全 文 ：蛇接骨草提取物对 U2-OS细胞增殖及细胞
周期的影响
付达华1，刘志礼2，林泽燕1
(1．漳州市卫生职业学院 药学系，福建 漳州 363000;2．南昌大学第一附属医院 骨外科，江西
南昌 330006)
摘要:目的 研究蛇接骨草提取物对 U2-OS 细胞的增殖抑制作用及对 U2-OS 细胞周期的影响。方法 以
95%乙醇进行提取(提取物简称 GPE)。MTT 法检测 GPE 对 U2-OS 细胞的增殖抑制作用，Annexin V-
FITC凋亡检测试剂盒分析 GPE对 U2-OS细胞的凋亡诱导作用，流式细胞术分析 GPE对 U2-OS 细胞周
期的影响。结果 GPE剂量依赖性抑制 U2-OS细胞的增殖，IC50为 72 μg·mL
－1;GPE可诱导 U2-OS细胞
凋亡，并将 U2-OS细胞阻滞在 G0 /G1 期。结论 蛇接骨草具有抗肿瘤活性。
关键词:蛇接骨草;U2-OS细胞;IC50;凋亡;细胞周期
中图分类号:R965 文献标识码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1006-8783． 2011． 05． 021
文章编号:1006-8783(2011)05-0521-04
Effect of Gynura procumbens(Lour．)MERR． extract on proliferation and cell cycle in U2-
OS cells
FU Da-hua1，LIU Zhi-li2，LIN Ze-yan1
(1． Department of Pharmacy，Zhangzhou Health Vocational College，Zhangzhou 363000，China;
2． Department of Orthopeadic Surgery，the First Affiliated Hospital，Nanchang University，Nanchang 330006，
China)
Abstract:Objective To investigate the effect of Gynura procumbens(Lour．)MERR． extract(GPE)on
proliferation and cell cycle in U2-OS cells．Methods MTT assays were performed to study the inhibition of
GPE on the growth of U2-OS cells，based on which IC50 was determined． The effect of GPE on the apoptosis
of U2-OS cells was tested using Annexin V-FITC assay kit，and changes of cell cycle were detected by Flow
cytometry． Results GPE inhibited the growth of U2-OS cells in vitro in a dose-dependent manner，with IC50
value of 72 μg·mL －1 ． GPE was testified to be able to induce apoptosis in U2-OS cells． And U2-OS cells
was found by Flow cytometry to be arrested in G0 /G1 phase． Conclusion Gynura procumbens(Lour．)
MERR． may be a potential antitumor herb．
Key words:Gynura procumbens(Lour．)MERR．;U2-OS;IC50;apoptosis;cell cycle
收稿日期:2011-09-01
作者简介:付达华 (1970 －) ，男，博士，副教授，主要从事微生物与生化药学、抗肿瘤药物研究，Email:fdhhdf@ 163． com。
网络出版时间:2011-09-28 09:28 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /44． 1413． R． 20110928． 0928． 002． html
蛇 接 骨 草 ［Gynura procumbens (Lour．)
MERR．］，又名石三七、树三七、见肿消、白叶跌打
等，分布于我国广西、云南等地区及印度尼西亚、马
来西亚等东南亚国家，为菊科三七属植物平卧土三
七(又名乌风七)的全草，多年生草本植物。味辛、
微苦，性凉;主治痈疮肿毒、风湿痛、肺炎、肺结核、跌
打损伤等［1］。民间以地上部分食、药两用，广泛用
于治疗高血压病、高脂血症及糖尿病等，具有良好的
疗效，有“神仙草”之称。近年来研究证实蛇接骨草
具有降血压［2 － 3］、降血糖［4 － 5］、降血脂［5］、抗炎［6］等
药理作用，其降血压作用可能是通过抑制钙离子通
道和血管紧张素转化酶、增加氧化亚氮含量而实现
的［2 － 3，7］。Kim［8］等报道蛇接骨草提取物能抑制人
成纤维细胞中基质金属蛋白酶的表达。本研究主要
对该植物的抗肿瘤作用进行研究。
广东药学院学报
Journal of Guangdong Pharmaceutical University Oct． 2011，27(5)
1 材料与方法
1． 1 材料与试剂
新鲜蛇接骨草购于江西南丰印尼蛇接骨草种植
基地，并经江西中医学院药学院罗光明教授鉴定为
蛇接骨草 Gynura procumbens(Lour．)MERR．。晒干
后取干燥草药 1 000 g，研磨粉碎后过 100 目筛，均
分为 4 份。1 份样品以蒸馏水采用常规浸渍法(固
液比 1 ∶ 10)提取 2 次;另 3 份分别以 45%、65%、
95%(φ)乙醇 85 ℃回流提取 2 次(固液比均为 1 ∶
10) ，每次 2 h，分别合并 2 次提取所得滤液，旋转蒸
发回收乙醇;冷冻干燥后称质量，计算各组得率，分
别为 6. 53%、4． 16%、4． 87%、2． 24%。
DMEM高糖培养基、MEM 培养基、RPMI 1640
培养基(美国 Hyclone) ;胎牛血清(FBS，杭州四季青
生物工程有限公司) ;胰蛋白酶(美国 Amresco 公
司) ;MTT(Sigma) ;Annexin V-FITC细胞凋亡检测试
剂盒(南京凯基生物公司) ;其余试剂均为国产分析
纯。
1． 2 仪器与耗材
RE-52 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂) ;
SW-CJ-2F型超净工作台(苏净集团) ;MDF-75 型细
胞培养箱(Sanyo，Japan) ;Model 312 型自动化分光
光度平板读数计 (Biotech Research Laboratories
Inc．) ;FACSCalibur 型激光流式细胞仪 (美国
BectonDickson公司) ;96 孔细胞培养板(Costar)。
1． 3 实验方法
1． 3． 1 细胞培养 Hela 细胞、U2-OS 细胞、成纤维
细胞常规培养于 DMEM 高糖培养基中，A549 细胞
常规培养于 RPMI 1640 培养基中(以上细胞株购于
上海中科院生物细胞库，南昌大学第一附属医院冻
存) ，SK-Br3 细胞和 SK-Ov3 细胞(购于中国医学科
学院肿瘤研究所，南昌大学第一附属医院冻存)常
规培养于改良 MEM培养基中(均含 10%胎牛血清，
2 mmol·L －1谷氨酰胺，青、链霉素各 100 U·mL －1，
培养条件均为 5% CO2、湿度 95%、37 ℃)。待细胞
长至约 80% 满后，弃去旧培养基，以适量胰酶
(0. 25%胰蛋白酶∶ 0． 02% EDTA = 1∶ 1)消化细胞，
弃去消化液并加入适量培养基洗涤，再以适量培养
基反复轻轻吹打后制备细胞悬液，计数，以 1∶ 4 的比
例传代培养。
1． 3． 2 活性测试 取对数生长期的上述各细胞株，
胰酶消化后计数，调整细胞密度为 5 × 104 个·
mL －1，接种于 96 孔细胞培养板中，每孔 180 μL，5%
CO2、95%湿度、37℃培养 24 h使细胞贴壁。分别将
水提物、45%醇提物、65%醇提物、95%醇提物加入
各细胞培养板(各组均设立 3 个平行孔) ，使各孔中
提取物终质量浓度为 250 μg·mL －1，同时设立阴性
对照，继续培养 48 h 后，倒置显微镜下观察各孔细
胞密度及形态。
取敏感细胞株，按下述常规 MTT法测定 IC50:
铺板:取对数生长期细胞，胰酶消化后计数，调
整细胞密度为 5 × 104 个·mL －1，接种于 96 孔细胞
培养板中，每孔 180 μL，5% CO2、95%湿度、37℃培
养 24 h使细胞贴壁。
加样:取初始质量浓度为 2 500 μg·mL －1的
95%醇提物(简称 GPE) ，设立浓度梯度(共 5 个剂
量组) ，每孔分别加入相应浓度受试液 20 μL，使药
物终质量浓度分别为 250、100、50、20、5 μg·mL －1。
每个剂量组设 3 个平行孔，并设阴性对照组和本底
组，5%CO2、95%湿度、37°C继续培养 48 h。
测试:取出细胞培养板，每孔中加入 5 mg·
mL －1 MTT溶液 20 μL，继续孵育 4 h。小心吸去各
孔中上清液，加入 DMSO 150 μL，平板摇床振摇 10
min，使紫色结晶颗粒溶解。Model 312 型自动化分
光光度平板读数计在 570 nm 处测定各孔吸光度
(A)值。按下列公式计算不同浓度组细胞增殖抑制
率，并以药物浓度的负对数(－ Log［M］)为横坐标、
细胞增殖抑制率为纵坐标，OriginPro7． 5 软件拟合细
胞增殖抑制曲线，计算 IC50值。
细胞增殖抑制率 =［1 －(A实验组 － A本底)/(A对照组
－ A本底) ］× 100%
1． 3． 3 细胞凋亡和细胞周期检测 用细胞培养瓶
培养 U2-OS细胞，待细胞处于对数生长期时(传代
后第 3 天) ，换用含 GPE的培养基，分别考察药物浓
度、作用时间对细胞凋亡的影响。
1． 3． 3． 1 蛇接骨草提取物浓度对细胞凋亡的影响
设立 4 个剂量组，使各培养瓶中 GPE 的终质量浓
度分别为 20、40、80、160 μg·mL －1，另设立阴性对
照组，作用 24 h后终止培养。用适量胰酶消化细胞
并以不含 GPE的培养基洗涤，轻轻吹打均匀以培养
基制成细胞悬液，细胞计数不少于 106 个。按
Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明处理细
胞:将细胞悬液 1 000 r /min离心，去除上清液，沉淀
细胞以预冷 PBS 洗涤 2 次，以 500 μL 的 Binding
Buffer 悬浮细胞，加入 5 μL Annexin V-FITC混匀后，
再加入 5 μL 碘化丙啶(PI) ，混匀，室温、避光反应
15 min，预冷 PBS洗涤后 1 h 内上流式细胞仪检测。
225 广东药学院学报 第 27 卷
使用激光波长 490 nm，荧光检测细胞凋亡，以
CellQuest 软件分析细胞凋亡率。
1． 3． 3． 2 蛇接骨草提取物对细胞的抑制作用 细
胞处于对数生长期时，换用含 GPE 的培养基，使药
物终质量浓度为 80 μg·mL －1，继续培养，分别于用
药后第 24、48、72 小时终止培养。用适量胰酶消化
细胞并洗涤，轻轻吹打均匀以培养基制成细胞悬液，
细胞计数不少于 106 个。将细胞悬液 1 000 r /min
离心，去除上清液，沉淀细胞以预冷 PBS 洗涤 2 次
后分为 2 份，1 份按“1． 3． 3． 1”方法进行细胞凋亡检
测;另 1 份室温、避光条件下加入 PI 孵育 15 min，预
冷 PBS洗涤后上流式细胞仪进行细胞周期分析。使
用激光波长 490 nm，用 ModFit 软件分析细胞周期。
1． 4 统计学方法
采用 SPSS 12． 0 软件，实验数据以(珋x ± s)表示，
采用 t检验，P ＜0． 05为差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 蛇接骨草提取物对细胞的抑制作用
结果见表 1。95%醇提物作用于 U2-OS 细胞
时，与对照组比较，U2-OS 细胞数量明显减少，细胞
形态变圆。
GPE剂量依赖性抑制 U2-OS 细胞的增殖，经拟
合增殖抑制曲线(见图 1) ，IC50为 72 μg·mL
－1。
2． 2 GPE对 U2-OS细胞凋亡的影响
GPE质量浓度为 20、40、80、160 μg·mL －1时，
U2-OS细胞的凋亡率逐渐提高，分别为(8． 73 ±
0. 92)%、(12． 65 ± 2． 94)%、(37． 45 ± 2． 76)%、
(53． 46 ± 4. 27)%(见图 2) ，与阴性对照组［(1． 22
± 0． 24)%］、DMSO对照组［(0． 84 ± 0. 23)%］比较
差异具有统计学意义(P ＜ 0． 05)。
表 1 蛇接骨草提取物对细胞的抑制作用
Table 1 Inhibition of Gynura procumbens(Lour．)MERR．
extract on cells
组别 A549 Hela U2-OS SK-Br3 SK-Ov3
成纤维
细胞
水提组 － － － － － －
45%醇提组 － － － － － －
65%醇提组 － － － － － －
95%醇提组 － － + － － －
注:“－”表示与相应阴性对照组比较，细胞数量及形态无明
显变化;“+”表示与相应阴性对照组比较，细胞数量明显减
少，细胞形态变圆。
图 1 GPE对 U2-OS细胞的增殖抑制作用
Figure 1 Inhibitory effect of GPE on the growth of U2-OS cells
图 2 不同浓度 GPE对 U2-OS细胞的凋亡诱导作用
Figure 2 GPE of different concentrations induced apoptosis in U2-OS cells
325第 5 期 付达华，等．蛇接骨草提取物对 U2-OS细胞增殖及细胞周期的影响
以 80 μg·mL －1的 GPE 处理 U2-OS 细胞不同
时间，分析细胞凋亡情况，实验结果表明随着作用时
间的延长，凋亡率逐渐增加，作用 24、48、72 h 的细
胞凋亡率分别为(37． 45 ± 2． 76)%、(58． 74 ±
4. 18)%、(71． 79 ± 3． 86)%，与对照组比较，差异均
有统计学意义(P ＜ 0． 05)。
2． 3 GPE对 U2-OS细胞周期的影响
见表 2。与对照组相比，经 80 μg·mL －1的 GPE
处理后，处于 G0 /G1 期的 U2-OS 细胞百分比增加，
且随着处理时间的延长处于 G0 /G1 期的细胞百分
比也逐渐增加，推测 GPE 可将细胞周期阻滞在 G0 /
G1 期。
表 2 GPE(80 μg·mL －1)对 U2-OS细胞周期的作用
Table 2 The effect of 80 μg·mL －1 GPE on cell cycle in
U2-OS cells (珋x ± s)
取样时间 /h
各时相细胞比例 /%
G0 /G1 S G2 /M
0 56． 6 ± 4． 3 29． 3 ± 3． 5 14． 1 ± 1． 1
24 65． 2 ± 7． 4 22． 5 ± 2． 7 12． 3 ± 2． 1
48 73． 3 ± 6． 5 14． 1 ± 1． 7 12． 6 ± 1． 8
72 80． 2 ± 6． 7 8． 9 ± 1． 3 10． 9 ± 1． 7
3 讨论
关于蛇接骨草，民间传说有“神仙草”、“长寿
草”、“寿命草”之称，具有多重药理作用及较好疗
效，但其抗肿瘤的作用则一直未见文献报道。本研
究以印尼蛇接骨草为材料，以肺癌细胞株 A549、乳
腺癌细胞株 SK-Br3、卵巢癌细胞株 SK-Ov3、骨肉瘤
细胞株 U2-OS、宫颈癌细胞株 Hela 及正常人成纤维
细胞为受试对象，研究其抗肿瘤效果。之所以选择
这些列属不同肿瘤病种的细胞株及正常细胞株，主
要是尽可能避免漏筛一些只对某种特定肿瘤有效的
化合物，并与正常细胞进行对照。实验结果显示其
95%醇提物对 U2-OS 细胞具有增殖抑制作用，但对
Hela、A549等其他几个细胞株无增殖抑制作用。该
实验结果并不能证明 95%醇提物对 U2-OS 细胞具有
特异性作用，有可能是因为提取物中有效成分浓度低
导致不能对其他细胞产生抑制作用，再则这种筛选方
法本身就略显粗糙。解决该问题的有效办法是对蛇
接骨草进行系统的分离纯化，以获取活性组分并进行
深入的研究。目前有关蛇接骨草的活性组分尚未见
报道，本课题下一步的研究方向就是对蛇接骨草进行
分离纯化以获得单一组分。
本研究显示，蛇接骨草 95%醇提物对 U2-OS 细
胞体外增殖具有抑制作用;Annexin V-FITC 凋亡检
测显示其能诱导细胞凋亡，诱导细胞凋亡的效果随
作用时间的延长及药物浓度的增加而增加;同时，流
式分析亦显示 95%醇提物能将 U2-OS 细胞阻滞在
G0 /G1 期，阻止细胞由 G0 /G1 期向 S 期转变。推测
是由于细胞周期的异常导致纺锤体检测点的激活，
从而启动细胞凋亡机制，但尚需实验证据来支持该
推测。同样，还需要更多的敏感细胞株作为实验对
象，以检测蛇接骨草对细胞凋亡和细胞周期的影响。
迄今为止，许多药用植物在肿瘤的治疗中发挥
着重要作用，其作用机制也呈多样化。本研究中，蛇
接骨草 95%醇提物是由多种成分组成的混合物，其
抗肿瘤作用是由一种成分引起还是由多种成分协同
作用产生，活性成分是什么，活性成分的作用靶点分
别是什么，能否由先导化合物得到活性更高的结构
类似物，对 TNF-α、IFN、Caspase-3、P21、Bax、Bcl-2、
NF-κB等多种蛋白因子的表达有何影响，对细胞信
号通路有何影响，值得进一步深入研究。
参考文献:
［1］宋立人． 中华本草［M］． 7 版．上海:上海科学技术出版
社，1998:854 － 855．
［2］HOE S Z，LEE C N，MOK S L，et al． Gynura procumbens
Merr． decreases blood pressure in rats by vasodilatation via
inhibition of calcium channels［J］． Clinics (Sao Paulo) ，
2011，66(1) :143 － 150．
［3］ KIM M J，LEE H J，WIRYOWIDAGDO S，et al．
Antihypertensive effects of Gynura procumbens extract in
spontaneously hypertensive rats［J］． J Med Food，2006，9
(4) :587 － 590．
［4］ HASSAN Z，YAM M F，AHMAD M，et al． Antidiabetic
properties and mechanism of action of Gynura procumbens
water extract in streptozotocin-induced diabetic rats［J］．
Molecules，2010，15(12) :9008 － 9023．
［5］ ZHANG Xian-feng，TAN B K． Effects of an ethanolic
extract of Gynura procumbens on serum glucose，cholesterol
and triglyceride levels in normal and streptozotocin-induced
diabetic rats［J］． Singapore Med J，2000，41(1) :9 － 13．
［6］ ISKANDER M N，SONG Y，COUPAR I M，et al．
Antiinflammatory screening of the medicinal plant Gynura
procumbens［J］． Plant Foods Hum Nutr，2002，57(3 /4) :
233 － 244．
［7］HOE S Z，KAMARUDDIN M Y，LAM S K． Inhibition of
angiotensin － converting enzyme activity by a partially
purified fraction of Gynura procumbens in spontaneously
hypertensive rats［J］． Med Princ Pract，2007，16(3) :203
－ 208．
［8］ KIM J，LEE C W，KIM E K，et al． Inhibition effect of
Gynura procumbens extract on UV-B-induced matrix-
metalloproteinase expression in human dermal fibroblasts
［J］． J Ethnopharmacol，2011，137(1) :427 － 433．
(责任编辑:幸建华)
425 广东药学院学报 第 27 卷