全 文 ：收稿日期:2010-06-05; 修订日期:2010-09-29
作者简介:成 英(1974-) ，女(汉族) ，四川仁寿人，现为四川大学在读博
士研究生，主要从事植物天然产物研究工作．
* 通讯作者简介:何兴金(1963-) ，男(汉族) ，四川仪陇人，现任四川大学
生命科学学院教授，博士研究生导师，博士学位，主要从事植物系统与分
子进化研究工作．
续随子种子中两种大环二萜类物质的提取工艺
成 英1，2，何兴金1*
(1．四川大学生命科学学院，四川 成都 610064; 2．乐山师范学院化生学院，四川 乐山 614004)
摘要:目的 研究续随子种子中两种大环二萜类物质的提取工艺。方法 通过单因素分析和正交实验对续随子中两种大
环二萜类化合物的提取工艺进行了优化。结果 当甲醇浓度为 100%，料液比为 1∶ 20，提取时间为 50min，提取温度为
40℃时，可达到最高百分含量 1． 18%和 0． 535%。结论 利用该实验方法提取续随子中的 Euphorbia factor L1 和 Euphorbia
factor L2，工艺良好，稳定，方法可行。
关键词:大环二萜; Euphorbia factor L1; Euphorbia factor L2; 高效液相色谱; 提取工艺
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2011． 05． 109
中图分类号:R284． 2 文献标识码:B 文章编号:1008-0805(2011)05-1267-02
所谓大环二萜(macrocyclic deterpene)是二萜结构中存在有
六元环以上的环状结构。它们一般都有较强的毒性和生理活性。
即:一方面有刺激性或辅助致癌(tumor － promotion)的毒性;另一
方面又显示细胞毒性。有的二萜只显示后者，则可以作为药用的
生理基础。民间用以治疗结核、牛皮癣、疥疮和无名肿毒，尤其是
抗肿瘤引起人们的关注。这些二萜是一个具有特殊生理活性，同
时又是一个尚待开发、期望能成为治疗人类重大疾病的药源，是
一个充满希望的药源，具有重要价值［1］。
大戟科(Euphorbiaceae)和瑞香科(Thymelaeaceae)植物中含
有多种二萜化合物，已知大戟属二萜的骨架已有 14 种，新的骨架
和化合物还在不断地发现［2］。这类化合物不仅因为其骨架特
殊、分布规律性强，而且还由于该类化合物多数具有强烈的生物
活性，包括抗肿瘤、引产、强刺激性、毒性及部分化合物的辅助致
癌作用。
国内外学者对 HPLC的研究较多，但对续随子中大环二萜类
物质的 HPLC分析，目前做的较少［3，4］。本研究主要针对上节中
分离所得到的两种大环二萜类物质(Euphorbia factor L1 和 Eu-
phorbia factor L2)进行 HPLC 分析，并对这两种大环二萜类物质
的提取工艺［5，6］进行一些探讨。
1 器材与试剂
1． 1 对照品来源 将续随子种子(Euphorbia lathylris Linn．) (又
称千金子)5． 0 kg，经粉碎后，分别用无水乙醇在室温下浸泡 3
次，每次 7 d，将浸提液进行减压蒸馏，得总浸膏 1 300 g。将总浸
膏依次用石油醚，醋酸乙酯及正丁醇萃取，分别将萃取浸膏进行
硅胶柱层析，用不同比例的洗脱液进行洗脱，配合 TLC 检验，合
并相同组分，重复此操作，得到两个单晶物质，经1H － NMR、13 C －
NMR、四原单晶等技术鉴定为 Euphorbia factor L1 和 Euphorbia
factor L2，其结构如下:
1． 2 仪器与试剂 LC － 2010A 高效液相色谱仪配紫外检测器
(日本岛津) ;TU1901 紫外可见双光束分光光度计(北京普析有
限公司) ;KQ3200 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
水为二次蒸馏水;色谱甲醇;其余试剂为分析纯。
2 方法
根据 HPLC法定量分析的要求［7］，本实验对以下项目进行探
索:最大吸收波长、流动相、线性关系、仪器的精密度、重现性、稳
定性，最后对 Euphorbia factor L1 和 Euphorbia factor L2 这两种大
环二萜类化合物的提取工艺进行了探讨。
2． 1 色谱条件 VP － ODS 色谱柱(150 mm × 4． 6 mm，5 μm) ;流
动相为甲醇 －乙腈 －水(60∶ 10∶ 30) ;流速 1 ml·min －1;检测波
长 273 nm;进样量 10 μl;柱温 30℃。
2． 2 标准曲线的绘制 精确称取 Euphorbia factor L1 和 Euphorbia
factor L2 标准品 57． 0 mg 和 59． 0 mg，分别用 MeOH 定容至 50
ml，超声 5 min，配制成质量浓度为 1． 14 g /L 和 1． 18 g /L 的标准
使用溶液。
分别精确吸取上述标准使用溶液 0． 5，1，2，3，5，7 ml置于 10
ml的容量瓶中，用 MeOH定容，作为标准系列溶液。在上述色谱
条件下，依次进样 10 μl，以对照品浓度为横坐标，色谱峰面积为
纵坐标，绘制标准曲线。
2． 3 样品制备 准确称取续随子种子粗粉，加入不同浓度的
MeOH，在不同的提取时间，提取温度和料液比等条件下进行提
取，提取液离心，静置过夜，取上清液用 0． 45 μl 微孔滤膜过滤，
滤液用于 HPLC测定。
2． 4 百分含量的计算 利用回归方程计算出其浓度 c，再利用下
式计算其百分含量:
百分含量 ρ = cV /M × 100% 其中 V 为续随子种子粗粉提取
液体积;M为续随子种子粗粉质量。计算时统一单位。
3 结果
3． 1 实验条件的选择
3． 1． 1 检测波长的选择 将配置好的溶液用紫外线扫描，Eu-
phorbia factor L1 有两个最大吸收波长(273，206 nm) ，而 Euphor-
bia factor L2 有 3 个最大吸收波长(273，230，203 nm) ，因此，我们
选择两种物质均有较强吸收的波长 273 nm作为 HPLC的检测波
长。
3． 1． 2 流动相的选择 在色谱条件优化过程考察了甲醇 －水体
系，甲醇 －乙腈 －水体系。结果表明，在甲醇 －水体系中，随着甲
醇体积比的改变，两种大环二萜的保留时间逐渐增长，但从样品
的 HPLC图中可看出，Euphorbia factor L1 与杂质峰没有分开，而
采用甲醇 －乙腈 －水(60∶ 10∶ 30)体系，Euphorbia factor L1 的
保留时间在 18． 125 s，Euphorbia factor L2 的保留时间为 53． 625
s，分离效果好，分离度达到色谱分析的要求。Euphorbia factor L1
和 Euphorbia factor L2 标准品的色谱图如图 1。
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2011 VOL ． 22 NO． 5 时珍国医国药 2011 年第 22 卷第 5 期
A － 样品的 HPLC图 B － 混合标准品的 HPLC图
图 1 样品和 Euphorbia factor L1、Euphorbia factor L2 标准品的色谱图
3． 1． 3 线性关系考察 将逐级稀释的标准系列溶液分别进样 10
μl，分别计算 Euphorbia factor L1 和 Euphorbia factor L2 的回归方
程(n = 6) ，所得 Euphorbia factor L1 的回归方程为 Y = 7E + 07Z －
208 490，R2 = 0． 999 9 。Euphorbia factor L2 的回归方程为 Y = 7E
+ 06Z － 5 936． 5，R2 = 0． 999 7 。结果表明:Euphorbia factor L1 在
0． 057 ～ 0． 798 g /L 范围内线性关系良好，而 Euphorbia factor L2
在 0． 059 ～ 0． 826 g /L范围内线性关系良好。
3． 1． 4 精密度实验 精确吸取 0． 228g /L 和 0． 236 g /L 对照品溶
液，按上述色谱条件测定，连续进样 3 次，每次 10 μl，记录其峰面
积，平均值分别为 1 714 715和 2 524 834，标准偏差(RSD)分别为
0． 86%和 0． 99%(n =3)。RSD值均较小，可见该方法的精密度良
好。
3． 1． 5 重复性实验 精确称取 5 份续随子种子粗粉，每份 1． 0 g，
按照样品溶液制备方法平行制备，在上述色谱条件下依次进样
10 μl，计算这两种大环二萜含量的平均值分别为 0． 973% 和
0． 452%，RSD分别为 0． 83%和 0． 97%。
3． 1． 6 稳定性实验 取同一份续随子种子样品溶液(按样品溶液
制备方法制备)在室温下放置，在上述色谱条件下分别于 0，3，6，
9 h进行测定，每次进样 10 μl，测定 L1 和 L2 的峰面积，其平均值
分别为 6 732 749 和 2 146 869，RSD值分别为 1． 13%和 1． 05%，
表明这两种大环二萜类物质在 9 h内稳定性良好，故样品配制好
后，在 9 h内完成测定即可。
3． 2 提取工艺实验
3． 2． 1 单因素实验 在提取过程中，以甲醇浓度、料液比、提取时
间、提取温度为主要因素进行单因素实验。
不同甲醇浓度的影响:当提取料液比为 1∶ 15，提取时间 20
min，提取温度 30℃，称取 2． 0 g 续随子种子，分别加入 60%，
80%，90%和 100%的甲醇溶液。结果见图 2。随着甲醇浓度的
增加，L1 和 L2 的含量增加，所以当甲醇浓度为 100%时，浓度达
到最大值，即此时提取效果最佳。
图 2 甲醇浓度对 L1 和 L2 的百分含量的影响
不同料液比的影响:当甲醇浓度为100%，提取时间20 min，提取
温度30℃，称取1． 0 g续随子种子，分别以料液比为1∶ 10、1∶ 15、1∶
20、1∶ 30进行提取。结果见图 3。在其它条件相同的情况下，料液
比不同时，L1和 L2的含量不同，但当料液比大于 1:20时，其百分含
量无明显增加，从经济成本出发，选取的料液比为 1∶ 20。
不同提取时间的影响:当甲醇浓度为 100%，料液比为 1 ∶
10，提取温度 30℃，称取 1． 0g 续随子种子，分别以提取时间 20，
30，40，50，60 min进行提取。结果见图 4。续随子种子中 L1 和
L2 的百分含量随着超声提取时间的增加而增加，当提取时间为
50 min时，百分含量有所下降，这可能是由于时间过长，更多的杂
质溶出，影响这两种大环二萜的提取，故提取时间为 50 min 时为
最佳。
图 3 料液比对 L1 和 L2 的百分含量的影响
图 4 提取时间对 L1 和 L2 的百分含量的影响
不同提取温度的影响:当甲醇浓度为 100%，料液比为 1 ∶
10，提取时间 20 min，称取 1． 0g续随子种子，分别以提取温度 20，
30，40，50℃进行提取。结果见图 5。随着提取温度的增加，Eu-
phorbia factor L1 和 Euphorbia factor L2 的百分含量逐渐增加，但
大于 40℃后，随着温度的继续升高，其百分含量反而降低，故以
温度 40℃时提取效果最佳。
图 5 提取温度对 L1 和 L2 的百分含量的影响
3． 2． 2 正交实验 根据单因素实验结果，选择甲醇浓度、料液
比、提取时间、提取温度 4 个因素，进行正交设计实验，对续随
子种子中的提取条件进行优化。正交实验因素水平及结果见
表 1 ～ 3。
表 1 正交实验因素水平表
水平
A
甲醇浓度(%)
B
料液比
C
提取时间 t /min
D
提取温度 T /℃
1 100 1∶ 10 30 20
2 90 1∶ 15 40 30
3 80 1∶ 20 50 40
表 2 Euphorbia factor L1 的 L9(34)正交实验设计及结果
序号
因素
A B C D
L1 百分含量
(%)
1 1 1 1 1 0． 645
2 1 2 2 2 0． 973
3 1 3 3 3 1． 18
4 2 1 2 3 0． 488
5 2 2 3 1 0． 543
6 2 3 1 2 0． 497
7 3 1 3 2 0． 477
8 3 2 1 3 0． 469
9 3 3 2 1 0． 366
K1 2． 798 1． 610 1． 611 1． 554
K2 1． 528 1． 985 1． 827 1． 947
K3 1． 312 2． 043 2． 200 2． 137
R 1． 486 0． 433 0． 589 0． 583
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时珍国医国药 2011 年第 22 卷第 5 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2011 VOL． 22 NO． 5
表 3 Euphorbia factor L2 的 L9(34)正交实验设计及结果
序号
因素
A B C D
L2 百分含量
(%)
1 1 1 1 1 0． 424
2 1 2 2 2 0． 452
3 1 3 3 3 0． 535
4 2 1 2 3 0． 326
5 2 2 3 1 0． 365
6 2 3 1 2 0． 057
7 3 1 3 2 0． 272
8 3 2 1 3 0． 263
9 3 3 2 1 0． 244
K1 1． 411 1． 022 0． 744 1． 033
K2 0． 748 1． 080 1． 022 0． 781
K3 0． 779 0． 836 1． 172 1． 124
R 0． 663 0． 244 0． 428 0． 343
从表 2 和表 3 中可以看出，对于 Euphorbia factor L1 和 Eu-
phorbia factor L2 来说，均为 RA ＞ RC ＞ RD ＞ RB，4 个因素对
其百分含量的主次顺序为:A ＞ C ＞ D ＞ B，即提取浓度 ＞ 提
取时间 ＞ 提取温度 ＞ 料液比。最佳提取工艺参数为
A1B3C3D3，即当甲醇浓度为 100%，料液比为 1∶ 20，提取时间为
50min，提取温度为 40℃ 时，可达到最高百分含量 1． 18% 和
0． 535%。
4 结论
通过正交实验对续随子中两种大环二萜类化合物的提取工
艺进行了优化。结果表明，当甲醇浓度为 100%，料液比为 1 ∶
20，提取时间为 50 min，提取温度为 40℃时，可达到最高百分含
量1． 18%和 0． 535%。本实验方法提取续随子中的 Euphorbia
factor L1 和 Euphorbia factor L2，工艺良好，稳定，方法可行。
参考文献:
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2009．
［4］ Carlo Bicchi，Giovanni Appendino，et al，HPLC － UV and HPLC － posi-
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(Euphorbia lathyris)Seed Oil［J］． Phytochemical Analysis，2001，12:
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［5］ 李秋红． 花生红衣中总黄酮的提取工艺［J］． 食品研究与开发，
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［6］ Sujun Liu，Jie Zhang，et al，Anticancer activity and quantitative analysis
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2007，21(10) :915．
［7］ 国家药典委员会． 中国药典，Ⅰ部［S］． 北京:化学工业出版社，
2005:附录Ⅵ．
收稿日期:2010-06-22; 修订日期:2010-10-11
作者简介:王建明(1947-) ，男(汉族) ，黑龙江哈尔滨人，现任黑龙江中医
药大学中医药研究院教授，博士研究生导师，主要从事中药现代给药系统
和中药新药的研究工作．
板蓝根制剂中腺苷含量与抗炎作用的相关性研究
王建明，潘晓云
(黑龙江中医药大学中医药研究院，黑龙江 哈尔滨 150040)
摘要:目的 研究板蓝根制剂中腺苷的含量与其抗炎作用的相关性。方法 采用 HPLC 法测定腺苷含量，色谱柱为 Dia-
monsil C18(4． 6 mm × 200 mm，5 μm ) ，检测波长:260 nm，甲醇 －水(10∶ 90)为流动相，流速:1 ml /min，柱温:30℃;另将给
药后的小鼠，耳廓涂二甲苯致肿胀，比较各组肿胀度差异。结果 腺苷在 0． 0160 ～ 0． 160 0μg 范围内线性关系良好(r =
0． 999 7) ，平均回收率为 98． 7%，RSD% = 0． 79%(n = 9)。其中板蓝根颗粒(川药)的腺苷含量最高。在二甲苯致小鼠耳
廓肿胀的抗炎模型中，板蓝根颗粒(哈药)抗炎效果最好。结论 所用方法精密度、重复性良好，结果准确。5 个样品总体
上腺苷含量与药效具有一定的相关性但并不绝对，可能制剂中其他抗炎成分产生了协同作用。
关键词:板蓝根制剂; 腺苷; 抗炎; 相关性
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2011． 05． 110
中图分类号:R283 文献标识码:B 文章编号:1008-0805(2011)05-1269-02
板蓝根为十字花科植物菘蓝 Isatis indigotica Fort．的干燥根。
板蓝根制剂由单味药板蓝根组成，具有清热解毒，凉血利咽功效，
用于肺胃热盛所致的咽喉肿痛、口咽干燥、腮部肿胀;急性扁桃体
炎、腮腺炎见上述证候者［1］。市面上所售板蓝根制剂有颗粒剂、
片剂等，大部分为颗粒剂。为了了解不同厂家、不同剂型的板蓝
根制剂其有效成分含量与其药效是否具有相关性，本实验以有效
成分腺苷为指标，研究其与抗炎作用的内在联系。
1 仪器与材料
1． 1 仪器 Waters 600 － 2487 高效液相色谱仪(美国沃特斯公
司)Empower色谱工作站。METTLER TOLEDO AG135 型电子天
秤(梅特勒 －托利多仪器(上海)有限公司)。KQ － 300 VDE 型
双频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
1． 2 药品与试剂 板蓝根颗粒(哈药集团中药二厂，Z23020945) ;
板蓝根颗粒(广州白云山和记黄埔中药有限公司，Z44023485) ;板
蓝根颗粒(四川蜀中制药有限公司，Z20020120) ;板蓝根片(云南希
陶绿色药业股份有限公司，Z53020085) ;板蓝根片(黑龙江省格润
药业有限责任公司，Z23020012) ;腺苷对照品(中国药品生物制品
检定所，110879 －200202) ;甲醇(色谱纯) ;纯净水(吉林娃哈哈食
品有限公司) ;二甲苯(哈尔滨市化工试剂厂)。
1． 3 动物 昆明种小鼠，雌雄各半，体质量 20 ～ 25 g，黑龙江中医
药大学药物安全性评价中心提供。
2 方法与结果
2． 1 板蓝根制剂腺苷的含量测定
2． 1． 1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱(4． 6 mm × 200 mm，5
μm) ，检测波长 260 nm，以甲醇 －水(10 ∶ 90)为流动相，流速:
1． 0 ml /min，柱温 30℃。
2． 1． 2 对照品溶液制备 精密称取腺苷对照品 0． 8 mg，置 50 ml
量瓶中，加 10%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，浓度
为 160 μg /ml。
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2011 VOL ． 22 NO． 5 时珍国医国药 2011 年第 22 卷第 5 期