全 文 ：第 3 8卷 第 2期
20 0 1 年 5月
土 壤 学 报
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发光酶基因标记的华癸根瘤菌 J S SA 1 6 L在紫云英根圈的定殖动态 ’
王 平 冯新梅 李阜棣
(华中农业大学微生物学系 , 武汉 4 3 0 0 7 0)
摘 要 在土壤一盒栽 、 盆栽微宇宙系统 (肠 c ocr os m ) 中和 田间条件下 , 研究了发光酶
基因 ( lu 尤刁B )标记的华癸根瘤菌 J S SA 16 L 在紫云英根圈的定殖动态 、 分布范围及结瘤情况 . 在
盒栽系统中 , sJ 5A 1 6 L 的定殖密度在紫云英出苗 2 天后达到最高水平 ( .7 8 109 c fu / 克根 )
(c fu 为 co ot ny fo蒯 ng 阴 t的缩写 ) , 然后开始下降 , 并保持在一个相对稳定的水平 ; 58 天后又
有所回升 , 且能散布至种子下方 2 c m 处的根段部位 。 盆栽条件下 的定殖动态与盒栽系统中
的相似 , 紫云英播种 3 天后 , Js5 A 16 L 可达最高定殖水平 ( .6 92 109 c fu / 株根系 ) , 随后开始缓
慢下降 , 直至 32 天 时仍维持在一个相对稳定水平 。 sJ 5 A 16 L 在 田间条件的定殖动态则不 同 ,
播种后 30 天时定殖密度达到最大值 (7 . 03 109 c fo / 克根 ) , 90 天后降到最低值 .(5 24 109 c fu /
克根 ) , 然后 又开始上升 , 160 天时为 7 . 87 109 c fu / 克根 , 甚至在地上部植株收割后 加 天仍可
维持在 7 . 89 109 c fu / 克根 。 接种该菌株可显著提高紫云英的生物学产量 .
关妞词 发光酶标记基因 , 华癸根瘤菌 J s5 A 16 L , 紫云英根圈 , 定殖动态
中圈分类号 09 38 . 1十 3
在现阶段国内外出现的众多微生物肥料中 , 豆科根瘤菌肥料是应用最早 、 效果最为肯
定和稳定的微生物肥料川 , 曾在我国农业 、 草业生产 中发挥 了重要作用 2[] 。 但由于应用过
程中的一些关键性问题 , 如根瘤菌竞争结瘤机制 尚未阐明等 , 而影响了人们对提高接种效
果的技术的进一步改进 13] .
根瘤菌竞争结瘤的过程实质上是一个发生在植物根圈的十分复杂的生物学和生态学
过程 , 首先是共生伙伴的相互识别 , 然后是感染和根瘤的形成 。 相互识别的过程又包括了
两个阶段 , 即根瘤菌在根表面的定殖及其在根和根毛表面的粘附 。 而根瘤菌在根表面的
定 殖 过 程 是 与 根 瘤 菌 感 染 、 共 生 两 个 阶 段 密 切 相 关 的 最 初 阶段— 腐生 阶 段(s ap or p hy ict phas e ) , 对其竞争结瘤至关重要 [’, ’ 〕 . 引人根瘤菌和土著根瘤菌之间 、 根瘤菌
同其他土壤微生物之间的竟争能力在很大程度上决定于根瘤菌在植物根圈的定殖水平 、
定殖动态 。 有效根瘤的分布与根瘤菌的散布范围也密切相关 . 因此 , 关于根瘤菌在豆科植
物根圈的定殖动态及其根圈适应性与竞争结瘤的关系的研究现已成为根瘤菌分子生态学
研究的前沿课题 6I] 。
. 欧盟合作项目 (I C 1 8 . { 几习6刃 10 3) 及国家自然科学基金 ( 3 9 7 70 0 2 6) 资助 , 97 届毕业生柯永杰同学鑫加 了部分
工作
收稿日期 : 199 9刃9刁4 ;收到修改稿日期 : 2 0 00刁2一 2 5
266 土 壤 学 报 3 8卷
本室多年的研究结果表明发光酶基 因用于细菌根圈定殖的研究十分灵敏 、 可靠而且
方便卜 ’ 0 ]。 因此 , 本项研究 采用发光酶基 因 (lu x月B )标记检测技术 , 研究 了华癸根瘤菌
(eM so kr ioz b iu m hu
a ku i) sJ 5A 16 L 在土壤 一盒栽 、 盆栽系统中及 田间条件下在紫云英根圈
的定殖动态和分布范围 , 为提高根瘤菌肥料的应用效果提供理论指导 .
1 材料和方法
L l 供试菌株
带有发光酶基因标记的华癸根瘤菌 sJ 5A 16L , 系本室分离自江苏省武进县田 间紫云英根瘤上并标
记 [ , ’ , 12 ] .
L Z 供试培养基 、 供试土坡和萦云英种子
参见文献 [12 ] 。
1 .3 根盒 (r h . o b o x) 的装配与表面灭菌
参见文献 【8] .
1 .4 接种物的制备和拌种
参见文献 8[ ] 。
1
.
5 根盒— 土坡徽宇宙的建立将已调节好水分含量 (约 30 % )但未灭菌的黄棕城 (取自华中农业大学科研试验场 ) , 按每盒 7 009 分
别装人根盒 . 将经过菌液拌种的紫云英种子 (接种量为 8 . 24l o g c fu / 粒种子 )按每盒 2 粒等距离播人土
表 , 种子上再盖一层厚约 I c m 的土 。 自紫云英出苗后第 2 天开始按无菌操作规程取样 , 取样时从种子下
方根部开始 , 每 4c m 根长为一段 . 其他处理方法参见文献 8[ ] . 然后用 S M 双抗 (伪 c + 为 n )培养基测定
发光菌落数 1 2】.
L 6 盆栽系统的建立
参见文献 【川 . 紫云英种子初始接种量为 .7 90 109 c fu / 颗种子 . 待紫云英出苗后 3 天开始取样 .
取样方法 : 自塑料钵中小合取出整株根系 ,抖掉附着在根上的土粒 , 称根重 , 测发光菌落数 1 21 .
1 .7 田间小区试验
1
.
7
.
1 接种物的制备 将活化好的 JS SA 16 L接一环于 10 0 而 Y M A 培养液中 , 8℃ 、 150 r · 而n 一 ’ / 分
培养 3 天 . 按 25 9 草炭接 1而 菌液的 比例接人 J s5 A 16L 菌液 , 拌匀后测定草炭中的发光菌落数 1 2] , 为
.9 40 ol gc fu / g 草炭 . 同时采用按 25 9 草炭接 1 m l无菌 Y M A 培养液制作的混合物作为对照用接种剂 .
1
.
.72 种子拌菌 紫云英种子经 75% 酒精和 0 . 1% gH a Z表面灭 菌后催芽 . 出芽后 , 按 154 9 种子加
24 09 接种剂拌种 , 并检侧每颗种子上携带的菌数 l[ 2 ] , 结果为 .7 59 log c fu / 顺种子 。 对照处理则按相同比
例将种子与对照用接种剂拌匀 1 2] .
1
.
.7 3 小区的设 t 选用华中农业大学科研试验场内试验地一块 (经 N田N 法紫云英结瘤实验检测 , 田
间土城中无土著华癸根瘤菌 ) . 犁翻后平整 、 开沟 , 南北向排列 . 每个小区的面积为 1 . 4m x 7m . 将经过革
炭拌种的紫云英种子均匀撤播于每个小区内 , 播种量为 1 54 9 / 小区 , 接菌和对照处理均设 3 个重复 . 自
紫云英出苗后第 30 天开始取样 , 每个小区多点取样 . 取样时 , 将植株和根系一起采挖 , 一部分去掉根上
的土后 ,称根重 , 测发光菌落数1叭将另一部分根系用自来水冲洗干净 , 用吸水纸吸干水 , 称地上 、 地下部
鲜重 、 数总根瘤数 , 并计总株数 , 计算每株地上部鲜重 、 总鲜重及每株根瘤数 .
2期 王 平等 : 发光酶基因标记的华癸根瘤菌 J S SA16 L 在紫云英根圈的定殖动态 267
1 . 8统计分析
两个平均值之间的 比较采用 I 检验法 .
2结果与分析
2
.
1 华癸根瘤菌 J S SA16 L 在盒栽系统中的定殖动态 、 分布范围及结瘤情况
紫云英不同生长时期根部分段取样结果 (如表 l )表明 : 紫云英出苗 2天后 , J s5 A 16 L 在
裹 1 华癸根启菌 J s5 A 16 L在盒栽系统中的定殖动态及其在策云英根部的分布 ’ )
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各根段内的根瘤菌菌数 Qaun it it e s o f ihr z o b lum o n 此 or o t (10 9 c fu / 9 or o )t
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2 3 ( 1 5)
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5 7 ( 1 3)
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5 9 ( 6 7)
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1
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2 2 3
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2石6 ( 5 )
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2) 括号里的数据是此根段范围内的根瘤数 hT e da at , n b I’ac ke st aer n od lu e num 晚 sr
紫云英种子下方 0一 4 c m 根段上达到最高定殖密度 。 随着植物的生长 , 定殖密度逐渐下降 ,
ǎ任目合长减七之。甘匕ō召.老,习吕ú6
ǎ减毕、`。兮O侧栩翻-,工v娇sr
峨理\暇饭
日.棍诊.宕匹”习Z
但到 58 天时又有所回升 。 随着根的
伸长 , SJ S A 16 L 向根下部扩散 , 但与
根的伸长并不同步 , 当植物生长到
58 天时可以扩散到根下 2 c m 处 。
紫 云英 出苗后 14 天 时 , 种子下方
0一 4 c m 根段上开始出现根瘤 , 随
后 , 根瘤越来越多 , 但 主要集 中在
0 ~ 8 c m 根段上 , 与该部位 J s5 A 16 L
的定殖密度最高相一致 。
.2 2 华癸根瘤菌 J S A 16 L 在盆栽
系统中的定殖动态及结瘤情况
以全根系作为取样单位 , 不同
时间取样检测的结果如图 1所示 。
从图 1可 以看出 : 紫云英 出苗 3 天
后 sJ 5 A 16 L 在紫云英根 圈中的定
殖密度达到最大值 , 然后开始缓慢
下 降 , 直至植株生长到 35 天时仍
,哪一…
生长时间 ( 天 )
G拍w 山 it m e (da y )
图 1 盆栽系统中华癸根瘤菌 JS SA 1 6 L在紫云英
根际的定殖动态和结瘤情况
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图 2 田间条件下 Js5 A 16 L在紫云英根圈
的定殖动态
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保持在相对稳定水平 ;紫云英生长到第 10 天
时 , 主根上有根瘤出现 , 32 天后根瘤大 量产
生 , 但主要集中在侧根上 。
.2 3 田间土坡中华癸根摘菌 J S A 16 L 在续云
英根圈的定殖动态
田 间条件下 J S SA 16 L 在紫云英根圈的定
殖动态如图 2 . 从 图 2 可以看出 : 在紫云英出
苗后第 3 0 天 , sJ 5 A 16 L 的定殖密度达到 .7 03
lo g c细 克根 , 接着开始下降 , 90 天时降至最
低 点 (5 . 24 log c阿 克根 ) , 然后又开始上 升 ,
到 16 0 天收割地上部植株时达 7 . 87 10 9 c fu /
克根 , 即使在 收割植株 2 0 天后仍维持在相对
稳定的水平 (7 . 89 lgo c细 克根 ) 。
.2 4 田间条件下 SJ SA 16 L 对紫云英生长的影响
不同时间取样结果如表 2所示 . 由于田间无土著华癸根瘤菌存在 , 因此在紫云英生长
早期 , 接种 sJ 5A 1 6 L 可显著地促进地上部生长 , 90 天 、 120 天时每株植物结瘤数也显著高
于对照 。 但到后期 , 由于对照也感染了 Js5 A 16 L , 因此 , 至 150 天时每株植物结瘤数没有显
著性差异 。
裹2 田间条件下 J S A 16 L对策云英生长的影响
T a b le 2 E ffe e st o f in co ul iat on
o f A伦s o r h御 b j u m h u a ku ` 1 J S SA 16 L o n het g or w ht o f sA tr 叮 a lUS s仇 fc u s
u n d e r ht e if e ld e o n id it o ns
生长时间 地上部鲜重 ( g/ 株 ) 总鲜重 ( g/ 株 ) 根瘤数 /株
(淞。 w ht it me (山 y) erF s h w e igh t o f s h o t (g / pl an )t oT alt fer s h w e ig h t of 口an t ( g / p lan )t N目川e s / pl an t
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J S SA 16 L C o n tr o ! J S SA 16 L
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注 : ` t’ 测脸 : 同栏内同一行数字后两个不同字母表示差异极显著 ( P< .0 O)S
“ r ’ 记 s t het da at fol low e d 勿 het id fe 比 n t le比 sr me ans s ig in if e朗 t id fe 正飞 e (P< 0 .0 5)
3 讨 论
田间条件下 , J S SA 16 L 在紫云英根圈的定殖水平与荧光假单胞菌在小麦根圈的定殖
水平相 比 .8I ’ ] , 其定殖密度高 、 维持的时间长 、 散布的范围广 , 这可能正是共生固氮菌肥料
的应用效果比非共生菌肥料的应用效果要稳定的原因 .
盒栽试验和田间试验结果均表明 , 即使在紫云英的生长后期 , J S SA 16 L 的定殖密度也
还会上升 , 而荧光假单胞菌作为植物根圈的常住菌 , 在植物的生长后期几乎检测不到 8[] ,
这一方面说明了根瘤菌与豆科植物共生关系的优越性 , 同时 ,也反映出根圈共生细菌 (根
瘤菌 )与荧光假单胞菌这样的互生菌在利用根圈分泌物能力方面生理生化特征的不同 .
2期 王 平等 : 发光酶基因标记的华癸根瘤菌 JS SA16 L在紫云英根圈的定殖动态 269
盒栽试验中的结瘤情况表明 , J S SA 16 L 所结根瘤主要集中在种子下方 O一 s c m 根段范
围 , 与其在此根段部位的定殖密度一直很高密切相关 , 从而说明了根瘤菌在豆科植物根圈
的定殖水平对其结瘤能力具有重要影响 。
由于在本项田间试验的一开始没有检测出土著根瘤菌 , 因此无法 比较 Js5 A 1 6 L 与 土
著根瘤菌的竟争结瘤能力 , 但从它的定殖动态及其结瘤促生情况可以看出 , 该菌株具有很
强 的 与 其他 土壤 微 生 物竞争 的 能 力 , 亦 即具 有 很 强 的 根 圈适 应 性 (黝20 5户 e er
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om pe et cn e)
.
本项研究还再次证明发光酶基 因可以准确快速地跟踪引人菌株在田间土壤条件下的
动态变化与存活性 。
参 考 文 献
M ul o雌 o y K e t a l . B一o fe 由 l l z e sr : ag or n iom c an d e n v 一r o nm e n alt im脚 c st a n d e e o n o mr e s
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70 2土 壤 学 报 3 8卷
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