原始 /μg· m L- 1· ( 10胚 )- 1
自然放置 15 d后
/μg· mL- 1· ( 10胚 )- 1
降幅
(占原始百分比 )
　 5% 　　　 19. 00 　　　　 2. 52 　　　 86. 71
10% 24. 54 3. 62 85. 25
15% 25. 82 3. 76 85. 43
20% 32. 34 3. 98 87. 71
25% 45. 24 4. 52 90. 00
自然 104. 29 5. 46 94. 76
降其 T TCH含量也下降 . 在不同处理的种子中 , 密封、 常温条件下保存一段时间后 , 含水量越高的种子
劣变越快 , 表现为 TTCH含量降幅越大 , 降低越迅速 , 当种子的含水量降低至 10% ～ 15%这个范围时 ,
T TCH含量降幅最小 , 而且能够维持在较高水平 (表 2) .
33第 1期　　　　　　　　　　　　陈礼光等: 锥栗种子离体胚超低温保存脱氢酶活性研究
2. 2　不添加冰冻保护剂超低温保存脱氢酶活性变化
超低温保存后离体胚脱氢酶含量随含水量的变化而改变 , 呈倒抛物线二项式相关 (图 2) . 自然含水
图 2　锥栗 TTCH超低温贮藏极差分析
Figure 2　 Maxim um variation of T TCH conten t of C . moll issima af ter cryopreservat ion
量处理 T TCH有明显地降低 , 20%
含水量的离体胚 T TCH含量较高 ,
但与保存前的相比 , TTCH含量稍
微有些下降 , 而 15%含水量水平的
离体胚 T TCH含量则较接近于保
存前的水平 ,而且 , 15%和 20%含水
量的 T TCH含量高 , 能够较好地保
存与维持离体胚活力 . 超低温保存
中冷冻速度对锥栗离体胚脱氢酶含
量影响甚微 . 而解冻过程对对锥栗
离体胚脱氢酶含量有显著影响 , 适
当控制解冻时温度上升速度 , 则能
提高脱氢酶活性 ,离体胚受到的伤害较小 ,如缓解方式 .从 3因素极差趋势对比来看 ,含水量造成的 T TCH
含量差异最大 , 为 12. 54μg· mL- 1· ( 10胚 ) - 1 , 其次是解冻方式 , 冷冻方式最小 . 因此 , 含水量与解冻
方式是应考虑的 2个要素 (图 2) .
方差分析进一步表明 (表 3) , 含水量因素的统计量 F( 5, 8)= 3. 958大于临界统计量 F0. 05 ( 5, 8)=
3. 688, 达到显著水平 ; 解冻方式的统计量 F( 2, 8)= 7. 469大于临界统计量 F0. 05 ( 2, 8)= 4. 459, 也达到
显著水平 ; 而冷冻方式之间差异并不显著 .
表 3　超低温保存锥栗离体胚 TTCH含量方差分析
Table 3　 Variance analysi s of T TCH content of exci sed emb ryos af ter cryopreservat ion
变差来源 离差平方和 自由度 均方 均方比 F检验值
LA 278. 89 5 　　 55. 779 　　 3. 958* F0. 05 ( 5, 8)= 3. 688
LB 52. 94 2 26. 470 1. 878 F0. 01 ( 5, 8)= 6. 682
LC 210. 51 2 105. 256 7. 469* F0. 05 ( 2, 8)= 4. 459
Le 112. 74 8 14. 093 F0. 01 ( 2, 8)= 8. 649
LT 655. 09 17
表 4　 Q检 验 临 界 值 查 照
Table 4　 Cri tical value of Q tes t
a 3 4 5 6 7 8
D
n= 6 n= 3
q0. 05 ( a, 8) 4. 04 4. 53 4. 89 5. 17 5. 40 5. 60 11. 21 6. 19
q0. 01 ( a, 8) 5. 64 6. 20 6. 62 6. 96 7. 24 7. 47 15. 09 8. 64
表 5　 Q检 验 法 多 重 比 较
Table 5　 Mul tiple comparison of Q tes t
因素 水平 平均值 x x i - x 6 xi - x 5 xi - x 4 xi - x 3 x i - x 2 因素 水平 平均值 x xi - x 3 xi - x 2
含水量
20% 　 25. 857 　 12. 540* 9. 111 7. 043 6. 390 3. 833 缓解 22. 988 8. 206* 2. 646
15% 22. 023 8. 707 5. 277 3. 210 2. 557 慢解 20. 342 5. 560
10% 19. 466 6. 150 2. 720 0. 653 快解 14. 782
25% 18. 813 5. 497 2. 067
解冻
　自然 16. 746 3. 429
5% 13. 32
　　注: D= qa (a , f e) Se /n , * 表示显著水平 (T= 0. 05) .
34 福　建　林　学　院　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　第 21卷
锥栗离体胚超低温保存 T TCH多重比较分析 (表 5) 可用下表明 , 在 10%以上含水量各水平之间不
存在显著差异 , 20%含水量 TTCH含量最高 , 且与 5%含水量水平之间差异性显著 , 宜采用 20%的含水
量水平 .与原始含水量的各个 TTCH含量相比 ,超低温保存后含水量 20%这个范围内 T TCH含量降幅最
小 , 能够较好地维持活力 (表 2) . 因此 20%的含水量对锥栗离体胚超低温保存较为适合 . 解冻方式的多
重比较分析表明 , 缓解和慢解之间差异不显著 , 而缓解和快解二者之间存在有显著差异 , 测定结果表明
缓解方式明显优于其他 2种解冻方式 . 因此 , 采用缓解方式比较适宜 (表 5) .
3　结论与讨论
锥栗属于我国亚热带地带常见的顽拗性林木种子之一 , 其种子种质长期保存难的问题困扰着林业生
产对种子随取随用的需求 . 通过对锥栗种子超低温保存后的离体胚酶活性分析 , 可知含水量是影响锥栗
种子离体胚超低温保存的重要因素 , 经方差分析 , 结果表明其差异达到显著水平 , Q检验法多重比较分
析表明 , 20%含水量 TTCH含量最高且与 5%含水量水平之间差异性显著 , 缓解方式明显优于其他两种
解冻方式 ; 直接用自然含水量的锥栗离体胚进行超低温保存 , 其保存效果不佳 , 而应当要适度脱水 , 当
相对含水量下降到 20%时 , 离体胚生活力保存率最高 , 反映在其脱氢酶活性 ( T TCH含量 ) 最高 , 可能
此时脱水尚未对锥栗离体胚造成严重地脱水伤害 . 超低温保存过程中 , 解冻方式对锥栗种子离体胚超低
温保存的影响达到显著水平 , 其中以缓冻缓解方式保存最好 .
参 考 文 献:
[ 1]范辉华 . 建瓯龙村乡锥栗农家品种的调查 [ J]. 福建林学院学报 , 1994, 14 ( 3): 277-281.
[ 2]殷晓辉 , 舒理慧 . 植物种质资源的超低温保存研究进展 [ J] . 热带亚热带植物学报 , 1996, 4 ( 3): 75-82.
[ 3] Mantell SH, Smith H. Plant Biotechnolog y [M ] . Cambridge: Cambridge Univ ersity Press, 1983. 163-186.
[ 4 ] Ruhl, G. , Dambro th , M . , Bieh l, B. Investig ations on the causes o f sensitivity to co ld and drying o f tropica l seeds
w ith cocoa as an exam ple I I Dehydra tion parameters and exudation o f drying cocoa [ J] . seeds and seed o rg ans, 1988,
38 ( 3): 235-251.
[ 5 ] Pence V C. Desicca tion and th e surviva l of Aesculus, Castanea and Quercus em bryo axes through cr yopreserv ation
[ J] . Cr yobiolog y , 1992, 29: 391-399.
[ 6] Fu JR, X ia Q H, Tang F. Effec ts o f desicca tion on excised embryonic axes o f thr ee recalcitr ant seeds and studies on
cryopreserv ation [ J] . Seed Sci & Technol, 1993, 21: 85-95.
[ 7 ] Grout, BW W. Shelton, K. , Pritcha rd, HW. Or thodox behavio r o f o il palm seed and cr yopr eserva tion of the excised
embryo fo r g ene tic conserva tion [ J] . Annals o f Bo tany, 1983, 52 ( 3): 381-384.
[ 8] Chandel K P S. Chaudhury R, Radhamani J, Malik S K. Desiccation and fr eezing sensitiv ity in r eca lcitrant seeds o f tea
[ J] . Cocoa and jackt ruit. Annals o f Bo tany , 1995, 76: 443-450.
[9 ] Gonzalez-Benito M E, per ez C. Cryopreserv ation o f embryonic axes o f two cultiv ars of ha zelnut ( Co ry lus avellalna
L ) [ J] . Cry o-let ters, 1994, 15: 41-46.
[ 10 ]黄学林 , 陈润政 . 种子生理实验手册 [M ] . 北京: 农业出版社 , 1990. 125-127.
[ 11 ]洪伟 . 林业试验设计技术与方法 [M ] . 北京: 北京科学技术出版社 , 1991. 375.
(责任编校: 江　英 )
35第 1期　　　　　　　　　　　　陈礼光等: 锥栗种子离体胚超低温保存脱氢酶活性研究