全 文 ：第 20 卷 第 5 期
2011 年 9 月
云南民族大学学报(自然科学版)
Journal of Yunnan University of Nationalities(Natural Sciences Edition)
Vol． 20 No． 5
Sep． 2011
收稿日期:2011 － 06 － 20．
基金项目:国家自然科学基金(21025207;20975092)．
作者简介:尤珠双(1986 －) ，女，硕士研究生，主要研究方向:有机分析．
通讯作者:潘远江(1966 －) ，男，博士，教授，博士生导师，2006 年入选教育部新世纪优秀人才，2010 年获国家杰出青年基
金．主要研究方向:有机分析．
doi:10． 3969 / j． issn． 1672 － 8513． 2011． 05． 006
液质联用技术快速识别喜树叶
提取物中的微量活性成分
尤珠双1，徐晓燕2，郭 成1，潘远江1
(1. 浙江大学 化学系，浙江 杭州 310027;2 浙江海正药业股份有限公司，浙江 台州 318000)
摘要:应用高效液相色谱 /电喷雾串联质谱联用技术 (HPLC /ESI － MSn)对药用植物喜树叶提
取物中的微量活性成分进行分析研究，探讨了喜树叶中喜树碱类及鞣花酸类化合物的质谱裂解
规律，建立了 1 种快速识别喜树中喜树碱类生物碱和鞣花酸类成分的液质联用方法;运用这一方
法在线识别了 5 个喜树碱类生物碱和 5 个鞣花酸类成分，其中 3 个推测为新化合物．
关键词:液质联用技术分析;喜树叶提取物;喜树碱;鞣花酸
中图分类号:R 284． 1 文献标志码:A 文章编号:1672 － 8513(2011)05 － 0340 － 08
Rapid Identification of Minor Active Constituents of Leaves of
Camptotheca by HPLC /ESI －MSn
YOU Zhu-shuang1，XU Xiao-yan2，GUO Cheng1，PAN Yuan-jiang1
(1． Department of Chemistry，Zhejiang University，Hangzhou 310027，China;
2． Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co．，Ltd．，Taizhou 318000，China)
Abstract:The minor active constituents of alkaloids and ellagic acids in leave extracts of Camptotheca were investi-
gated by HPLC /ESI － MSn． In this study，the characteristic fragmentation patterns of camptothecin and ellagic acid
were discussed，and a rapid and sensitive method was developed for the characterization and identification of alka-
loids and ellagic acids in Camptotheca． With this method，5 alkaloids and 5 ellagic acids were rapidly identified，a-
mong which 3 are new compounds．
Key words:HPLC /ESI － MS;Camptotheca;alkaloid;ellagic acid
喜树(Camptotheca acuminata Decne) ，为珙桐科(Nyssaceae)喜树属(Camptotheca Decne)植物，在我国有
广泛分布，广西壮族民间常用以治疗各种肿瘤［1］．喜树是一种重要的药用植物，美国科学家 Wall 早在 1966
年就从中国喜树的树茎提取液中分离得到了喜树碱［2］，而喜树碱衍生物制剂［3］如伊立替康(irinotecan)和托
泊替康(topotecan)药物已于 1996 年经美国 FDA 认证并批准投入临床应用．喜树碱类活性成分的主要药理
作用是以拓朴异构酶Ⅰ(topoisomeraseⅠ)为作用靶抑制 DNA的合成，从而对化学物质诱导癌变等发生明显
的抑制作用［4 － 5］．随后的研究发现喜树活性成分制成的多种药物可用于治疗胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肺
癌、卵巢癌、肠癌、子宫颈癌以及胃癌等各种癌症［6］．基于喜树在医疗上的重要应用价值，对其化学成分的研
究一直备受关注［7 － 13］，研究表明喜树的主要活性成分为喹啉类生物碱、黄酮以及鞣花酸类化合物［11］，其喹
啉类生物碱主要为喜树碱及其衍生物．现已证实，喜树全株含喜树碱，其中果实中含量最高［9］;另有喜树次
碱、10 －羟基喜树碱、11 －羟基喜树碱、9 －甲氧基喜树碱、脱氧喜树碱、喜树苷、喜树碱的糖结合物等［8，13］．
过去对喜树中化学成分的分析，通常需通过色谱等方法对其提取分离以获得适量的纯化合物(一般需
5 mg以上) ，再进行核磁共振等现代波谱技术结构鉴定．这种分离分析方法往往费力耗时，不仅所需样品量
大且易忽略微量成分，目标导向性不强．本研究应用高效液相色谱 －质谱联用(HPLC － MS)方法，对喜树提
取物中活性成分进行快速在线分离分析研究．由于 HPLC － MS方法同时兼备了高效液相色谱的高效分离能
力和质谱的高灵敏度及定性准确的特点，根据质谱给出的丰富的分子量和结构碎片信息，可直接快速地识别
喜树碱提取物中的活性成分特别是其中的微量成分．
1 实验部分
1． 1 样品与试剂
喜树叶提取物与喜树碱标准品由浙江海正药业股份有限公司提供．色谱纯乙腈和甲醇购于德国 Merck
公司;实验用去离子水由纯净水经美国 Milli － Q纯化水装置处理后获得．高分辨质谱校正用的三氟醋酸钠购
自 Alfa Aesar公司．
1． 2 高效液相色谱分析条件
Agilent 1100 液相色谱仪，配备 G1312 二元泵，G1314A紫外检测器，20 μL进样环的 Rheodyne 7755 型手
动进样器以及 Agilent化学数据处理工作站．待测样品在依利特 ODS18反相柱(4． 6 mm × 150 mm × 3. 5 μm)、
室温下以乙腈和水为流动相进行梯度洗脱．梯度洗脱条件设为:0 ～ 40 min，乙腈从 20%线性增加至 30%;40
～ 80 min，乙腈从 30%线性增加至 50% ．流速为 0． 6 mL /min，检测波长为 252 nm．
1． 3 高效液相色谱 /质谱分析条件
液质谱联用分析在 Agilent的 HPLC系统和 Bruker的 Esquire 3 000 plus 离子阱质谱上进行，配备电喷雾
离子源(ESI) ，离子阱质量分析器，数据通过 Esquire 5． 0 软件处理．样品从高效液相色谱仪通过 T 型三通阀
以分流比 2∶1 引入质谱离子源内，离子检测模式为正离子模式．离子源温度为 250 ℃，氮气作为干燥器和雾
化器，分别设为 10 L /min 和 30 psi．氦气(约 0. 6 mPa)作为碰撞气引入离子阱中用以提高诱捕效率．喷雾电
压为 4． 0 kV;离子扫描范围 103 ～ 1 000 m/z．
1． 4 傅立叶变换离子回旋共振质谱分析条件
离线的高分辨 ESI － FTICR － MS实验在 Bruker的 7． 0T活性屏蔽超导磁体的 ApexⅢ傅立叶变换离子回
旋共振质谱仪上完成，仪器配有外置的 Apollo 电喷雾离子源．样品溶液通过 Cole － Parmer syringe 泵系统以
3． 0μL /min的流速进入离子源，准确的质量数测量以三氟醋酸钠为外标．在多级质谱实验中，以相关扫描提
取母离子，碰撞诱导解离(CID)用持续非共振脉冲激发，氩气作为碰撞气．用 XMASS 6. 1. 1 版本的数据软件
进行数据处理．
2 结果与讨论
2． 1 喜树叶提取物的 HPLC /ESI －MS分析和 FTICR －MS分析
喜树提取物经 HPLC /ESI －MS分析得到 10个主要成分见图 1，且都检测到它们的［M +H］+和［2M + H］+
的离子峰，借此可以确定各成分的可能分子量．各成分经 FTICR － MS 分析，可确定它们准确的化学元素组成，
列于表 1．结合喜树植物化学成分文献研究［8 － 13］，可初步推测这 10个成分为生物碱类和多酚类化合物．
143第 5 期 尤珠双，徐晓燕，郭 成，等:液质联用技术快速识别喜树叶提取物中的微量活性成分
表 1 喜树提取物各成分的相对分子质量信息和高分辨质谱数据
成分 相对分子质量 实测值 计算值 元素组成 误差 /10 － 6
1 364 365. 113 4 365. 113 2 C20H17N2O +5 + 0. 55
2 364 365. 113 2 365. 113 2 C20H17N2O +5 0
3 348 349. 118 6 349. 118 3 C20H17N2O +4 + 0. 86
4 378 379. 129 0 379. 128 8 C21H19N2O +5 + 0. 53
5 332 333. 124 7 333. 123 4 C20H17N2O +3 + 3. 9
6 328 329. 028 8 329. 029 2 C16H9O +8 － 1. 2
7 356 357. 060 1 357. 060 5 C18H13O +8 － 1. 12
8 356 357. 060 3 357. 060 5 C18H13O +8 － 0. 56
9 372 395. 038 9 395. 037 4 C18H12O9Na + + 3. 797
10 342 343. 046 4 343. 044 8 C17H11O +8 － 4. 66
2． 2 喜树碱标准品的 ESI － MSn 分析
喜树碱分子式是 C20H16N2O4，相对分子质量为 348．在正离子模式下(图 2) ，质子化发生在内酯环(E)的
羰基氧上(m/z 349) ，二级(CID)质谱中主要丢失 44 u，即丢失一分子的 CO2，内酯环开环生成 m/z 305 碎片
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离子．另外还存在丰度较小的 m/z 277，249 碎片离子，这也是 m/z 305 产
物离子的三级质谱的 2 个主要产物离子峰，即 m/z 277，249 碎片离子分
别由碎片离子 m/z 305 丢失 28 u即一分子乙烯(C2H4)和再丢失 28 u 即
一分子 CO形成的．在四级质谱图中，m/z 249 离子丢失 18 u 即一分子水
(H2O)得到 m/z 231 碎片离子，丢失 28 u (CO)得到碎片离子 m/z 221，丢
失 43 u即一分子异氰酸(NHCO)得到碎片离子 m/z 206．
从以上喜树碱的多级质谱碎裂方式可以看出，喜树碱在二级质谱中
具有 44 u(CO2)的特征中性丢失，在三级质谱中则具有 28 u(C2H4)和 56
u(CO + C2H4)的特征中性丢失，在四级质谱中还有 28 u(CO)和 43 u(NHCO)的特征中性丢失．根据喜树碱
的碎裂方式和特征丢失可总结出了喜树碱类生物碱的质谱裂解规律(见图 4a) ，同时可推测出质子化喜树碱
的多级质谱碎裂途径(见图 4b)．
2． 3 喜树叶提取物的 HPLC /ESI － MSn 分析
通过各成分的多级质谱图中可以看出，成分 1 ～ 5 的 CID 质谱图中均有 44 u(CO2)、28 u(C2H4)、28 u
(CO)的特征中性丢失，和喜树碱的质谱裂解规律相似，可推测成分 1 ～ 5 均为喜树碱类生物碱．
成分 1 和成分 2 分子质量相同，经 ESI － FTICR － MS 实验(见表 1)确证，两者元素组成相同，则两者应
互为同分异构体，且和喜树碱分子质量差 16 u(O) ，质谱碎裂方式和喜树碱类似(如图 5 ～ 6 所示) ，据此可推
测成分 1 和 2 均为羟基喜树碱．二者不同的是成分 2 先丢失 44 u(CO2) ，与喜树碱裂解方式相同，表明羟基
对裂解没有影响，其羟基在 A环上，成分 2 为 10 －羟基喜树碱［14 － 15］，为喜树中已报道的化合物(见图 7b) ;
而成分 1 的羟基则可能在 E环上，因为成分 1 优先丢失 18 u(H2O) ，再丢失 44 u(CO2) ，表明羟基对裂解有
影响，推测其位置可能在内酯环的亚甲基上，故成分 1 的可能结构为 17 －羟基喜树碱(图 7a) ，该结构尚未见
报道，推测为新化合物．图 8 为成分 1 的可能裂解机理．
同样，对比成分 3 ～5质谱碎裂方式与喜树碱的质谱碎裂方式，发现它们的碎裂方式均相似，结合 ESI － FTICR
－MS数据并参照文献［8 －11］，推测成分 3 ～5分别为 9 －甲氧基喜树碱、喜树碱和 20 －脱氧喜树碱(见图 9)．
从成分 6 ～ 10 的多级质谱图可看出它们没有 44 u(CO2)等的特征中性丢失，却均含 15 u(·CH3) ，28 u
(CO)的特征丢失，另外成分 9 还有 18 u(H2O)的特征丢失，组分 8 和 10 均有 30 u(2·CH3) ，56 u(2CO)的特
征丢失，与文献中酚类的鞣花酸化合物的特征丢失一致［16 － 18］(见图 10) ，参照喜树中已报道的鞣花酸化合物
结构特征［11］，推测成分 6 ～ 10 可能属于鞣花酸化合物．其中与成分 6、9 和 10 分子质量相同的化合物在喜树
研究中已有报道［11］，根据它们的多级质谱图和 ESI － FTICR － MS数据(见表 1)可推测成分 6、9 和 10 的化合
物结构图 11．而与成分 7 和 8 分子质量相同的化合物在喜树研究中还未见报道，推测可能为新成分．
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成分 7 和 8 相对分子质量均为 356，根据
ESI － FTICR － MS 数据(表 1)可知成分 7 和 8
互为同分异构体，且它们的相对分子质量比成
分 10 多 14(CH2)．比较它们的多级质谱图(见
图 12 ～ 13)发现两者的质谱碎裂方式不同，推
测可能是它们对应的取代基位置有差异．成分
7 和 8 的碎裂方式和成分 9 和 10 的碎裂方式
比较相似，都有 15 u(·CH3)的丢失，另外两者
均无 18 u(H2O) ，说明结构中不含羟基．成分 7
只有 1 个 15 u(·CH3)的丢失说明取代基中只
有一个甲氧基，因其比成分 10 多 1 个 CH2，故
推测另外 1 个取代基为乙氧基，其可能结构如
图 14(a)所示．成分 8 有连续 2 个 15 u(·CH3)
的丢失说明取代基中有 2 个甲氧基，故多出的
CH2 推测在 5位点上，表现为甲基取代基，其
可能结构如图 14(b)所示．这 2 个结构均未见
报道，可能为新化合物．
3 结论
本研究建立了一种快速、灵敏、准确地鉴
定喜树中喜树碱类生物碱和鞣花酸类成分的液质联用分析方法．在对喜树碱进行多级 CID质谱分析的基础
上，总结出了基于结构特征的喜树碱类化合物的质谱碎裂规律，利用这个规律，成功运用 HPLC /ESI － MSn 快
速识别了喜树提取物中的 5 个喜树碱类成分，推测其中成分 1 为新的生物碱类化合物;在比较鞣花酸类化合
物的质谱碎裂方式规律的基础上，推测出 2 个新的鞣花酸类化合物．该方法对于快速识别具有复杂组成的天
然化合物尤其是其中的微量活性成分非常有效．
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(责任编辑 戴 云)
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