全 文 ：论 著
(基础研究)
印尼蛇接骨草醇提取物抑制骨肉瘤细胞 U2-OS 侵袭
迁徙的研究
周继文，王 恒，周 扬，陈文昭，汪桃芳，刘志礼，付达华
［摘要］ 目的 发现印尼蛇接骨草 95%醇提取物［Gynura procumbens(Lour．)MEＲＲ． extract，GPE］能诱导骨肉瘤细胞凋
亡、抑制其增殖。文中探讨 GPE对骨肉瘤细胞 U2-OS体外迁徙、侵袭力的影响。 方法 用 0、40 μg /mL GPE分别作用骨肉
瘤细胞 U2-OS，Wound healing和 Transwell侵袭实验检测 U2-OS细胞的迁徙、侵袭力。 结果 40 μg /mL GPE处理组，24 h细
胞迁徙率(33 ± 3)%明显低于对照组(0μg /mL GPE)细胞迁移率(66 ± 2)%;2 组细胞 24 h穿膜细胞数分别为(18 ± 2)和(46 ±
2)个 /视野，差异有统计学意义(P ＜ 0． 05)。 结论 GPE能在体外抑制骨肉瘤 U2-OS细胞侵袭迁徙，有望成为新的抗骨肉瘤
转移的药物。
［关键词］ 印尼蛇接骨草 95%醇提取物;骨肉瘤;转移
［中图分类号］ Ｒ738． 1 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1008-8199(2014)01-0027-03
基金项目:江西省卫生厅中医药科研基金(2011A147)
作者单位:330006 南昌，南昌大学第一附属医院骨科［周继文(医学
硕士研究生)、王 恒、周 扬、陈文昭、汪桃芳、刘志
礼)］;363000 漳州，漳州市卫生职业学院药学系(付达华)
通讯作者:刘志礼，E － mail:zgm7977@ 163． com
Gynura procumbens (Lour)MEＲＲ extract inhibits the invasion and migration of U2-OS cells in vitro
ZHOU Ji-wen1，WANG Heng1，ZHOU Yang1，CHEN Wen-zhao1，WANG Tao-fang1，LIU Zhi-li1，FU Da-hua2
(1． Department of Orthopeadic Surgery，The First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，Jiangxi，
China;2． Department of Pharmacy，Zhangzhou Health Vocational College，Zhangzhou 363000，Fujian，China)
［Abstract］ Objective Our previous study showed that Gynura procumbens (Lour．)MEＲＲ extract (GPE)could induce the
apoptosis and inhibit the proliferation of U2-OS cells． The purpose of this study is to investigate the effect of GPE on the invasion and
migration of U2-OS cells in vitro． Methods We treated U2-OS cells with GPE at the concentrations 0 (control group)and 40μg /mL
(experimental group)for 24 hours，and then detected the migration and invasion abilities of the cells by wound healing and Transwell
invasion assays． Ｒesults After 24 hours of treatment，the migration rate of the U2-OS cells was significantly lower in the experimen-
tal than in the control group(［33 ± 3］% vs［66 ± 2］%) ，and so was the number of transmembrane cells (18 ± 2 vs 46 ± 2 per visual
field，P ＜ 0． 05)． Conclusion GPE can inhibit the invasion and migration of U2-OS cells in vitro，and promises to be a new drug
for osteosarcoma metastasis．
［Key words］ Gynura procumbens (Lour．)MEＲＲ extract;Osteosarcoma;Metastasis
0 引 言
骨肉瘤是多发于青少年的一种增殖及侵袭性极
强的恶性肿瘤，早期转移是其一大特点，肺部转移成
为骨肉瘤患者死亡最主要的原因。已有研究证实印
尼蛇接骨草醇提取物能诱导骨肉瘤细胞凋亡，抑制其
增殖［1］。在本实验中，我们进一步探讨了蛇接骨草醇
提取物对骨肉瘤细胞 U2-OS迁徙、侵袭力的影响。
1 材料与方法
1． 1 材料 蛇接骨草购于江西南丰印尼蛇接骨草种
植基地，提取方法见文献［1］。骨肉瘤细胞株U2-OS
购自中国医学科学院肿瘤研究所，并由南昌大学第一
附属医院医学中心冻存。F12 型培养基购自美国
Hyclone公司;胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物工
程有限公司;PBS 购自北京百灵威化学试剂有限公
司;胰蛋白酶冻干粉(含 EDTA)购自美国 Sigma 公
司;DMSO、MTT购自美国 Sigma 公司，Transwell 趋化
板购于 Costar公司(8． 0μm Pore Size)。
1． 2 方法
1． 2． 1 细胞培养 人骨肉瘤细胞株 U2-OS 细胞
贴壁生长于含 10% FBS 的 F12 型培养液中，其中
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DOI:10.16571/j.cnki.1008-8199.2014.01.013
青霉素100 U /mL、链霉素 100 mg /mL，于 37 ℃、5%
CO2的饱和湿度孵育箱中培养。待细胞长至约 80%
满后，弃去旧培养基，以适量胰酶(0． 25%胰蛋白
酶:0． 02% EDTA =1∶1)消化细胞，弃去消化液并加
入适量培养基洗涤，再以适量培养基反复轻轻吹打
后制备细胞悬液，计数，以 1∶4 的比例传代培养。
1． 2． 2 Wound healing 迁徙实验 取对数生长期细
胞进行实验;用 0． 25% 胰酶消化细胞，含 10 g /L
BSA的无血清 DMEM-F12 培养液重悬，调整细胞浓
度 5 × 105 /mL，接种于 6 孔细胞培养板，予以 2 种不
同浓度(0、40 μg /mL)的 GPE 作用细胞 24 h 后，用
200 μL枪头在单层细胞表面孔中划一直线。用 PBS
漂洗 2 次以去除划下的悬浮细胞;加入无血清
DMEM-F12 培养液(内含 1% BSA)继续培养 24 h，
倒置显微镜下观察划痕中细胞迁徙情况并照相;
Image J分析软件进行迁徙距离测量，计算各组细胞
迁徙率。不同时间重复实验 6 次。
1． 2． 3 Transwell侵袭实验 将冻存于 － 80 ℃ 冰箱
的 BD matrigel 基质胶 4 0C 静置 24 h，使之转为液
态。常规细胞培养后，终止培养，吸除血清让细胞饥
饿 12 ～ 24 h。包被基膜，按 1 ∶ 7 比例稀释 Matrigel，
取 20μL的Matrigel，加入 140μL的 F12 型无血清培
养液，充分稀释混匀(冰浴操作)。在 Transwell小室
的多聚碳酸滤膜上预铺 Matrigel 基质胶(约 60
μL /孔)，每孔加入 50 μL 的含 10 g /L 的 BSA(牛血
清白蛋白)的无血清培养液，37℃放置 3 h，室温过夜
干燥。常规消化离心细胞后，用 10 g /L BSA(牛血清
白蛋白)重悬，调整细胞浓度至 1 × 105个 /mL。在
Transwell小室的上室中，分别加入 150 μL 的已用
40 μg /mL GPE处理的细胞悬液和用正常培养基培
养的细胞悬液，每孔下室加入 500 μL 的含血清的培
养基。将小室置于 37 ℃、5% CO2孵育箱中 24 h 后
用棉签轻轻刮除小室内微孔膜边缘的细胞，甲醇固
定 15 min，再用 4 g /L 的结晶紫染色30 min后取出
Transwell小室，PBS淋洗 2 遍，倒置显微镜观察细胞
穿膜情况并拍照，Image J分析软件计数。不同时间
重复实验 6 次。
1． 3 统计学分析 采用 SPSS 13． 0 软件进行统计学
分析，定量数据以均数 ±标准差(x ± s)表示。采用两
独立样本 t 检验比较 2 组间细胞迁徙与侵袭差异情
况，2组间方差不齐时采用 Satterthwaite 校正 t 检验。
以 P≤0． 05为差异有统计学意义。
2 结 果
2． 1 印尼蛇接骨草 95%醇提取物［Gynura procum-
bens(Lour．)MEＲＲ． extract，GPE］对骨肉瘤细胞
U2-OS体外迁徙的影响 wound healing 实验结果显
示，在 200倍的镜下观察经 40μg /mL GPE作用 24 h的
平均细胞迁徙率为(33 ±3)%，未经GPE作用的细胞组
迁徙率为(66 ± 2)%。差异有统计学意义(P ＜0． 05)，
见图 1。
a、b:分别为 0、40μg /mL的 GPE作用骨肉瘤细胞U2-OS 0 h;
c、d:分别为 0、40μg /mL的 GPE作用骨肉瘤细胞 U2-OS 24h
图 1 不同浓度的GPE作用骨肉瘤细胞 U2-OS后的划痕愈
合镜下所见( ×200)
Figure 1 Wound healing pictures of the U2-OS cells after
treated with GPE ( ×200)
2． 2 GPE对骨肉瘤细胞 U2-OS 体外侵袭的影响
通过 Transwell侵袭实验分析显示，40 μg /mL GPE 处
理的细胞 24 h 穿膜细胞数平均为(18 ± 2)个 /视野，
未经 GPE作用的细胞平均穿膜细胞数为(46 ± 2)个 /
视野，两者差异有统计学意义(P ＜0． 05)，见图 2。
a、b:分别为 0、40 μg /mL 的 GPE 处理骨肉瘤细胞 U2-OS
24 h后
图 2 Transwell 侵袭实验代表图(结晶紫染色法 ×400)
Figure 2 Ｒepresentative images of Transwell invasion as-
say of the U2-OS cells after treated with GPE
(Crystal violet staining ×400)
3 讨 论
骨肉瘤是一种高度恶性的骨肿瘤，其发病率在
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儿童及青少年的原发骨肿瘤中占据首位。虽然新辅
助化疗药已使用，但近 30 年来骨肉瘤患者总体生存
率没有得到了提高，主要原因是早期发生肺部转移
和获得性耐药［2 － 3］。因此，新的抗骨肉瘤药物的出
现是亟待解决的热点。印尼蛇接骨草广泛分布于包
括中国、印度尼西亚等东南亚国家，在民间被认为具
有抗癌作用而广泛作为中药和食物食用。目前药理
学证明其具有抗炎、抗病毒、抗高血压、降血脂、降血
糖等作用［4 － 8］，但其是否具有抗肿瘤效果目前少见
报道。我们前期研究发现，GPE 能诱导骨肉瘤细胞
凋亡、抑制细胞增殖［1］，但是否具有抑制肿瘤细胞
侵袭转移的作用未见报道。最近研究发现蛇接骨草
乙醇提取物能在人成纤维细胞中抑制紫外线诱导的
基质金属蛋白酶的表达［9］。目前研究已证实基质
金属蛋白酶是细胞基底膜及外基质降解过程中不可
缺少的一类酶，并且大量的研究表明在肿瘤组织中
基质金属蛋白酶异常高表达，可作为预测肿瘤侵袭
转移的指标［11 － 13］，而基膜及细胞外基质的降解破坏
在骨肉瘤侵袭转移中至关重要，被认为是骨肉瘤侵
袭转移的关键环节。我们的研究结果表明，经
40 μg /mL GPE作用后的细胞细胞迁徙率和侵袭力
明显低于未经 GPE 作用的细胞，这提示 GPE 能有
效抑制骨肉瘤细胞迁徙侵袭。
药用植物在肿瘤的治疗中发挥作用的机制复
杂。本研究中，GPE 是由多种成分组成的混合物，
其抗肿瘤作用是由 1 种还是由多种成分协同作用产
生，活性成分及其作用靶点分别是什么，都有待于进
一步研究。
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(收稿日期:2013-03-24; 修回日期:2013-05-26)
(责任编辑:缪 琴; 英文编辑:罗永合)
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