全 文 ：果 树 学 报 2011，28（6）: 1104～1106
Journal of Fruit Science
黄河故道地区葡萄根结线虫 rDNA- ITS-PCR研究
刘三军 1，2，于巧丽 2，李洪连 1*
（1河南农业大学植物保护学院； 2中国农业科学院郑州果树研究所，郑州 450000）
摘 要： 用 PCR 方法扩增来自黄河故道地区不同区域葡萄根结线虫群体的 ITS 片段，并进行克隆和序列分析。 结果
表明，来自 6 个不同采集点的供试线虫属于同一种群，获得的 ITS 序列长度为 766 bp，与已知南方根结线虫 ITS 区编
码序列一致性达到 99.74%；聚类结果显示，与南方根结线虫亲缘关系最近。结合形态鉴定结果，初步确定黄河古道地
区葡萄根结线虫病病原为南方根结线虫（Meloidogyne incognita）。
关键词： 葡萄； 根结线虫病； 南方根结线虫； ITS-PCR； 序列分析
中图分类号：S661．1 文献标识码：A 文章编号：1009－9980(2011)06－1104－03
Study on rDNA -ITS-PCR of root-knot nematode in grape in the Chi-
nese Yellow River east region
LIU San-jun1，2， YU Qiao-li2， LI Hong-lian1*
（1Plant protection College，Henan Agricultural University， 2Zhengzhou Fruit Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences，
Zhengzhou， Henan 450000 China）
Abstract: The amplification， cloning and sequencing of the rDNA-ITS region of 6 different populations of
root-knot nematodes from trail of the Yellow River east region were conducted. The sequence analysis re-
sults showed that six populations of root-knot nematodes on grape from Luoyang， Zhengzhou， Kaifeng，
Shangqiu in Henan Province and Dangshan， Xiaoxian in Anhui Province belong to Meloidogyne incognita.
The length of ITS was 766 bp. The results of the sequence analysis and the form identifications showed that
this pathogen was Meloidogyne incognita.
Key words: Grape； Root-knot nematode disease； Meloidogyne incognita； ITS-PCR； Sequence analysis
自 1889 年 Neal 首次报道加州的葡萄发生根结
线虫病[1]以来，葡萄根结线虫病已成为制约葡萄生产
的世界性病害，危害日益严重。危害葡萄的根结线虫
在 世 界 的 分 布 主 要 有 4 种 ： 南 方 根 结 线 虫
（Meloidogyne incognita）、花生根结线虫（M. arenari-
a）、爪哇根结线虫（M. javanica）和北方根结线虫（M.
hapla）[2-3]。
葡萄种植在黄河古道地区有悠久历史， 伴随而
来的葡萄根结线虫病普遍发生， 对葡萄生产和育苗
造成很大的危害 [4]，但病原线虫种类却未有明确报
道。近年来，分子鉴定已应用于根结线虫的分类鉴定
中并取得了很大的进展[5-7]。 ITS是核糖体 DNA中介
于 18S和 28S之间的内转录间隔区， 它们在生物进
化过程中显示种的特征，在种内具有高度保守性，在
不同种间又有不同程度的变异，是最广泛应用于寄生
虫种间分类鉴定的理想遗传标记[8-11]。我们对本地区
的葡萄感病病株进行了病原线虫的分离培养， 从形
态学和分子生物学两方面对其进行鉴定， 以明确黄
河故道地区的葡萄根结线虫种类，为线虫病害防治、
线虫与寄主间的分子互作、 抗线虫基因的筛选和利
用等提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
于 2008年 6月采集感染线虫葡萄根系，带回试
验室，用强水流冲洗，选择膨大根结，挑取成熟雌虫
和卵囊备用。 其编号和来源见表 1。
1.2 方法
收稿日期： 2010－06－09 接受日期: 2011－04－13
基金项目： 国家葡萄产业技术体系（cyjstx-30）
作者简介： 刘三军，男，副研究员，在读博士生，主要研究方向：果树抗病育种。 Tel: 0371-65330969，E-mail: grapecaas2006@163.com
觹 通讯作者。 Author for correspondence． Tel: 13608692946， E-mail: honglianli@sina.com
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2011.06.006
表 1 线虫样品编号与来源
Table 1 The samples of nemtodes collected
from different places
1.2.1 根结线虫形态鉴定 将成熟卵囊置灭菌水
中，25℃培养 24 h。 收集二龄幼虫，在显微镜下观察
其形态并照相。 挑取成熟雌虫， 观察其形态并照
相。 鉴定标准参照刘维志等[12]的方法。
1.2.2 根结线虫 DNA提取 参考欧师琪等[6]的方法
并加以改进，具体方法为：挑取 1个成熟卵囊放入灭
菌的 Eppendorf 管中捣碎，加入 10 μL 灭菌重蒸水，
25 ℃培养 24 h，获得二龄幼虫，充分搅匀后去杂质，
-20 ℃冷冻 2 h， 用灭菌牙签的端部充分研磨 2~5
min， 再加入 9μL蛋白酶 K溶液 （1 g·L-1）（Promega，
USA） ，离心 30 s，继续-20 ℃冷冻 2 h，将 Eppendorf
管置 65 ℃下温浴 1 h，95 ℃ 10 min， 最后 12 000
r·min-1离心 1 min， 取上清 DNA 悬浮液-20 ℃保存
备用。
1.2.3 ITS-PCR 扩增 选择扩增线虫 rDNA-ITS 区
的通用引物，序列为：引物 1（18S）：5’-TTGA TTAC
GTCC CTGC CCTT T-3’ 引物 2 （28S）：5’-TTTC A-
CAC GCCG TTAC TAAG G-3’。
采用 50 μL 的 PCR 反应体系，10×PCR Buffer 5
μL，引物各 1 μL，模板 DNA 10 μL，Premix Taq DNA
多聚酶 25 μL，灭菌重蒸水补足到 50 μL。 扩增条件
为 94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，51 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，
30 个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。 PCR 产物采用
1.0%琼脂糖凝胶（含 EB）100V 电泳 30 min，紫外检
测、照相。
1.2.4 PCR 产物的回收 PCR 产物采用 TIANGEN
公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收纯化， 具体
操作步骤参照试剂盒操作说明。
1.2.5 PCR 产物的克隆、测序和序列分析 将纯化
后的 PCR 产物进行连接转化，提取重组质粒 DNA，
经 PCR 鉴定后，筛选出含有正确插入片段的重组克
隆送上海英俊公司测序。 将测定的序列在 NCBI 中
利用 BLAST 程序进行同源性搜索，采用 DNAMAN、
CLUSTALX、MEGA 等分子生物学软件对克隆片段
与已报道的根结线虫序列进行同源性比对， 并生成
系统聚类图。
2 结果与分析
2.1 病原线虫形态鉴定结果
挑取病株根结进行观察， 可以看到根结外有透
明黄褐色胶质包含着的卵囊， 在显微镜下可以看到
卵囊里充满了长椭圆形的卵，挑取卵囊，可以看到与
卵囊紧密相连的呈梨形的雌虫，虫体乳白色，前体部
突出呈现为瓶颈状，后体呈现为球形，食道垫刃型，
中食道球发达，具有口针（图版-A）。 二龄幼虫线形，
长度约为 500 μm，头部可以看到发育良好的食道腺
和口针（图版-B）。 观察到的形态特征与刘维志[12]对
根结线虫的特征描述相一致， 由此初步判断病原线
虫为根结线虫。
2.2 根结线虫 rDNA-ITS的 PCR扩增结果
对 ITS-PCR 扩增结果进行电泳检测，得到大小
约为 800 bp（图 1）的 6 个 ITS 片段， 说明从 6 个不
同地区采集到得根结线虫的 ITS片段大小一致。
2.3 序列分析及同源性比较结果
测序结果表明，6 个线虫样品的 ITS 序列长度
一致，均为 766 bp，且碱基序列无差异，说明属于同
一个种；在 NCBI 上进行序列对比，发现它与南方根
结线虫 （Meloidogyne incognita） 的 ITS 区编码序列
（序列号为 AY438556）具有极高同源性，一致性达
到 99.74％，ITS序列的聚类分析结果见图 2。
3 讨 论
根结线虫的鉴定方法主要分为形态鉴定和分子
鉴定 2种， 形态鉴定又以雌虫会阴花纹和同工酶鉴
定方法为主，但雌虫会阴花纹个体间常常存在差异，
刘三军等: 黄河故道地区葡萄根结线虫 rDNA- ITS-PCR研究
样品编号
Sample code
采样地点
Sample location
作物种类
Crop varieties
采集时间
Time
1
2
3
4
5
6
洛阳孟津
Mengjin，Luoyang
郑州郊区
Zhengzhou
开封陈留
Chenliu，Kaifeng
商丘平台
Pingtai，Shangqiu
安徽砀山果园场
Dangshan，Anhui
安徽萧县
Xiaoxian，Anhui
葡萄
Grape
葡萄
Grape
葡萄
Grape
葡萄
Grape
葡萄
Grape
葡萄
Grape
2008-06
2008-06
2008-06
2008-06
2008-06
2008-06
图 1 6 个根结线虫样品 ITS 的 PCR 扩增结果
M. DNA标准分子量，DL 100； 1~6 .样品代码见表 1
Fig. 1 The result of rDNA-ITS-PCR of 6 root-knot
nematode samples
M. DNA marker，DL 100；1 to 6 sample code see Table 1
M 1 2 3 4 5 6
800 bp
6 期 1105
图 2 分离到的根结线虫 ITS 序列的聚类分析
Fig. 2 The clustering analysis of ITS of Meloidogyne spp.
sample
并且在标本制作上需要一定的技巧， 同工酶鉴定虽
然较为准确，但却需要年轻雌虫的存在，因而限制了
该方法的应用[12]。 近年来国际上兴起的根结线虫各
虫态分子诊断方法的研究，不仅灵敏、快捷、准确，而
且可操作性强、重复性好、适用范围广，在多种果树
根结线虫病害以及多种线虫群体的鉴定上发挥了重
要作用。
试验采用根结线虫 rDNA-ITS-PCR 扩增的方
法， 用一对扩增根结线虫 ITS 区通用引物对我国黄
河故道地区葡萄根结线虫群体进行了鉴定， 首次明
确了该地区危害葡萄的根结线虫种类为南方根结线
虫（M. incognita）。 为今后黄河故道地区葡萄根结线
虫的研究和防治提供了理论依据， 为葡萄抗线虫基
因克隆、抗线虫育种奠定了基础。
目前，由于抗线虫基因的单一性，而大部分化学
杀线剂都会引起环境污染，因此，快速准确的对病原
线虫的鉴定，对于应用葡萄抗线虫性、抗性砧木的筛
选、检疫以及防治根结线虫病害，确保葡萄的高产及
安全生产具有极其重要的意义。 （本文图版见插 5）
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果 树 学 报 28 卷1106