全 文 ：费氏中华根瘤菌 HN01DL在大豆根圈的
定殖动态与结瘤研究*
李友国 周俊初* *
(华中农业大学农业部农业微生物重点实验室 ,武汉 430070)
摘要 以发光酶基因 luxAB 为标记, 在根盒缩影条件下研究了费氏中华根瘤菌 HN01DL 在大豆根圈的
定殖动态、分布范围及其结瘤情况.结果表明, HN01DL 在根盒灭菌土壤和非灭菌土壤缩影中的大豆全根
系定殖动态与水平明显不同, 前者在第 12 d 时达到最高定殖密度( 8. 65 log cfu!g- 1 ) , 而后者的早期定殖
数量下降较快, 且于第 15 d 时达到最高定殖密度( 6. 88 log cfu!g - 1) . HN01DL 在大豆播种 5 d 后在大豆根
部的 A( 0~ 4 cm)区根段上达到最高定殖密度( 7. 05 log cfu!g- 1 ) , 然后开始缓慢下降, 至第 19 d 时仍维持
相对稳定, 在第 33 d 时又开始回升.至播种后第 46 d 时HN01DL 可散布至种子下方 16 cm 处的根段部位.
HN01DL 在 A 区根段的定殖密度持续较高,所形成的发光根瘤总数( 16. 3 个)及发光比例 ( 68. 8% )最高,
且发光根瘤主要集中于该区段主根上. 发光根瘤比例沿 AE 区段逐渐下降, 在 E 区段未检测到发光根瘤.
关键词 费氏中华根瘤菌 HN01DL 大豆根圈 定殖 结瘤 发光酶标记基因
文章编号 1001- 9332( 2003) 08- 1283- 04 中图分类号 Q939. 96 文献标识码 A
Root colonization and nodulation of Sinorhizobium fredii HN01DL in Glycine max rhizosphere. LI Youguo,
ZHOU Junchu ( K ey Laboratory of Agr icultural M icrobiology , H uaz hong Agr icultural University , Wuhan
430070, China) . Chin . J . A pp l. Ecol . , 2003, 14( 8) : 1283~ 1286.
Rhizoboxsoil microcosms studies on the colonization, dispersal and nodulation of S inorhiz obium f r edii HN01DL
marked with luxAB gene in Glycine max rhizosphere showed that the colonization dynamics and the density of
HN01DL in nonsterilized rhizoboxsoil microcosms were differ ent fr om those in sterilized rhizoboxsoil micro
cosms. The colonization density of the former r eached the max imum ( 8. 65 log cfu!g - 1 root) 12 days after the
coated seeds planted, and that of the latter decreased rapidly at t he early stag e and achieved the max imum ( 6. 88
log cfu!g- 1 root) 15 days afterwards. Furthermore, the co lonization density of HN01DL reached the max imum
( 7. 05 lo g cfu!g- 1 root) in section A ( 0~ 4 cm) of root system 5 days after seeds planted, decr eased slowly and
kept a relative stable level until 19 days, and began to rise up again 33 days afterwards. The str ain could also dis
perse to the place of 16 cm from seed to root t ip by 46 days after seed planted. HN01DL maintained a constantly
higher colonization density lev el in section A of roo t system, formed the largest number of luminescent nodules
(total 16. 3, dominantly located in main root of section A ) , and had the highest luminescent percentage
( 68. 8% ) . The luminescent nodule percentage decreased gradually along sect ion A to E o f root system, and no
luminescent nodule w as detected in section E of root system.
Key words Sinorhiz obium f redii HN01DL , Glycine max rhizospher e, Root co lonization, Nodulation,
luxAB .
* 国家∀ 863#高技术研究发展计划项目( 2001AA214021) 和国家重
点基础研究发展规划资助项目( 001CB1089) .
* * 通讯联系人.
2001- 07- 30收稿, 2002- 03- 18接受.
1 引 言
标记基因技术的建立与发展, 为我们开展根圈
细菌定殖微生态学的研究提供了有效的手段[ 10] . 虽
然近年来关于根瘤菌定殖的分子生态学研究日趋活
跃,但对影响根瘤菌根圈适应性和竞争性的决定因
素了解很不充分[ 1] .根瘤菌竞争结瘤的过程是发生
在由根瘤菌、土壤和豆科植物根圈构成的生态系统
中的一个复杂的相互作用过程, 而根瘤菌在根表面
的定殖过程发生在根瘤菌感染与共生两个相关步骤
的最初阶段 ∃ ∃ ∃ 腐生阶段. 该阶段对其竞争结瘤至
关重要[ 2] .根瘤菌具有向豆科植物根系分泌物运动
的趋化性, 在豆科植物根圈的有效定殖及其随根系
生长的运动性是接种根瘤菌能否有效占据豆科植物
根系和提高占瘤率的关键[ 9] .引入根瘤菌和土著根
瘤菌之间、根瘤菌与其它土壤微生物之间的竞争能
力,在很大程度上决定于根瘤菌在植物根圈的定殖
水平与定殖动态[ 5] , 而且有效根瘤的分布也与根瘤
菌的散布范围密切相关.因此,关于根瘤菌在豆科植
物根圈的定殖水平、动态及根圈适应性与竞争结瘤
关系的研究[ 6~ 8]已成为根瘤菌分子生态学研究的
前沿课题.由于不同的研究者采用的研究材料(包括
应 用 生 态 学 报 2003 年 8 月 第 14 卷 第 8 期
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY, Aug . 2003, 14( 8)%1283~ 1286
供试植物和菌株等)和生态条件不同,所获得的信息
和结论也不尽相同.深入研究根瘤菌在植物根圈的
定殖动态, 有助于了解人工接种的重组根瘤菌在土
壤、根圈中的活动规律和制定提高接种根瘤菌剂田
间应用效果的措施.
2 材料与方法
21 供试材料
HN01DL为本室构建的重组大豆根瘤菌株,带有发光酶
标记基因 luxAB , 参见文献[ 3] .在华中农业大学实验农场采
集的田间表层 ( 0 ~ 20 cm) 黄棕壤土样, 经风干和过筛 ( 2
mm)后,加入适量蒸馏水, 使含水量达到 30% ,并混合均匀.
连续 2 次在 121 & 下灭菌 1 h,获得无菌土样.大豆品种为宁
镇 1 号,由重庆市土肥站提供.
22 试验方法
221 接种物的制备及接种方法 供试菌 HN01DL 用 TY
培养液于 28 & 、150 r!min- 1培养 3 d, 然后取培养液离心,
去上清液,收集菌体, 以无菌生理盐水离心洗涤 2 次后, 加入
1%羧甲基纤维素磷酸缓冲液( PBS) 10 ml, 旋涡振荡打散菌
体后,转入无菌 PA 瓶中备用.大豆种子经 95%乙醇处理, 再
用 0. 1%HgCl2表面灭菌后催芽, 发芽后选择生长良好且一
致的种子存于 4 & 备用. 取上述备用菌悬液适量(以淹没种
子为宜) ,加入盛有已经发芽的大豆种子的小三角瓶内, 于
80~ 100 r!min- 1振荡 10 min.将种子取出, 置于灭菌培养皿
内,在超净工作台上吹干至种子表面无水后播种, 并同时测
定每颗种子上所粘附的根瘤菌数.空白对照组采用未接种根
瘤菌的 1%羧甲基纤维素 ∃ ∃ ∃ PBS 作为接种剂. 在无菌缩影
系统中, 大豆种子经过表面灭菌;但对于有菌缩影系统中的
大豆种子则不需要表面灭菌.根盒的装配与表面灭菌参见文
献[ 11] .
222 根盒土壤缩影系统 将已调节好含水量(约 30% )
的灭菌或未灭菌土样, 按每盒 700 g 分别装入根盒. 将菌液
拌种的大豆(黑农 33)种子按每盒 2 粒等距离播入土表, 再
覆盖一层厚约 1 cm 的土. 大豆种子初始接种量为 8. 16 log
cfu!粒- 1种子 .以播种时间计为起点(第 0 d) , 从播种后第 3
d 开始, 于大豆不同生长时间( d)取样.
223 取样及根瘤菌的计数方法 当以全根系为取样单位
测定供试根瘤菌的定殖密度时, 按照无菌操作规程, 自根盒
土壤缩影系统中小心地取出整株根系,抖掉附着在根系上的
土粒,转入对应编号的无菌培养皿内, 测定全根系根重. 当测
定供试根瘤菌在根系各区段定殖密度时,同样按照无菌操作
规程,从种子下方根部开始取样, 每 4 cm 根长为 1 段. 以无
菌镊子和剪刀将一株大豆根系自上而下分别采取,各部位根
段转入对应编号的无菌培养皿内, 抖掉附着在根上的土粒
后,测定各根段的重量, 然后分别转入盛有 20. 0 ml或 5. 0
ml无菌生理盐水和数颗玻璃珠的三角瓶或 PA 瓶内, 浸泡
15 min 后, 于 100 r!min- 1振荡 30 min, 再旋涡振荡 5 min 或
超声波处理 30 s. 作 10 倍系列稀释(盛有样品的悬液为原
液,其稀释度为 0 次方) . 最后用 SM + Tc+ Amp 抗性平板测
定发光菌落数[ 4] .
3 结果与分析
31 HN01DL 在根盒灭菌土缩影中的全根系定殖
动态
以全根系为取样单位,在不同生长时间取样检
测的结果见表 1和图 1. 从图 1 可以看出, 供试菌
HN01DL 在大豆根圈的定殖数量逐渐上升, 在第 12
d达到最大值, 然后开始缓慢下降. 在根盒灭菌土缩
影中回收的标记根瘤菌 HN01DL 在平板上的发光
记录见图 2.
32 HN01DL 在根盒非灭菌土缩影中的全根系定
殖动态
仍以全根系为取样单位,在不同生长时间取样
检测的结果见表 1 和图 1. 从图 1 可以看出,
HN01DL 则在定殖早期数量下降较快, 在第 5 d后
缓慢上升 ,在第15d时达到最大的定殖密度, 定殖
密度在第 21 d后的下降速度加快. 结果表明, 在非
灭菌土缩影系统中, 由于来自多种生物因素竞争和
干扰的影响,供试菌在大豆根圈中的定殖动态与在
图 1 HN01L 在根盒土壤缩影中的全根系定值
Fig. 1 Survival dynamics of HN01L on soybean roots in soil microcosms.
∋ .灭菌土缩影 Steriliz ed, ( .非灭菌土缩影 Nonsterilized.
图 2 回收HN01DL 标记根瘤在平板上的发光记录
Fig. 2 Fluorescent detect ion of HN01DL marked nodules.
A)切根瘤 Cut nodules, B) 发光根瘤 Fluorescent nodules ( all nodules
show ing fluorescence) .下同T he same below.
1284 应 用 生 态 学 报 14卷
表 1 HN01DL在根盒灭菌土和非灭菌土缩影中的定殖动态
Table 1 Survival dynamics of HN01DL in sterilized and nonsterili zed
soil microcosms( log cfu!g- 1 root)
土壤缩影
Soil
m icrocosms
时间 T ime( d)
3 5 7 9 12 15 18 21 28
灭菌土 8. 11 8. 20 8. 31 8. 53 8. 65 8. 38 8. 16 7. 75 7. 54
Ster ilized
非灭菌土 6. 61 6. 32 6. 47 6. 68 6. 70 6. 88 6. 59 6. 39 6. 09
N onster ilized
cfu:菌落形成单位 Colony fo rmat ion unit.
无菌土缩影中的显著不同.
33 根盒土壤缩影中的全根系结瘤及发光活性
分别检测了在根盒灭菌土和非灭菌土缩影中
的 10株供试根系上的结瘤数及其发光活性, 结果见
图 3 根盒非灭菌土缩影中检测到的发光根瘤
Fig. 3 Fluorescent nodules detected in nonsterilized soil microcosms.
表 2 根盒土壤缩影中的全根系结瘤与发光检测
Table 2 Detection of nodulation and nodule fluorescent on soybean roots
in soi l microcosms
土壤缩影
Soil
microcosms
总根瘤数
Total number
o f nodules
tested
发光根瘤数
Number of
fluorescent
nodules
发光根瘤总数
To ta l number
of fluorescent nodules
检测根瘤总数
To tal umber
o f nodules
发光百分率
Percentage of
fluorescent
nodules( %)
灭菌土 Steril ized 38 42 40 37 35 38 42 40 37 35 390 390 100
43 34 39 46 36 43 34 39 46 36
非灭菌 土 Non
steri lized
44 36 38 41 33 21 16 18 20 15 170 349 48. 7
32 29 35 30 31 16 14 19 15 16
表 2. 由表 2可见,供试菌在非灭菌土中的占瘤率仅
为 48. 7% , 在根盒非灭菌土系统中检测到的发光
根瘤 X光片记录见图 3.
34 HN01DL 在根盒非灭菌土缩影中的根系区段
定殖动态
利用 luxAB 为标记基因,跟踪监测供试菌在大
豆不同生长时期根系上各区段的定殖数量的变化,
结果见表 3.从表 3可看出, HN01DL 在大豆播种 5
d后在大豆根部 A( 0~ 4 cm )区根段上达到最高定
殖密度,然后随着植物生长和根的伸长,其定殖密度
缓慢下降,但在第 33 d时又有所回升. HN01DL 可
以随根的生长,沿根系向下部扩散定殖,但并不与主
根的生长完全步调一致.至大豆生长的第 46 d时,
表 3 HN01DL在根盒非灭菌土缩影系统中的根系区段定殖动态
Table 3 Survival dynamics of HN01DL on root section in nonsteril ized soil microcosms
生长时间
Grow th
t ime ( d)
全根系各区段样品鲜重
Fresh w eight of dif ferent root sect ions ( g)
A( 0~ 4) B( 4~ 8) C( 8~ 12) D( 12~ 16) E( 16~ 22)
全根系各区段定殖密度
Colon ization intensity on dif ferent root sections( log cfu!g- 1)
A( 0~ 4) B( 4~ 8) C( 8~ 12) D( 12~ 16) E( 16~ 22)
5 0. 1098 7. 05
7 0. 1794 6. 10
11 0. 3597 0. 0723 0. 0662 6. 05 4. 34 4. 72
19 0. 3251 0. 2508 0. 2179 0. 2627 0. 1904 6. 04 4. 58 4. 46 - -
26 0. 4291 0. 4794 0. 3825 0. 2430 0. 2011 4. 61 5. 47 3. 78 - -
33 0. 4380 0. 2882 0. 3071 0. 2208 0. 2184 5. 96 5. 44 5. 41 - -
46 0. 4763 0. 2050 0. 3568 0. 1986 0. 1975 6. 92 4. 59 5. 25 4. 08 -
种子表面接种根瘤菌,可以扩散到根下 16 cm 处.
35 HN01DL 在根盒非灭菌土缩影中根系各区段
的结瘤及发光活性
从根瘤测定结果(表 4)来看, 供试菌 HN01DL
在A( 0~ 4 cm)区段形成的发光根瘤总数最多,平均
为 16. 3个. 该区段根瘤的发光比例(占瘤率) 最高
( 68. 8%) ,与该部位 HN01DL 的定殖密度最高相一
致,且发光根瘤多数又分布在该区段根系的主根上
(平均 13. 8) ,侧根上的发光根瘤数较少(平均 2. 5) .
HN01DL 在 B( 4~ 8 cm)区段形成的发光根瘤总数
居第 2位, 但在该区段主根和侧根上的分布差异较
前A 区段缩小.从A~ E区段来看,发光根瘤的比例
逐渐下降.在A( 0~ 4 cm)区段的主根上发光根瘤的
比例最高,在 E 区段则未检测到HN01DL 形成的发
光根瘤. 发光根瘤所占比例与各区段的定殖数量相
比并不完全一致, 表明接种根瘤菌早期成功的根圈
定殖在竞争结瘤过程中至关重要. 各个区段的侧根
瘤发光比例明显低于相应的主根瘤发光比例,表明
重组根瘤菌接种于种子表面后主要是沿着主根的生
长而向下迁移,其侧向运动范围是有限的.再从全根
系结瘤情况来看, 主根瘤(平均 24. 2)和侧根瘤总数
(平均 17. 8)虽然基本相当, 但主根瘤发光的比例
( 72. 7% )和侧根瘤发光的比例( 28. 1%)差异很大.
36 发光根瘤在全根系水平和垂直方向上的最大
分布距离
在供试大豆生长期内, HN01DL 在根盒土壤缩
12858 期 李友国等:费氏中华根瘤菌 HN01DL 在大豆根圈的定殖动态与结瘤研究
表 4 HN01DL在根盒非灭菌土缩影系统中的根系各区段结瘤及发
光情况
Table 4 Nodulation and fluorescence of HN01DL on different root sec
tions in non sterilized soil microcosms
项目
Item
区段结瘤状况 Nodulat ion on different root sect ion
区段主根瘤
Main nodules
on different site
T L %
区段侧根瘤
Literal nodules
on dif ferent site
T L %
区段总根瘤
Total nodules
on dif ferent site
T L %
A 15. 3 13. 8 90. 2 8. 4 2. 5 29. 8 23. 7 16. 3 68. 8
B 5. 2 3. 0 57. 7 3. 8 1. 7 44. 7 9. 0 4. 7 52. 2
C 1. 8 0. 6 33. 3 2. 2 0. 7 31. 8 4. 0 1. 3 32. 5
D 1. 4 0. 2 14. 3 1. 9 0. 1 5. 3 3. 3 0. 3 9. 1
E 0. 5 0 0 1. 5 0 0 2. 0 0 0
影系统中形成的发光根瘤距主根的最大水平距离平
均值为 3. 2 cm; 发光根瘤距茎基的最大垂直距离平
均值为 12 cm, 从一定程度上反映了种子表面接种
的根瘤菌在根圈定殖过程中沿根系的扩散范围与移
动性, 与HN01DL 在大豆根圈中的区段定殖动态测
定结果基本一致( HN01DL 可随主根生长而沿根系
扩散定殖到种子下方 16 cm 根段处) .大豆根系发光
根瘤的分布情况可参见 X光片的记录结果(图 4) .
图 4 1株大豆根系上发光根瘤的分布检测结果
Fig. 4 Dist ribution of f luorescent nodules on one soybean root .
4 结 语
供试菌 HN01DL 在根盒灭菌土壤和非灭菌土
壤缩影中的大豆全根系定殖动态与水平显著不同,
表明在非灭菌土缩影中存在来自生物因素的干扰和
影响.由于竞争和捕食等多种因素,而抑制了种子表
面接种根瘤菌在大豆根圈中的生长、繁殖和定殖, 从
一个侧面说明生物因素(在灭菌过程中被排除)在控
制接种根瘤菌在土壤和植物根圈中的群体动态与定
殖水平时发挥着非常重要的作用,进而影响到接种
根瘤菌在非灭菌土壤(田间条件下)中的占瘤率. 在
种子下方 A 区 ( 0 ~ 4 cm ) 根段范围内的供试菌
HN01DL, 由于较早地占据了有利的生态位,因而其
在该根段的群体定殖密度一直维持在较高水平, 但
由于根瘤菌在根系表面的迁移速度低于根系的发育
与生长速度,从而导致HN01DL 在其余根段的定殖
密度与水平低于 A 区( 0~ 4 cm )根段. 试验结果同
时表明, 在根盒非灭菌土壤缩影中 HN01DL 形成
的发光根瘤主要集中在种子下方 A 区( 0~ 4 cm )根
段范围内,且自 A~ E 区段的根瘤发光比例逐渐下
降,但与 HN01DL 在各区段的定殖动态与水平变化
趋势并不完全一致. 所有上述研究结果均在一定程
度上说明,接种根瘤菌在宿主植物根圈中的早期定
殖动态和定殖水平, 对其结瘤能力和竞争性具有重
要影响.鉴于 A区段的主根瘤发光比例高达 90%以
上,明显大于此区根段的侧根瘤发光比例,我们分析
种子表面的接种根瘤菌主要是随主根伸长而向下扩
散定殖, 其垂直迁移定殖速度应比侧向扩散定殖速
度快,加上侧根在向四周生长蔓延的过程中不断和
更大范围的土著微生物接触,因此侧根上的根瘤菌
定殖群体遇到的竞争性更强,其结果是接种根瘤菌
在侧根上所结发光根瘤的比例较低.
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作者简介 李友国, 男, 1966 年生, 博士, 副教授, 主要从事
固氮遗传学和分子生态学研究. Email: zjc42926@ public.
w h. hb. cn
1286 应 用 生 态 学 报 14卷