全 文 ：【收稿日期】2013-01-23
【基金项目】现代农业产业技术体系建设专项资金资助(CAＲS-
35-07)
【作者简介】李曼(1987-) ，女，研究生，从事环境生物与昆虫资
源研究，Email:yiluyanyun @ 126． com;刘玉升
(1964-) ，通讯作者，男，副教授，从事环境生物与昆
虫资源研究，Email:ysl@ sdau． edu． cn
文章编号:1005-376X(2013)08-0894-05 【论 著】
紫藤蚜肠道细菌的分离及鉴定
李曼1，刘玉升1，杨诚1，李度福2
(1．山东农业大学 植物保护学院环境生物与昆虫资源研究所，山东 泰安 271018;2．江苏省滨海县蚕桑站，江
苏 盐城 224000)
【摘 要】目的 依据微生态学原理，针对紫藤蚜的肠道细菌进行分离鉴定，为探索紫藤蚜的营养生理与肠道细菌之间的
关系等提供理论依据。方法 利用传统的分离培养方法对紫藤蚜 5 株肠道细菌的生理生化性状进行系统研究，并针对细菌 16S
rDNA保守区设计通用引物进行 PCＲ扩增、测序，将获得的 16S rDNA序列与美国 NCBI信息中心数据库中的发表序列细菌进行
比对，分析克隆群中细菌的种属。结果 分离纯化得到的 5 株细菌经过鉴定，其中 1、2、3 号菌属于蜡状芽孢杆菌属
(Bacillus cereus)、4 号菌为沙雷菌属(Serratia bzio)、5 号菌为枯草芽孢杆菌属(Bacillus subtilis)。结论 本研究为进一步探讨紫藤
蚜生长发育与肠道细菌的关系以及深入研究菌株提供工作基础。
【关键词】紫藤蚜;肠道细菌;16S rDNA;鉴定
【中图分类号】Ｒ378 【文献标识码】A
Isolation and identification of intestinal bacteria from Aulacophoroides hoffmanni Takahashi
LI Man1，LIU Yu-sheng1，YANG Cheng1，LI Du-fu2
(1． Institute of Environmental Biology and Insect Ｒesources，College of Plant Protection，Shandong Agricultural Uni-
versity，Taian 271018，China;2． Sericulture Station of Binhai County of Jiangsu Province，Yancheng 224000，Chi-
na)
【Abstract】 Objective Intestinal bacteria of Aulacophoroides hoffmanni Takahashi were islated and identified in order to provide
theoretical basis for exploring the relationship between intestinal bacteria and the physiological nutrition of Aulacophoroides hoffmanni Ta-
kahashi． Methods Biological characteristics of five strains of intestinal bacteria from Aulacophoroides hoffmanni Takahashi were studied
systematically by traditional isolating and culturing methods． Then we designed universal primers for PCＲ amplification based on conserved
region of bacterial 16S rDNA． The 16S rDNA sequences obtained were compared with the published sequences from United States NCBI
Information Center database to analyse the species of the bacteria in clonal populations． Ｒesults The first，second and third strains be-
longed to Bacillus cereus，the fourth one belonged to Serratia bizio，and the fifth one belonged to Bacillus subtilis． Conclusion This study
would provide a foundation for further rearches on the relationship between intestinal bacteria and the growth and development of Aulacoph-
oroides hoffmanni Takahashi as well as for in-depth study of the strains．
【Key words】 Aulacophoroides hoffmanni Takahashi;Intestinal bacteria;16S Ｒdna;Identification
紫藤蚜(Aulacophoroides hoffmanni Takahashi) ，属
同翅目，蚜虫科。紫藤蚜群体密度大，每厘米紫藤顶
稍可达 40 头;生活时间长，在山东省 4 月份底开始出
现，直至 10 月份才陆续进入越冬状态;目前仅见于紫
藤上有发生，而且不易迁飞。我们在进行龟纹瓢虫规
模化繁殖技术研究过程中，筛选龟纹瓢虫的食物蚜
虫，分析紫藤蚜可以作为瓢虫繁育的优良食物源。以
往对紫藤蚜的研究常见于形态学和生态学［1］以及作
为园林害虫［2 ～ 4］加以防治，而关于紫藤蚜的肠道细菌
研究未见报道。昆虫肠道寄居的微生物与昆虫的营
养生理具有密切关系，影响着昆虫的生命活动［5］。
对昆虫肠道细菌的研究多见于家蚕［6］和白蚁［7，8］等
重要经济昆虫和城市害虫，目前研究范围逐步扩大，
涉及到环境昆虫、资源昆虫、森林昆虫等，如:黑粉
虫［9］、六斑异瓢虫［10］、龟纹瓢虫［11］、中华真地鳖［12］、
桑粒肩天牛［13］、东亚飞蝗［14］、豆天蛾［15，16］、松毛
虫［17］等。研究紫藤蚜的肠道优势细菌的种属对于进
一步探究紫藤蚜的肠道细菌的结构和功能具有重要
的参考价值。本研究采用常规生理生化鉴定和 16S
rDNA分子鉴定技术对紫藤蚜的肠道优势细菌进行
分离培养和鉴定研究。
1 材料与方法
1． 1 供试材料
1． 1． 1 虫源 采自山东农业大学绿化紫藤上的紫藤
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DOI:10.13381/j.cnki.cjm.2013.08.006
蚜种群。
1． 1． 2 培养基 NA培养基、金氏培养基 B、LB 培养
基等［18］。
1． 1． 3 主要实验试剂及仪器 北京全式金生物技术
有限公司的 TransTaq-T DNA Polymerase、TransTaq-T
Buffer;上海生工的细菌基因组 DNA 提取试剂盒，
dNTP，27F，1492Ｒ，各种生化试剂;上海精密生产的
PCＲ2720 基因扩增仪，高速台式离心机 TGL-16G，恒
温金属浴 CHB-100，ChampGel-5000 凝胶成像分析系
统，DYY-10C型电泳仪等。
1． 2 生理生化常规鉴定研究
1． 2． 1 紫藤蚜虫体处理 选取正常生长发育的老龄
紫藤蚜 50 只，经过 75%的酒精和 0． 1%的升汞液消
毒处理，得到紫藤蚜的虫体。在无菌环境中将紫藤蚜
固定，然后在解剖镜下用灭菌的解剖针和细毛笔取出
其消化道。
1． 2． 2 紫藤蚜肠道细菌分离 将紫藤蚜消化道在灭
菌研钵中研磨，将研磨液用 10 mL 灭菌水稀释至
10 －1，然后进行梯度稀释，分别得到 10 －2、10 －3、10 －4、
10 －5和 10 －6稀释液。取 10 －4、10 －5和 10 －6三个稀释
度的稀释液，用平板稀释法和涂布法进行分离，各稀
释度重复 3 次。分别置于 30 ℃ GXZ 型智能光照培
养箱中培养 72 h，各挑取表征各异的菌落在 NA平板
上划线、纯化和培养。将纯化后菌落再分别移至斜面
培养，并依次编号。
1． 2． 3 生理生化指标测定 将分离纯化得到的细菌
在 NA培养基上培养 72 h 后，进行固体液体培养性
状和生理生化指标测定，并按照革兰染色法和 3%
KOH简易法［19］，测定其染色反应;利用显微镜油镜
观察菌体形态;同时将细菌菌株培养于 10、15、30、
37、42 和 55 ℃六个不同的温度，2． 0、5． 0、9． 0 和11． 0
四个不同 pH值和 2． 0%、5． 0%、7． 0%和 10． 0%四个
不同 NaCl浓度条件下，测定其生长情况。
1． 3 肠道优势细菌的 16S rDNA分子鉴定
1． 3． 1 肠道细菌单克隆细菌的获得 无菌条件下，
分别从 LB、NA 和 MSM 培养平板上挑取大小、形态、
颜色一致的菌落在于 LB 平板中继续纯化，经过 5 次
纯化得到 5 株单克隆细菌。
1． 3． 2 PCＲ扩增 使用细菌基因组 DNA 提取试剂
盒提取紫藤蚜肠道细菌单克隆菌株基因组 DNA，以
提取的总 DNA 为模板。16S rDNA 通用引物为 27F
(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和 1492Ｒ (5-
GGTTACCTTGTTACGACTT-3)。PCＲ反应体系为 25
μL:ddH2O 17． 25 μL，10 × TransTaq-T Buffer 2． 5 μL，
DNA模板(50 ng /μL)2． 0 μL，27F(10 mmol /L)和
1492Ｒ(10 mmol /L)各 0． 5 μL，dNTP 2． 0 μL，Trans
Taq-T DNA Polymerase(5 U /μL)0． 25 μL。PCＲ 条
件:95 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃
2 min，30 个循环;72 ℃ 5 min，4 ℃保温。
1． 3． 3 检测与测序 使用 1． 0%的琼脂糖凝胶电泳
检测扩增产物，采用双脱氧链终止法对扩增产物进行
测序。将测序得到的 16S rDNA 序列与 NCBI Gen-
Bank数据库进行 Blast序列比对，选取各个菌株的近
缘序列，然后根据序列初步确定细菌种属。
2 结果
2． 1 菌体形态和培养性状 具体见表 1。
2． 2 供试细菌菌株生理性状 具体见表 2。
2． 3 供试细菌菌株生化性状 具体见表 3。
2． 4 PCＲ扩增产物电泳检测 结果见图 1。
表 1 紫藤蚜肠道细菌培养性状及形态特征
菌株编号 菌体形状 革兰染色 芽胞 鞭毛 固体培养形状 液体培养性状(30 ℃)
1 杆 G + 有 周生
菌落不规则，白色，平展，边缘半
透明，边缘扩展，整齐，有同心环
浑浊，有沉淀，有菌环
2 杆 G + 有 周生
菌落近圆形，灰白色，隆起，;不
透明，不整齐，有光泽
浑浊，有沉淀，有菌环
3 杆 G + 有 无
菌落不规则，白色，边缘透明;边
缘扩展，较规则;
浑浊，有沉淀
4 杆 G － 无 周生
菌落圆形，米黄色，表面隆起，表
面光滑，不透明，边缘规则，
浑浊，有沉淀
5 短杆 G + 有 周生
菌落近圆，米黄色，平展，有光
泽，边缘有缘毛，表面粗糙
浑浊，有沉淀
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表 2 紫藤蚜肠道细菌生理性状
菌株
温度(℃) pH值 耐盐性(%)
10 20 30 37 42 55 ck 2． 0 5． 0 9． 0 11． 0 ck 2 5 7 10 ck
1 + + + + + + + + + － － － + + － + + + + － －
2 + + + + + + + + + － － － + + + － + + + + － －
3 + + + + + + + + + － － － + + － + + + + + + －
4 + + + + + + + + + － － － + + － + + － － － －
5 + + + + + + + + + － － － + + + － + + + － + －
注:+:生长，+ +:生长强，－:不生长。
表 3 紫藤蚜肠道细菌生化反应
生化反应类型 1 2 3 4 5 ck
过氧化氢酶 + + + + + + －
鸟氨酸脱羧酶 － + + + + －
赖氨酸脱羧酶 + － + + － －
精氨酸双水解酶 + + － + + －
硝酸盐还原 + + + + + －
H2S产生 + + + + + －
吲哚产生 + － + + － －
甲基红(M． Ｒ)试验 + + + + + －
V． P试验 － － － － － －
明胶液化 + － + + + －
葡萄糖 + － + + + －
蔗糖 + － － + + －
乳糖 + － － + － －
麦芽糖 + － － + － －
纤维二糖 + － + + － －
阿拉伯糖 + － － + + －
木糖 + + + + + －
鼠李糖 + － － + － －
果糖 － － － + + －
半乳糖 + － － + － －
海藻糖 + － － + － －
棉籽糖 + + － + － －
甘露醇 + － + + + －
山梨醇 － － － + － －
甜醇 + － － + + －
肌醇 + － － + － －
七叶灵水解 + + + + + －
淀粉水解 + + + + + －
丙二酸钠 + + + － + －
柠檬酸钠 + － + + + －
注:+表示阳性;－表示阴性。
2． 5 紫藤蚜肠道优势细菌分子鉴定 具体见表 4。
经测序比对后得知与 1 号菌株相似度达到 98%的近
缘序列有蜡状芽孢杆菌属(Bacillus cereus)、苏云金芽
孢杆菌属(Bacillus thuringiensis) ，与 2 号菌株相似度
达到 96%的近缘序列有芽孢杆菌属(Bacillus sp．)、
相 似 度 达 到 95% 的 为 蜡 状 芽 孢 杆 菌 属
(Bacillus cereus) ，苏 云 金 芽 孢 杆 菌 (Bacillus
thuringiensis)。与 3 号菌株相似度达到 98%的近缘
序列有蜡状芽孢杆菌属(Bacillus cereus)、苏云金芽孢
杆菌属(Bacillus thuringiensis)。与 4 号菌株相似度达
到 97% 的近缘序列有沙雷菌属(SerratiaBizio) ，与
5 号菌株相似度达到 99%的近缘序列有枯草芽孢杆
菌属(Bacillus subtilis) ，达到 98%的近缘序列为地衣
芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) (一种枯草菌)。以
分子鉴定结果为主要依据，结合菌体形态、培养性状
以及生理生化指标，得出鉴定结果:其中 1、2、3 号菌
属于蜡状芽孢杆菌属(Bacillus cereus)、4 号菌为沙雷
菌属(Serratia bzio)、5 号菌为枯草芽孢杆菌属
(Bacillus subtilis)。
注:1 ～ 5 依次为 1 号细菌、2 号细菌、3 号细菌、4 号细菌和 5 号细菌，
M:Marker(2 kp)。
图 1 PCＲ扩增产物电泳检测结果
3 讨论
通过对紫藤蚜肠道优势细菌分离、纯化，共获得
5 株单克隆细菌菌株。5 株菌株的适宜生长温度均为
20 ～ 37 ℃。5 株菌株在 pH 9． 0 ～ 11． 0 的碱性环境中
都可以生长，2、5 号细菌在 pH 9． 0 条件下可以更好
的生长。1 ～ 5 号细菌在 2． 0% NaCl浓度下都可以良
好生长，说明这 5 株细菌在低盐浓度下生长良好，其
中 4 号细菌最不耐盐，不能在高于 5． 0% NaCl 浓度
下生长，3 号菌株可以在 10． 0%的盐浓度下良好的生
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表 4 紫藤蚜肠道细菌 16s rDNA序列分析
编号 NCBI比照分析
1
Bacillus cereus strain BFE 5392 16S ribosomal ＲNA gene(GU250443． 1) (98%) ，Bacillus thuringiensis strain ZJU03 16S
ribosomal ＲNA gene(HM047298． 1) (98%) ，Bacillus cereus strain XX2010 16S ribosomal ＲNA gene(JX993816． 1)
(98%) ，Bacillus cereus F837 /76，complete genome(CP003187． 1) (98%) ，Bacillus thuringiensis serovar finitimus YBT-
020 CP002508． 1) (98%) ，Bacillus thuringiensis strain IWF24 16S ribosomal ＲNA gene(GU120652． 1) (98%)
2
Bacillus sp． enrichment culture clone SYW23 16S ribosomal ＲNA gene(FJ601653． 1) (96%) ，Bacillus cereus strain
XX2010 16S ribosomal ＲNA gene(JX993816． 1) (95%) ，Bacillus cereus strain KVP109 16S ribosomal ＲNA gene
(JX290089． 1) (95%) ，Bacillus cereus strain KVP105 16S ribosomal ＲNA gene(JX290085． 1) (95%) ，Bacillus thuring-
iensis serovar finitimus YBT-020 complete genome(CP002508． 1) (95%)
3
Bacillus cereus strain Ht7-4 16s rDNA(JF899283) (98%) ，Bacillus cereus strain WYLW1-4 16s rDNA(HM003211)
(98%) ，Bacillus cereus strain KD33 16s rDNA(JQ580955) (97%) ，Bacillus thuringiensis strain 2PＲ56-10 16s rDNA
(EU440975) (98%)
4
Serratia sp． JG-4-2 16S ribosomal ＲNA gene(JN381535． 1) (97%) ，Serratia sp． DCM0915 16S ribosomal ＲNA gene
(KC007128． 1) (97%) ，Serratia marcescens strain MSK1 16S ribosomal ＲNA gene(FJ581420． 1) (97%) ，Serratia sp．
4034 16S ribosomal ＲNA gene(JX566600． 1) (97%) ，Serratia marcescens strain ＲPS 9 16S ribosomal ＲNA gene
(JQ308606． 1) (97%) ，Pseudomonas fluorescens strain YＲ20 16S ribosomal ＲNA gene(HM224401． 1) (97%) ，Pseudo-
monas sp． NBCS06 16S ribosomal ＲNA gene(GQ281073． 1) (97%)
5
Bacillus subtilis strain SＲS1 16s rDNA (HM486497． 1) (99%) ，Bacillus subtilis strain KC3 16s rDNA (HM195191． 1)
(99%) ，Bacillus subtilis 16s rDNA (EF532601． 1) (99%) ，Bacillus subtilis strain LZBS-Y1-2 16s rDNA (JX997920． 1)
(99%) ，Bacillus licheniformis strain KIBGE-IB116s rDNA (GU216258． 1) (98%)
长，是否能在高盐条件下正常生长还需进一步研究。
以上均在表 2 中得以体现。从表 3 可知，这 5 株细菌
对几种氨基酸、糖醇等的利用程度有一定的差异，据
此可以利用不同菌株进行碳源氮源的转化利用。
利用常规的生物学性状鉴定细菌种属因实验条
件、人为操作等因素存在很大的误差，所以已经开始
转向非培养法［20 ～ 22］。而非培养法———16S rDNA 分
子鉴定也会存在很多缺陷，所以应将两种方法结合。
根据生理生化性状可知 1、2、3 号细菌分属不同种，要
鉴别种还需进一步深入研究。4 号菌为沙雷菌属
(SerratiaBizio)、5 号菌为枯草芽孢杆菌属(Bacillus
subtilis)。在常规鉴定过程中出现重复处理结果不一
致的现象，属于实验误差。总体说来常规生物学性状
鉴定与分子鉴定结果是吻合的。
研究紫藤蚜的肠道优势细菌的种属对于进一步
探究紫藤蚜的肠道内生细菌的结构和功能具有重要
的参考价值。此研究也有利于紫藤蚜作为一种瓢虫
食物加以利用。另外通过生理生化反应可以选择具
有不同特性的细菌加以利用。
至今，对紫藤蚜的肠道细菌的研究仍然停留在初
级分离和鉴定阶段，对它的应用研究有待进一步深
入。
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