全 文 ：第 26卷第 7期
2006年 7月
环　境　科　学　学　报
　Acta Scientiae C ircum stantiae
Vo .l 26, No. 7
Ju.l , 2006
基金项目:中国高技术研究发展计划(863)项目(No. 2004AA649370);国家重点基础研究发展计划 “ 973”项目(No. 2005CB724203)
Supported byH i-tech Research and Deve lopm en t Program of C h ina(N o. 2004AA649370) and the N at iona l Basic Research Program of C hina(No.
2005CB724203)
作者简介:张志波(1982— ),男 ,硕士研究生;*通讯作者. Te l:+86 - 731 - 8822754, E-m ail:zgm ing@ hnu. cn
Biography:ZHANG Zh ibo(1982— ), m ale;*Corresponding au thor, E-m ail:zgm ing@hnu. cn
张志波 ,曾光明 ,时进钢 ,等. 2006. Tw een-80和鼠李糖脂对铜绿假单胞菌及枯草芽孢杆菌产蛋白酶的影响 [ J] . 环境科学学报 , 26(7):1152
- 1158
Zhang Z B, ZengG M , Sh i JG, et a l. 2006. E ffect ofTw een-80 and rham nolip id on the produ ction ofp rotease from Pseudom ona saerug inosa andBacil lus
subti lis[ J] . Acta S cien tiae C ircum stant iae, 26(7):1152 - 1158
Tween-80和鼠李糖脂对铜绿假单胞菌及枯草芽孢杆
菌产蛋白酶的影响
张志波 1 ,曾光明 1, * ,时进钢 1 ,刘　佳1 ,杨卫春2
1.湖南大学环境科学与工程学院 ,长沙 410082
2.南开大学环境科学与工程学院 ,天津 300071
收稿日期:2005-09-14　　　修回日期:2006-04-18　　　录用日期:2006-04-28
摘要:研究了添加表面活性剂 Tw een-80和生物表面活性剂鼠李糖脂对从堆肥中筛选得到的铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌生产蛋白酶的影响.
用固态发酵的方法 ,对添加不同浓度的表面活性剂对这 2种微生物产蛋白酶能力的影响 、2种微生物产蛋白酶能力的差异以及发酵过程中的
一些参数(包括菌体数 、酶提取液表面张力 、 pH值和挥发性有机质)进行了考察.结果表明 , Tw een-80对铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌产蛋白
酶有较大促进作用 ,添加浓度为 0. 05%时 ,能分别使铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌产蛋白酶最高酶活提高 65%和 30%;鼠李糖脂对铜绿假单
胞菌产蛋白酶有轻微抑制作用 ,但能将枯草芽孢杆菌产蛋白酶 ,当添加浓度为 0. 018%时 ,鼠李糖脂能将枯草芽孢杆菌产蛋白酶最高酶活提高
51%.铜绿假单胞菌产蛋白酶能力明显强于枯草芽孢杆菌 ,前者对照样的蛋白酶产量是后者对照样蛋白酶产量的 6倍多.发酵过程中 ,铜绿假
单胞菌酶提取液的表面张力明显低于枯草芽孢杆菌;添加表面活性剂对菌体生长有一定影响 ,但对 pH值变化影响不大;挥发性有机质变化与
微生物酶活成正相关关系.
关键词:堆肥;Tw een-80;鼠李糖脂;铜绿假单胞菌;枯草芽孢杆菌;蛋白酶;固态发酵
文章编号:0253-2468(2006)07-1152-07　　　中图分类号:X705　　　文献标识码:A
Effect of Tween-80 and rhamnolipid on the production of protease from
Pseudomonas aerug inosa andBacillus sub tilis
ZHANG Zh ibo
1 , ZENG Guangm ing1, * , SH I Jingang1 , LIU Jia1 , YANGW eichun2
1. Co llege of Environm en ta lS cien ce and E ng ineering, H unan Un iversity, Changsha 410082
2. Co llege of Environm en ta lS cien ce and E ng ineering, N ankaiUn iversity, T ian jin 300071
R eceived 14 S ep tem ber 2005;　　　 rece ived in revised form 18 Ap ri l2006;　　　 accepted 28 April 2006
Ab stract:E ffects of Tw een - 80 and Rhamno lip id on th e produ ction of p rotease by P seudomona s aerug inosa and Bacillu s sub tilis isolated from compost
w ere s tud ied in a solid subs trate ferm en tat ion(SSF) p rocess. E f fects of differen t con cen trations of su rfactan ts on the abi lity of p rotease produ ct ion, th e
d ifferences of p rotease p roduction ab i li ty betw een P seudomona s aerug inosa andB acillu s sub tilis and some other param eters, su ch as bacteria b iom ass,
su rface tens ion of crude enzym e liqu id, pH , vo latile organic m atter w ere evaluated. The resu lts ind icated that Tw een - 80 at 0. 05% sign ifican tly
increased the p roduction of p rotease from P seudomonas aerug inosa and Bacillu s subti lis by 65% and 30%. Rhamno lip id at 0. 018% cou ld p rom ote
Bacillu s subti lis to produ ce protease ob viou sly and the activity of p rotease w as increased by 51%. H ow ever, rham nolip id inhibi ted the p roduction of
p rotease f rom P seudomona saerug inosa. The y ield of en zym e from P seudomonas aeruginosa w as 6 times h igh er than that from B acillu s sub tilis. The su rface
tension of crude enzyme liqu id from P seudomonasa eruginosaw as low er th an that from B aci llus subt ilis, Su rfactan ts inf luenced the grow th of bacterium s and
the cut dow n of volatile organ icm atter had a pos itive correlation w i th the en zym e activi ty.
Keywords:compost ing;Tw een-80;rham nolipid;P seudom onas aerug inosa;B aci llus sub tilis;p rotease;SSF
DOI牶牨牥牣牨牫牰牱牨牤j牣hjkxxb牣牪牥牥牰牣牥牱牣牥牨牳
7期 张志波等:Tween-80和鼠李糖脂对铜绿假单胞菌及枯草芽孢杆菌产蛋白酶的影响
　　近年来 ,城市有机生活垃圾的无害化 、资源化
处理愈来愈受到国内外学者的重视. 其中 ,利用微
生物堆肥处理的方法对有机生活垃圾的资源化处
理意义重大 (曹作中等 , 2001). 然而 ,当前堆肥处理
中存在着发酵周期长 、降解不充分 、优势降解菌种
缺乏 、微生物降解能力不足等问题 ,使堆肥处理有
机生活垃圾的推广应用受到了限制. 堆肥过程中 ,
微生物通过产酶催化降解有机物 ,对于不同的底
物 ,微生物会产生相对应的淀粉酶 、蛋白酶 、脂肪
酶 、纤维素酶和半纤维素酶等不同的水解酶 (沈其
荣等 , 1996),进而催化水解各种底物. 蛋白质是有
机生物体的重要组成物质 ,而城市有机生活垃圾中
含有大量的厨余有机质以及人工合成的蛋白质类
物质 ,蛋白质含量很高. 如果能有效地促进堆肥中
微生物生产蛋白酶 ,提高发酵过程中微生物降解蛋
白质类物质的能力 ,必将对发酵和整个堆肥过程起
到促进作用.
目前国内外对微生物产酶的影响因素已有了
比较多的研究 ,尤华等 (2003)研究了碳源 、氮源 、金
属离子及表面活性剂等对菌株 (Aspergillussp )XZ
131产原果胶酶的影响. Ebune(1995)在发酵过程中
添加磷酸盐 、表面活性剂 、葡萄糖 ,发现当葡萄糖浓
度合适时会促进堆体中微生物生长 ,从而促进曲霉
菌产植酸酶. 另外 , 对微生物产淀粉酶 、葡萄糖甘
酶 、木质素酶 、β 2葡聚糖酶和木聚糖酶等的条件研
究也都取得了一定的成果 (Ramesh et al. , 1987;
Pushalkar et a l. , 1995;Jage r et al. , 1985;顾赛红等 ,
2003),这些研究表明 ,添加表面活性剂是影响微生
物产酶的一种方法. Goes(1999)用固态发酵的方法
研究发现 ,表面活性剂 Tw een-80可以有效地促进微
生物生产淀粉酶 , 当 Tween-80浓度为 0. 05%和
0.10%时能使固态发酵中淀粉酶的酶活提高到原来
的 6倍. Ebune A(1995)的研究表明 Tween-80和
sodium o leate对曲霉菌产植酸酶有促进作用 , 但
Triton X-100却会抑制霉菌产植酸酶酶活. Pardo
(1996)和王亚林 (2002)分别对表面活性剂对微生
物产纤维素酶的影响作用进行了研究 ,结果都显示
表面活性剂对微生物产酶有明显的影响.
表面活性剂是具有亲水基和疏水基的离子或
非离子化合物 ,具有降低表面张力 、稳定乳化液 、增
溶 、改变分子极性等作用. 表面活性剂分为化学表
面活性剂和生物表面活性剂 ,其中生物表面活性剂
是微生物在代谢过程中生成的表面活性物质 ,具有
无毒 、可生物降解等优点 (Kosaric, 1993). 表面活性
剂能够改变细胞表面的疏水性和极性等性质 ,改变
细胞膜的通透性 ,有助于菌体胞外酶的分泌和其与
底物的接触 , 从而提高微生物产酶量 (Hua et al. ,
2003).戴芳等 (2005)对其在堆肥中的应用进行了
初步的研究.
目前对表面活性剂影响微生物产蛋白酶的报
道国内外都未见报道. 由于堆肥过程微生物种类繁
多 ,反应过程复杂 ,因此 ,本实验采用固态发酵的方
法 ,选用应用较多的 Tw een-80和鼠李糖脂作为添加
表面活性剂 ,菌种选用本实验室从堆肥中筛选得到
的铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌 (Heerden et al. ,
2002;W atabe et a l. , 2004). 在只添加一种微生物的
纯培养条件下 ,研究了不同浓度表面活性剂对铜绿
假单胞菌和枯草芽孢杆菌产蛋白酶的影响 ,以期能
为表面活性剂对微生物产酶和表面活性剂在堆肥
中的进一步应用提供有价值的资料.
1 材料与方法(Mate ria ls andme thods)
1. 1 材料
菌种:铜绿假单胞菌 、枯草芽孢杆菌为本实验
室从堆肥过程中筛选得到.
表面活性剂:Tw een-80从化学公司购买 ,鼠李
糖脂为本实验室制取得到.
富集培养基:牛肉膏 5 g,蛋白胨 10 g, NaC l 5 g,
蒸馏水 1000 mL, pH 7. 0 ～ 7. 4,用于富集培养铜绿
假单胞菌和枯草芽孢杆菌.
平板培养基:牛肉膏 5 g,蛋白胨 10 g, NaC l 5 g,
琼脂 18 g,蒸馏水 1000mL, pH 7. 0 ～ 7. 4,用于平板
计数.
发酵培养基:葡萄糖 18. 0 g, N a2HPO 4 12H2O
1. 5g, KH 2PO4 1.5 g, MgSO 4 7H2O 0. 1 g, FeSO4 7H 2
O 0. 01 g, NaNO 32. 0 g, 蒸馏水 1000 mL, pH值 6.
5,用于制备鼠李糖脂.
1. 2 方法
1. 2. 1 鼠李糖脂的制备 　接铜绿假单胞菌 P
aeruginosa(CCTCC AB93066)于含 100mL发酵培养
基的 1000 mL锥形瓶中 ,置于旋转式摇床中培养
48h,温度为 37℃,转速为 200 r min- 1. 将发酵液调
pH至 8. 0后 ,置于离心机中 10000 r min- 1离心 10
m in除菌体 ,上清液用 36%HC l调 pH至 2. 0,出现
絮状沉淀后 4℃静置过夜 ,在 10000 r m in- 1离心机
上低温(4℃)离心 10 m in,收集沉淀 ,冷冻干燥 ,得
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环　　境　　科　　学　　学　　报 26卷
鼠李糖脂粗品(戴芳等 , 2005).
1. 2. 2 表面活性剂对铜绿假单胞菌 、枯草芽孢杆
菌产蛋白酶的影响　固态发酵的堆料选用配比为
大米∶麸皮∶蔬菜∶膨松剂 (锯末 )=4∶2∶1∶3(均为干
重 ),含水率控制在 60%(质量分数 ),碳氮比(C /N)
为 30左右. 以铜绿假单胞菌为例 ,取 5个 1 L的三
角瓶 ,各加 150 g堆料 ,组成 5个样品 ,以不加表面
活性剂的样品为对照 ,另外 4个三角瓶分别加入
0.05%Tw een-80, 0. 15%Tw een-80, 0. 006%鼠李糖
脂 , 0. 018%鼠李糖脂(均为质量分数),然后将堆料
搅拌均匀 ,于 115℃下灭菌 30m in;再在无菌操作条
件下 ,各加入经富集培养基富集培养 24 h后的铜绿
假单胞菌菌液 5mL,混合均匀后构成 5组样品 ,每组
样品设 3个重复;最后在 37℃下恒温培养. 由于发
酵底物蓬松且厚度只有 5 cm左右 ,每天早 、中 、晚各
振荡摇瓶一次即可保持好氧环境.在培养的第 1、3、
6、9、12、15天取样测定菌体所产胞外蛋白酶的活力
及各项指标 (预试验表明酶活变化周期约 15 d,且
变化趋势平稳). 枯草芽孢杆菌样品的操作步骤 ,除
了在灭菌后 5个样品各加入 5 mL枯草芽孢杆菌菌
液外 ,其它步骤与铜绿假单胞菌样品操作相同.
1. 2. 3 蛋白酶活力的测定　酶液的提取:取样品 3
g至 100 mL锥形瓶中 ,加入 27 mL无菌水 ,震荡 60
m in,静置 5m in,取 1mL澄清液进行稀释涂平板.剩
余液体于 6000 r m in- 1离心 10 m in,取上清液 ,即酶
提取液置于 100mL具塞锥形瓶中备用.
蛋白酶酶活测定步骤如下 (张继红等 , 1996):
先将酶液和浓度为 2%的酪蛋白溶液于 40℃水浴保
温 3 m in.取酶液 1mL于试管中 ,加入酪蛋白溶液 1
mL, 40℃水浴反应 10 m in;再加入 2 mL三氯醋酸 ,
立即摇匀 ,静置 10m in;6000 r m in-1离心 10m in,取
上清液 1 mL于一干燥试管中 ,加入 0. 4 mol L -1碳
酸钠 5mL,再加入福林试剂 1 mL,摇匀 ,放入 40℃
水浴锅水浴显色 20 m in. 最后在 680 nm下测定吸光
度 A.每个样品的空白只需将加入 2mL三氯醋酸的
步骤移至加入酪蛋白之前 ,其它步骤一样. 另外 ,用
1 mL无菌水加入 0. 4mol L -1碳酸钠 5mL和福林试
剂 1 mL, 40℃水浴显色 20m in后 ,用于分光光度计
的调零.
根据标准曲线得到吸光度 A所对应的产生酪
氨酸的量 C(μg mL -1),由以下公式计算酶活M:
M =C ×F ×4 /10 (1)
式中 , C为酶解产生的酪氨酸 (μg mL- 1), F为稀释
倍数 , 4为 4 mL反应液取 1mL上清液用于福林显
色 ,而起始酶液也为 1mL,稀释了 4倍 , 10为反应时
间 ,M单位为 U g- 1.
1. 2. 4 稀释平板法计菌体数　酶液的提取中 ,震
荡后的菌液稀释度为 10- 1 ,无菌条件下 ,取 1mL澄
清液加入 9mL无菌水中 ,震荡均匀 ,制成稀释度为
10
-2菌液 ,依此类推 ,制成 10- 7、10-8 、10- 9 3个稀释
度的菌液 ,并以此 3个稀释度菌液涂平板 ,计算菌
体数.
1. 2. 5 表面张力 、pH 值 、挥发性有机质的测定　
酶液的表面张力和 pH值直接用表面张力仪和 pH
计测得. 挥发性有机质用马福炉灼烧法测定
(550℃, 5h).
1. 3 数据处理方法
数据采用 M icroso ftExce l和 SPSS10. 0软件进行
有关数据计算 、统计与处理.
2 结果 (Results)
2. 1 表面活性剂对铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌
产蛋白酶的影响
通过在堆料中添加不同浓度的 Tw een-80和鼠
李糖脂考察了表面活性剂对铜绿假单胞菌和枯草
芽孢杆菌产蛋白酶的影响. 表面活性剂对铜绿假单
胞菌在发酵过程中产蛋白酶的影响如图 1所示.
图 1 表面活性剂对铜绿假单胞菌产蛋白酶的影响
Fig. 1 E ffects of su rfactan ts on th e protease produ ction from
P seudom onas aerug inosa
从曲线变化趋势来看 ,加了 Tw een-80的样品蛋
白酶酶活在发酵早期高于对照 , 而后期迅速下降 ,
又低于对照;生物表面活性剂鼠李糖脂对铜绿假单
胞菌产蛋白酶有抑制作用 ,且随着浓度的增大抑制
作用有所加强. 2个浓度的 Tween-80都能使铜绿假
单胞菌产蛋白酶的高峰期提前 ,加了 Tween-80的样
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7期 张志波等:Tween-80和鼠李糖脂对铜绿假单胞菌及枯草芽孢杆菌产蛋白酶的影响
品在发酵的第 6天蛋白酶活性达到最大值. 和对照
相比 , Tw een-80使蛋白酶产酶高峰期提前了 6d;其
中添加 0. 05%浓度的 Tween-80能明显促进微生物
产酶 ,使最高酶活达到 766. 87U g- 1 ,而对照样的最
高酶活为 464. 60 U g- 1 ,蛋白酶活性提高了 65%.
添加 0. 15%Tween-80仅能使最高酶活提高 8. 1%,
对产酶量并无明显促进作用. 另外 ,对产酶最高值
差异的显著性检验结果表明 ,添加 0. 05%、0. 15%
Tw een-80的样品组与对照样品组最高酶活差异显
著 , 2组样品的标准差 s值分别为:5. 462、4. 078 , t
值分别为:95. 868、15. 927(t0. 05 =4. 303),即能显著
提高蛋白酶酶活;添加 0. 006%、0. 018%鼠李糖脂
的样品组与对照样品组最高酶活差异显著 , s值分
别为:4. 912、5. 260, t值分别为:-20. 133、 - 56. 602
(t0. 05 =4. 303),即能显著降低蛋白酶酶活.
表面活性剂对枯草芽孢杆菌在发酵过程中产
蛋白酶的影响如图 2所示.
图 2 表面活性剂对枯草芽孢杆菌产蛋白酶的影响
Fig. 2 E f fects of su rfactan ts on the p rotease p roduction from
Bacillu s subti lis
由图 2可知 ,不同浓度 Tw een-80和鼠李糖脂对
枯草芽孢杆菌产蛋白酶都有一定的促进作用.添加
0. 05%Tw een-80、 0. 15%Tw een-80、0. 006%鼠李糖
脂和 0. 018%鼠李糖脂分别能使枯草芽孢杆菌产蛋
白酶的最高酶活提高 30%、 10. 3%、 12. 5%、 50.
7%,但最高值出现的时间并不在同一天 , 0.018%的
鼠李糖脂对枯草芽孢杆菌产蛋白酶的促进作用最
大.随着 Tw een-80浓度的增加 ,其对枯草芽孢杆菌
产蛋白酶的促进作用下降 ,而随着鼠李糖脂浓度的
增加 ,其对枯草芽孢杆菌产蛋白酶的促进作用明显
增强. 对产酶最高值差异的显著性检验结果表明 ,
添加 0. 05%、 0. 15% Tween-80, 添加 0.006%、
0.018%鼠李糖脂的 4组样品与对照组样品的最高
酶活均差异显著 , s值分别为 2. 101、1.706、2. 452、
2. 718, t值分别为 17. 980、 7. 717、 6.429、 23. 574
(t0. 05 =4. 303),即都能显著提高蛋白酶酶活.
比较图 1和图 2可知 ,铜绿假单胞菌和枯草芽
孢杆菌产蛋白酶能力有很大差异 ,铜绿假单胞菌产
蛋白酶能力明显强于枯草芽孢杆菌.两者对照样的
蛋白酶活性分别可达到 464. 60 U g- 1和 72. 92
U g -1 ,铜绿假单胞菌产蛋白酶活性是枯草芽孢杆
菌产酶活性的 6倍多.
2. 2 发酵过程中菌体生长情况
试验同时测定了发酵过程中的微生物生长情
况 ,平板计数结果如图 3所示.
图 3　 2种微生物菌体数 CFU变化
F ig. 3 CFU of b acterium s
铜绿假单胞菌菌体生长如图 3a所示 , 2个浓度
的 Tween-80对铜绿假单胞菌菌体生长并无明显影
响;而鼠李糖脂对铜绿假单胞菌菌体生长有较大的
抑制作用 ,且鼠李糖脂浓度越高 ,其对铜绿假单胞
菌菌体生长的抑制作用就越大. 枯草芽孢杆菌菌体
生长如图 3b所示 , 0. 05%Tw een-80和 2个浓度的鼠
李糖脂对枯草芽孢杆菌的生长都有明显促进作用 ,
而 0. 15% Tween-80对菌体生长前期抑制 、后期
促进.
1155
环　　境　　科　　学　　学　　报 26卷
2. 3 酶提取液表面张力的变化
发酵过程中分别测定了铜绿假单胞菌和枯草
芽孢杆菌堆料的酶提取液的表面张力的变化 ,结果
如图 4所示.
图 4 不同菌体中酶提取液表面张力的变化
Fig. 4 surface tension of crude en zym e liqu id
整个发酵过程中铜绿假单胞菌酶液表面张力
会迅速下降 ,然后维持在 43 mN m -1左右 ,而枯草
芽孢杆菌则基本不变或略有上升 , 然后维持在
50mN m -1左右. 加了表面活性剂的样品与对照样
相比表面张力没有明显变化.
2. 4 酶提取液 pH值变化
试验测定了发酵过程中酶提取液的 pH 值变
化 ,结果如图 5所示.
2种微生物各自 5组发酵样品的酶提取液的
pH值变化总体趋势相近 ,添加 0. 15%Tw een-80的
枯草芽孢杆菌样品提取液的 pH 值刚开始升高 ,从
第 3天开始突然下降 ,而后几乎稳定不变.其它各组
样品刚开始的 6d pH逐步上升 ,而后开始下降 ,但下
降时间和程度各不相同.
2. 5 堆料中挥发性有机质含量的变化
试验测定了发酵前后堆料干样中挥发性有机
质的变化情况. 2种菌样品堆料中挥发性有机质的
变化如表 1所示. 对于铜绿假单胞菌 ,添加 0. 05%
图 5 不同菌体酶提取液 pH值的变化
Fig. 5 pH of crud e enzym e liqu id
和 0. 15%Tween-80的样品组 ,有机质含量分别下降
了 6. 35%和 6. 03%, 下降量明显大于对照样的
5.53%.添加了 0. 006%和 0. 018%鼠李糖脂的样品
有机质含量分别下降 5. 68%和 5. 39%.
对于枯草芽孢杆菌 , 对照样的有机质下降了
5.06%,添加 0. 05%Tw een-80、0. 006%鼠李糖脂和
0. 018%鼠李糖脂的样品有机质分别下降 5. 97%、
5. 74%和 6. 06%,都大于对照样品.
另外对不同组的挥发性有机质减少量进行了
显著性检验 ,检验结果表明 ,对于铜绿假单胞菌 ,添
加 0. 05%、0. 15%Tween-80和 0. 006%鼠李糖脂的
样品组与对照样品组有机质减少量差异显著 , s值
分别为 0. 044、0. 046、 0. 036, t值分别为 32. 583、
18.898、7. 206(t0. 05 =4. 303),即能显著提高有机质
降解量. 而添加 0. 018%鼠李糖脂的样品组与对照
样品组有机质减少量差异也显著 , s值为 0. 017, t值
为 - 14. 013( t0. 05 =4. 303),即能显著降低有机质降
解量;对于枯草芽孢杆菌 ,添加 0. 05% Tw een-80、
0.006%和 0. 018%鼠李糖脂的样品组与对照样品
组有机质减少量差异显著 , s值分别为 0. 036、
0.044、0. 046, t值分别为 43. 715、 27. 020、 37. 796
1156
7期 张志波等:Tween-80和鼠李糖脂对铜绿假单胞菌及枯草芽孢杆菌产蛋白酶的影响
( t0. 05 =4. 303),即能显著提高有机质降解量. 而添
加 0. 15%Tw een-80的样品组与对照样品组有机质
减少量差异不显著.
表 1 2种菌样品堆料中挥发性有机质的变化
Tab le 1 volatile organ icm atter of tw o bacterium s
样品组 铜绿假单胞菌初始含量 最终含量 减少含量
枯草芽孢杆菌
初始含量 最终含量 减少含量
对照 95. 27% 89. 74% 5. 53% 95. 96% 90. 90% 5. 06%
0. 05%Tw-80 95. 73% 88. 58% 6. 35% 95. 44% 88. 62% 5. 97%
0. 15%Tw-80 95. 57% 89. 34% 6. 03% 95. 31% 89. 23% 5. 08%
0. 006%鼠李糖脂 95. 35% 89. 67% 5. 68% 96. 13% 89. 86% 5. 74%
0. 018%鼠李糖脂 95. 67% 89. 28% 5. 39% 95. 56% 88. 60% 6. 06%
3 讨论 (D iscussion)
一般认为表面活性剂通过促进微生物的大量
生长从而提高酶产量. 由本研究的微生物产酶和微
生物生长结果对比可知 ,鼠李糖脂能够通过抑止微
生物生长进而抑止铜绿假单胞菌产蛋白酶;但
Tw een-80并不能明显促进铜绿假单胞菌菌体的生
长 ,但却提高了蛋白酶的酶活 ,这说明酶活提高的
主要原因不是因为菌体的大量生长. Sheppard
(1991)和 Hua(2003)的研究都证明 ,表面活性剂能
使细胞膜双分子层产生特定的离子通道 、改变细胞
表面性质以及粒子极性 ,而 Coope r(1986)很早就发
现表面活性剂能促进胶体表面吸附能力下降 、脱
水.因此推测 ,蛋白酶活性提高的主要原因是因为
表面活性剂改变了微生物表面的性质和在堆料环
境中的界面张力及胶团性质 ,促进了酶的释放和介
质的分散吸收;铜绿假单胞菌酶活高于枯草芽孢杆
菌 ,而前者酶液的表面张力明显低于后者 ,也说明
铜绿假单胞菌堆体中物理化学性质变化较大 ,这也
正好与推论吻合.
实验中发现 ,随着 Tw een-80浓度的增加 ,其对
铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌产蛋白酶的促进作
用下降.鼠李糖脂浓度的增加 ,对铜绿假单胞菌产
酶抑制作用增强.但鼠李糖脂对枯草芽孢杆菌产蛋
白酶有促进作用 ,随着鼠李糖脂浓度的增加 ,促进
作用反而明显增强. 这说明并不是表面活性剂的浓
度越高 ,对产酶的促进作用就越大 ,不同浓度 、不同
种类表面活性剂对不同的微生物产酶的影响也不
一样.
微生物在降解底物的过程中释放酶并不断生
长.从图 1、2、3中观察到 ,大部分样品产酶高峰出现
在微生物生长高峰后 ,但也有个别样品的产酶高峰
与微生物生长高峰出现在同一天或稍前. 分析认为
这是因为微生物生长并不是靠降解蛋白质一种底
物 ,同时还会降解堆体中的淀粉 、纤维素 、半纤维素
等 ,因此微生物在产蛋白酶能力开始下降后仍有可
能利用其它底物而使其生物量保持一定的提高.
从酶提取液表面张力变化图可以看到 ,添加了
表面活性剂的样品与对照样品的酶提取液表面张
力并没有明显差异性 ,分析认为微生物在代谢过程
中的部分分泌物 、底物降解过程中的中间产物也能
够使环境的表面张力发生变化 ,同时表面活性剂的
添加量相对堆料来说是十分微量的 ,因此 ,在表面
张力上 5个样品间没有表现出明显差异性.
发酵过程中酶液的 pH值变化为先有所升高 ,
而后下降.这是因为在堆制初期 (0 ～ 6d)堆料中有
机氮分解会产生较多氨氮 ,使 pH值迅速升高;到堆
制后期(7 ～ 15d),易降解有机物减少 ,微生物分解
速率下降 , pH值开始回落. 添加表面活性剂的样品
和对照样品 pH值变化规律之间无明显区别 ,说明
添加表面活性剂对堆体 pH值的变化无明显影响.
从各样品挥发性有机质减少的情况以及各组
样品差异的显著性检验结果可以看出 ,添加了表面
活性剂而使酶活提高的样品其挥发性有机质下降
要明显大于对照样品 ,这说明利用添加表面活性剂
的方法可以达到促进微生物产酶 ,提高有机质降解
率的显著效果.
表面活性剂对微生物产酶的影响已经被国内
外学者所证实 ,但其对产酶影响的具体机理还不明
确 ,表面活性剂对微生物本身和底物的具体影响 、
化学表面活性剂和生物表面活性剂的影响差异以
及表面活性剂影响产酶在实际堆肥中的应用等问
1157
环　　境　　科　　学　　学　　报 26卷
题还有待进一步的深入研究.
4 结论 (Conclusions)
1)在固态好氧发酵中 ,一定浓度的 Tw een-80对
铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌产蛋白酶都有一定
促进作用 , 0. 05%Tween-80能分别提高 2种微生物
所产蛋白酶酶活 65%和 30%.
2)鼠李糖脂对铜绿假单胞菌产蛋白酶有一定
抑制作用 ,但对枯草芽孢杆菌产蛋白酶有促进作
用 , 0. 018%鼠李糖脂能提高蛋白酶酶活 50%多.
3)表面活性剂促进微生物产蛋白酶的原因 ,不
仅是促进微生物菌体的大量生长 ,更主要在于表面
活性剂改变了微生物细胞表面的性质和堆料环境
中的界面作用力及胶团性质 ,促进了酶的释放和介
质的分散吸收.
4)在发酵底物 、温度 、pH值和表面活性剂浓度
等条件相同的情况下 ,铜绿假单胞菌产蛋白酶能力
明显强于枯草芽孢杆菌.
5)通过添加一定浓度的表面活性剂 ,能促进微
生物产酶 ,进而一定程度地提高有机质降解率.
责任作者简介:曾光明(1962— ), 男 ,教授 ,国家教育部长江
学者特聘教授 、国家自然科学基金杰出人才基金获得者. 主
要从事环境系统工程 、废水 、废气的治理 、城市生活垃圾的综
合利用等领域环境生物与控制方面的研究. E -m ail:zgm ing
@hnu. cn.
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