全 文 ：第 35 卷第 1 期
2016 年 2 月
中 国 野 生 植 物 资 源
Chinese Wild Plant Ｒesources
Vol． 35 No． 1
Feb． 2016
收稿日期:2015 － 06 － 18
基金项目:“十二五”国家科技支撑计划(2011BAD33B02);国家自然科学基金项目(31100224)。
* 通讯作者:孙力军，博士，副研究员。主要研究方向:植物资源综合利用和开发。E － mail:shengwudiqiu@ 126． com
doi:10． 3969 / j． issn． 1006 － 9690． 2016． 01． 003
能源植物续随子延伸因子 EF1A基因
cDNA序列的克隆及分析
姚正颖1，张 丹2，李春霞2，侯北伟1，张卫明1，孙力军1*
(1． 南京野生植物综合利用研究院，江苏 南京 210042;2．南京师范大学 生命科学学院，江苏 南京 210023)
摘 要 利用同源克隆和 cDNA 末端快速扩增技术(ＲACE)克隆得到能源植物续随子延伸因子 EFIA 基因的
cDNA 序列(命名为 ElEF1A，GenBank 登录号为 KT892703)。序列分析表明，ElEF1A 编码序列(CDS)长 1 344
bp，编码 447 个氨基酸，氨基酸序列具有典型的 EF1 － alpha、EF1 － alpha － Ⅱ和 EF1 － alpha － Ⅲ 结构域。
ElEF1A 与其他植物 EF1A 基因的核苷酸序列同源性达到 88% 以上，推导的氨基酸序列的同源性达 95%
以上。
关键词 续随子;EF1A 基因;内参基因;ＲACE
中图分类号:Q785 文献标识码:A 文章编号:1006 － 9690(2016)01 － 0006 － 06
Cloning and Sequence Analysis of Elongation Factor 1 alpha
Gene from Energy Plant Euphorbia lathyris
Yao Zhengying1，Zhang Dan2，Li Chunxia2，Hou Beiwei1，Zhang Weiming1，Sun Lijun1*
(1． Nanjing Institute for Comprehensive Utilization of Wild Plants，Nanjing 210042 ，China;
2． College of Life Sciences，Nanjing Normal University，Nanjing 210023，China)
Abstract The cDNA sequence of elongation factor 1 alpha gene (EF1A)from energy plant Euphorbia
lathyris was cloned using homologous cloning and rapid amplification of cDNA ends (ＲACE)． The
cloned sequence was referred as ElEF1A with an accession no． of KT892703 deposited in GenBank． The
coding sequence (CDS)of ElEF1A was 1344 bp in length，encoding 447 amino acid redidues． The de-
duced protein of ElEF1A contained 3 typical conserved domains that were EF1 － alpha，EF1 － alpha －Ⅱ
and EF1 － alpha －Ⅲ． Comparing with other plant originated EF1A，the homoly of nucleotide sequences
and the predicted amino acid sequences were higher than 88% and 95%，respectively．
Key words Euphorbia lathyris;EF1A gene;reference genes;ＲACE
真核生物蛋白质生物合成的翻译延伸阶段需
要几个可溶性蛋白的参与，这些蛋白称作真核生
物延伸因子(eEF)，包括 eEF1 和 eEF2。eEF1 由 4
个亚基构成，分别为 eEF1A、eEF1Bα、eEF1Bβ 和
eEF1Bγ，发挥介导氨酰 － tＲNA 与核糖体结合的作
用［1］。eEF1A在生物体细胞内大量存在，含量占
正常细胞总蛋白的 1% ～ 3%，仅次于肌动蛋白 Ac-
tin［2］。eEF1A是 G 蛋白家族一员，在蛋白质翻译
延伸过程中的发挥鸟苷三磷酸酶(GTPase)的作
用。即 eEF1A首先与 GTP 结合成二元复合物，运
送氨酰 － tＲNA 进入核糖体的氨酰位(A 位)。一
旦与 mＲNA形成正确的密码子 －反密码子对，GTP
立即水解成 GDP，eEF1A·GDP 二元复合物就与
氨酰 － tＲNA 解离而释放［1］。eEF1A 除了参与蛋
白质翻译外，还有许多重要功能，如参与蛋白降
解、细胞生长与增殖、信号传导、翻译控制、细胞骨
架组成、细胞凋亡等［3 － 4］。eEF1A 在真核生物体
中所发挥的诸多重要功能说明了该蛋白是高度保
守的。
续随子(Euphorbia lathyris Linn．)属于大戟科
—6—
第 1 期 姚正颖，等:能源植物续随子延伸因子 EF1A基因 cDNA序列的克隆及分析
(Euphorbiaceae)大戟属(Euphorbia Linn．)，是一种
极具开发价值的能源植物。研究表明续随子种子
含油量高达 43． 3% ～ 47． 0%［5 － 6］，油中脂肪酸成
分以 C16、C18 脂肪酸为主，且油酸(只含 1 个不饱
和双键)含量可高达 84． 42%［7］，与理想柴油替代
品的分子组成相类似，是生产生物柴油的优良原
料［8］。此外，续随子乳汁管能分泌白色乳汁，其中
富含与石油成分类似的碳氢化合物，经分离提取
和处理，可制成石油化工产品［9］。作为一种甜土
植物，续随子还具有一定耐盐和耐旱性［10 － 11］，适
宜在沿海滩涂或干旱少雨沙化地区发展种植。因
此续随子是兼具能源收益和生态效益的新型能源
油料作物。
目前对于续随子抗性和脂肪酸代谢相关的分子
生物学研究已成为研究续随子的新方向。实时定量
PCＲ是深入分析相关功能基因表达和调控的重要
手段，因此需要选择合适的内参基因进行校正和标
准化。传统持家基因如 3 －磷酸甘油醛脱氢酶基因
(GAPDH)、肌动蛋白基因(Actin)、EF1A基因以组成
型稳定表达而常被选作内参基因［12］。目前已有许
多植物 EF1A基因被成功分离，如玉米［13］、棉花［14］、
拟南芥［15］、木薯［16］、橡胶［17］、油桐［18］等，然而关于
续随子 EF1A基因的研究尚未见文献报道。本研究
利用同源克隆和 ＲACE 技术克隆了续随子 EF1A基
因 cDNA序列，以期为续随子分子生物学研究奠定
基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
续随子种子为南京野生植物综合利用研究
院保存的高油品种。选取成熟种子 100 粒，用稀
释 1 000 倍的多抗霉素加吐温 80 浸泡 4 h，自来
水冲洗 5 ～ 6 次，种在 Hoagland 营养液浸透的蛭
石中，置于25 ℃温室，12 h 光照 /12 h 黑暗交替
培养。20 d 后采集续随子幼苗，液氮速冻，－ 80
℃保存待用。
大肠杆菌 DH5α为本实验室保存。
1． 2 方法
1． 2． 1 总 ＲNA提取
采用 Beyozol 总 ＲNA抽提试剂盒(碧云天生物
技术研究所)提取续随子幼苗叶片的总 ＲNA，
－ 80℃保存待用。利用核酸蛋白检测仪和甲醛变性
胶电泳检测总 ＲNA的质量。
1． 2． 2 cDNA反转录合成
cDNA 合成按照 M － MLV 反转录酶(大连宝
生物工程有限公司)的操作说明进行。合成用于
扩增中间片段和 3 － ＲACE 的 cDNA 使用引物 3
－ CDS:5 － AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG-
TACT(30)VN － 3(V = A /G /C，N = A /G /C /T);
合成用于扩增 5 － ＲACE 的 cDNA 使用引物
EF1A5GSP2:5 － TGGGAGTAGTGGCATCCATCT-
TGTT － 3，将所得 cDNA 纯化，并利用末端脱氧
核糖核酸转移酶(大连宝生物工程有限公司)在
cDNA 的 5端加 Poly(C)尾。
1． 2． 3 续随子 EF1A基因中间片段的克隆
通过比对已发表的大戟科植物及其他植物
EF1A基因的核苷酸序列，根据序列的同源性设计
一对引物，用于扩增 EF1A 基因中间片段。EF1A －
up:5 － CACACTAACATHGTNGTCATT － 3 ;EF1A
－ dowm:5 － ACNACCATGGGCTTGGTNGG － 3。
扩增程序:94℃ 3 min;94℃ 50 s，55℃ 50 s，72℃ 1
min，30 个循环;72℃ 10 min。用 1%琼脂糖凝胶电
泳检测扩增产物。得到与预期大小相符的条带后，
用生工生物工程公司的 SanPrep 柱式胶回收试剂盒
进行回收纯化，将目的片段与 pMD19 － T 载体体系
连接，转化大肠杆菌 DH5α 感受态，经菌落 PCＲ 验
证正确后，转至含 100 mg /L氨苄青霉素的 LB 液体
培养基中振荡培养，菌液送上海美吉生物医药有限
公司测序。
1． 2． 4 续随子 EF1A基因 3 － ＲACE 和 5 － ＲACE
的克隆
根据已获得的续随子 EF1A 基因中间片段，设
计 3 － ＲACE 扩增引物:EF1A － 3 GSP1(5 － TG-
GATTGCCACACCTCCCACATAGC － 3)和 Short(5
－ CTAATACGACTCACTATAGGGC － 3);设计 5 －
ＲACE 扩增引物:EF1A5 GSP1(5 － TGAGGACAG-
CACAGTCAGCCTGCGA －3)和 OligodG1(5 － AAG-
CAGTGGTATCAACGCAGAGTSC(G)12HN － 3)。3
－ ＲACE 和 5 － ＲACE 的扩增采用降落 PCＲ，反应
条件均为:94 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，5 个循环;94 ℃
30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，5 个循环;94 ℃ 30 s，
68 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，25 个循环。用 1%琼脂糖凝
胶电泳检测扩增产物，扩增产物经回收、连接、转化
及测序得到目的片段。
1． 2． 5 续随子 EF1A基因 CDS 全长的获得
将测序正确的中间片段及其 3 端、5 端序列通
过 Vector NTΙ Advance11 软件拼接并获得 EFIA 基
—7—
中 国 野 生 植 物 资 源 第 35 卷
因开放式阅读框(OＲF)。根据 OＲF 设计一对特异
性引物 EF1A － S 和 EF1A － A，扩增 获得续随子
EF1A基因 CDS 全长。EF1A － S:5 － ATGGGTAAG-
GAGAAGGTTCACATC －3;EF1A － A:5 － AAGTCT-
GCAGCCAAGAAGAAATGA －3。
1． 2． 6 续随子 EF1A基因序列分析
利用 Vector NTΙ Advance11 软件分析续随子
EF1A 基因 OＲF、推导氨基酸序列。利用 NCBI网
站在线 BLAST 程序对测定序列进行核苷酸和氨
基酸的同源性比对。利用 NCBI 网站在线保守区
数据库(CCD)分析预测氨基酸序列的结构域。
利用 MAGA4． 1 软件对预测氨基酸序列进行进化
树分析。
2 结果与分析
2． 1 续随子叶片总 ＲNA样品的质量检测
续随子叶片总 ＲNA 的甲醛变性胶电泳结果如
图 1 所示，28S rＲNA、18S rＲNA 条带清晰，无拖尾
现象，说明该试验提取的 ＲNA 完整性较好。利用核
酸蛋白检测仪测定 ＲNA 的纯度，A260 /A280 为 1． 9
左右，表明续随子叶片总 ＲNA 提取质量高，可用于
后续的分子生物学分析。
图 1 续随子叶片总 ＲNA甲醛变性胶电泳
2． 2 续随子 EF1A基因 CDS序列的获得
通过同源克隆获得 EF1A 基因 cDNA 中间片
段，大小约为 1100 bp。经测序和 BLAST 比对验
证正确后，基于该片段设计特异引物扩增 3 －
ＲACE 和 5 － ＲACE，大小分别为 650 bp 左右和
500 bp 左右(图 2)。采用 Vector NTΙ Advance11
软件对所有片段进行拼接，结合 BLAST 比对和分
析，找到续随子 EF1A 基因的 OＲF。基于该 OＲF
设计引物进行 PCＲ，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳
检测，在约 1 300 bp 处可见明显条带(图 2)，与
预期大小相符，测序结果与拼接结果一致。续随
子 EF1A 基因的 CDS 序列全长 1344 bp，编码 447
个氨基酸。将该基因 cDNA 命名为 ElEF1A，Gen-
Bank 登录号为 KT892703。
M． Marker;1． 中间片段;2． 5片段;3． 3片段;4． CDS片段
图 2 续随子 EF1A基因 cDNA序列扩增电泳图
完整的 ElEF1A基因 cDNA 序列和编码蛋白的
氨基酸序列如图 3 所示，经 NCBI 网站在线保守区
数据库(CCD)分析，该蛋白氨基酸序列具有典型的
EF1 － alpha、EF1 － alpha －Ⅱ和 EF1 － alpha －Ⅲ 结
构域。
2． 3 续随子 EF1A 基因序列同源性及系统进化
分析
将续随子 EF1A 基因的核苷酸序列及其编码
的氨基酸序列提交至 NCBI 进行在线 BLAST 分
析，结果表明，ElEF1A 与蓖麻、油桐、水稻、玉米、
葡萄、蔷薇、大麦、番茄、含羞草等植物的 EF1A 基
因高度同源，如与同属大戟科蓖麻和油桐的相似
性达到 90%，与陆地棉、碧桃的相似性达到 88%。
ElEF1A基因编码的氨基酸序列与同科植物蓖麻、
麻疯树以及不同科植物葡萄、巨桉的相似性高达
99%。选取相似性较高的 8 种植物 EF1A 氨基酸
序列进行多序列比较分析，结果显示，不同植物的
EF1A氨基酸序列相当保守，序列相似性均在 95%
以上，最高达到 99%，仅在少数位置有差异
(图 4)。
利用 MAGA4． 1 软 件，选 择 相 邻 连 接 法
(neighbor joining，NJ)绘制进化树。结果如图 5
所示，续随子 EF1A 基因推测的氨基酸序列与同
属大戟科植物蓖麻子 ＲcEF1A 氨基酸同源性最
高且聚为一支，说明二者亲缘关系最近;与碧桃
PpEF1A 氨基酸同源性次之;而与物种同源性最
低的拟南芥相比，氨基酸序列同源性也高达
96%，进一步证明了 EF1A 是一种高度保守的基
因，在物种进化过程中可能执行相近的功能。通
过上述生物信息学分析结果，可以初步确定本试
验所克隆的 CDS 为续随子延伸因子基因，且具有
高度保守性，有可能成为研究续随子其他功能基
因的内参基因。
—8—
第 1 期 姚正颖，等:能源植物续随子延伸因子 EF1A基因 cDNA序列的克隆及分析
下划线部分表示 EF1 － alpha区域;阴影部分表示 EF1 － alpha －Ⅱ区域;方框部分表示 EF1 － alpha －Ⅲ区域
图 3 续随子 EF1A基因核苷酸序列、氨基酸序列和保守区域
EF1A氨基酸来源和 GeneBank 登录号:AtEF1A
(拟 南 芥， CAA34456 ); StEF1A (马 铃 薯，
ABB86283);ＲmEF1A(蔷薇，AEQ75495);ZjEF1A
(枣树，AEN79476);PpEF1A(碧桃，EMJ19204);
ＲcEF1A(蓖麻，XP_002528028);GmEF1A(大豆，XP
_ 003553293);GhEF1A (陆 地 棉，ABA12218);
ElEF1A(续随子，unassigned)
—9—
中 国 野 生 植 物 资 源 第 35 卷
图 4 续随子 EF1A基因编码的氨基酸序列与其他植物 EF1A基因编码的氨基酸同源性分析
图 5 续随子 ElEF1A与其他植物 EF1A氨基酸序列进化树分析
3 讨 论
由于能源植物续随子的分子生物学研究尚未全
面开展，为了研究续随子抗性和脂肪酸代谢相关功
能基因的表达和调控，需要克隆一些组成型稳定表
达的基因作为候选内参基因。本课题组前期已通过
—01—
第 1 期 姚正颖，等:能源植物续随子延伸因子 EF1A基因 cDNA序列的克隆及分析
同源克隆技术和 ＲACE 技术获得了续随子的肌动蛋
白基因(Actin)作为候选内参［19］，本研究采用相同的
方法克隆了续随子的 EF1A基因。根据已知大戟科
植物及其他植物 EF1A基因的核苷酸保守区设计简
并引物，扩增获得了续随子 EF1A基因的中间片段。
对于 EF1A基因的 5 和 3 端序列的扩增，本研究采
用了改良的 ＲACE 技术。首先在合成 cDNA 第一条
链时，在 oligod(T)引物的 3 端引入两个简并的核
苷酸 V、N(V = A /G /C，N = A /G /C /T)，使引物锚定
在 Poly(A)尾的起始点，减小 oligod(T)与 Poly(A)
尾的其他部位结合的机率，从而增大了扩增效率。
另外，在 5 端加尾时，利用 Poly(C)引物代替常用
的 Poly(A)，同时采用降落 PCＲ，提高了退火温度，
进一步增大了特异性条带的扩增效率。利用改良
ＲACE技术扩增未知基因不仅高效而且节省费用，
将为其他真核生物的基因克隆提供参考。
本研究获得的续随子 EF1A 基因 cDNA 的 CDS
全长 1 344 bp，编码 447 个氨基酸。经 BLAST 比对
分析，植物 EF1A蛋白高度保守，表明 EF1A 基因可
能在物种进化过程中执行相近的功能。将本研究获
得的 EF1A 基因与 NCBI 的 GenBank 数据库中已登
录的 1 条续随子 EF1A 基因(登录号 JQ694163． 1)
进行比对发现，二者 CDS 长度相同，核苷酸相似度
为 94%、推测的蛋白氨基酸相似度为 98%，表明续
随子的 EF1A 可能由至少 2 个基因编码。研究证
实，植物的 EF1A大多由多基因编码，如大豆和胡萝
卜 EF1A由 2 个基因编码、拟南芥和水稻的 EF1A由
4 个基因编码、棉花的 EF1A 由 9 个基因编码、玉米
的 EF1A由 10 个以上基因编码［13 － 14，20］。这种现象
可能保证了植物在各种逆境条件下蛋白质翻译的真
实性。
对已克隆的植物 EF1A基因研究表明，EF1A 的
表达受激素、环境胁迫和生育过程等因素诱导，进而
调控蛋白质合成，以适应各种环境条件和植物生长
发育阶段的需要。此外 EF1A还是一种组织特异性
表达蛋白［3］。因此，以 EF1A 作为研究续随子抗性
和脂肪酸代谢相关功能基因表达和调控的候选内参
基因，其在不同处理条件下以及不同组织部位中的
表达稳定性还需进一步深入研究。
4 结 论
本研究克隆得到续随子 EF1A 的 cDNA 序列
(ElEF1A)，CDS全长 1 344 bp，编码 447 个氨基酸，
氨基酸序列具有典型的 EF1 － alpha、EF1 － alpha －
Ⅱ和 EF1 － alpha －Ⅲ 结构域。ElEF1A 与其他植物
EF1A基因的核苷酸序列同源性达到 88% 以上，推
导的氨基酸序列同源性达 95% 以上。
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(下转第 27 页)
—11—
第 1 期 高华娟，等:福建产山药资源的腺苷含量比较研究
出腺苷的供试品中腺苷含量均高于冬虫夏草腺苷规
定含量，含量最高的 53 号(邵武Ⅰ，0． 2163%)是冬
虫夏草腺苷规定量的 20 倍多，含量最低的是 9 号
(连城Ⅰ，0． 0352%)是冬虫夏草腺苷规定量的 3 倍
多。腺苷作为山药中的有效成分之一，可以作为山
药及山药相关产品的质量标准的指标性成分，在揭
示山药药效物质基础方面具有十分重要的意义。
福建省山药种质资源丰饶，种植历史悠久，是我
国山药主要原产地及重要生产地之一。该省山药种
植面积近 30 000 hm2［5，11］，其中漳州云霄马铺乡山
药种植面积就达到 800 hm2，种植户多达 3 000 多
户。所以研究山药不同种质资源腺苷含量具有实际
意义，本研究用 HPLC方法对 72 份福建产山药种质
资源进行腺苷含量评价，为建立山药质量标准提供
更多科学数据，为选择培育、开发和应用优质的山药
品种提供了科学依据。
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