全 文 ：表 2　华脆苹果与 2个对照品种苹果原汁和浓缩汁品质及贮藏稳定性
品种 汁类 吸光值 透光率 (%) 黄色色差值 总色差值初始值 贮藏期 变化量 初始值 贮藏期 变化量 初始值 贮藏期 变化量 初始值 贮藏期 变化量
华脆 原汁 0.094 0.153 0.059 98.1 97.7 0.4 4.45 9.48 5.03 5.70 10.01 4.31
浓缩汁 0.058 0.565 0.507 98.3 56.6 41.7 2.73 18.68 15.95 2.98 21.42 18.44
国光 原汁 0.308 0.379 0.071 98.0 96.5 1.5 15.69 19.77 4.08 18.33 20.64 2.31
浓缩汁 0.198 0.320 0.122 97.8 94.8 3.0 10.89 15.55 4.66 11.28 16.52 5.24
红玉 原汁 0.115 0.212 0.097 98.9 97.6 0.7 6.57 13.31 6.74 7.34 14.04 6.70
浓缩汁 0.086 0.271 0.195 98.2 93.6 4.8 4.74 14.51 9.77 5.21 15.85 10.64
　　注:原汁在 4℃贮藏 6个月, 浓缩汁在 25℃贮藏 2个月。
好。华脆苹果浓缩汁在 25 ℃条件下贮藏 2个
月后 , 吸光值 、透光率 、黄色色差值 、 总色差
值的变化量均相对较大 , 说明华脆苹果浓缩汁
贮藏稳定性较差。华脆是一个比较适合制汁的
苹果品种 。
参考文献
1　吴卫华主编.苹果加工 .北京:中国轻工业出版社 , 2001
2　王成荣 , 杨增军 , 张华云 , 等.苹果加工技术研究.农业
工程学报 , 1997, 3 (13):220-222
3　QB/T1687-1993浓缩苹果清汁.北京:中国轻工业出版
社 , 1993
本文于 2010-07-07收到。
＊中国农业科学院中央级公益性科研院所基本科研业务
费专项 (0032010030);国家自然科学基金 (30871680)。
周宗山为通讯作者 , 电话:(0429) 3598268
葡萄根瘤蚜共生细菌分离与分子生物学鉴定＊
徐成楠 , 吴玉星 , 迟福梅 , 王海波 , 周宗山
(中国农业科学院果树研究所 , 辽宁兴城 125100)
　　摘　要　从严格密封温室的盆栽巨峰葡萄根系 、 寄生的葡萄根瘤蚜虫体和根际土壤中分离获得
17个细菌菌株 , 并对其 16SrDNA基因进行 PCR扩增和序列分析。结果表明 , 17个细菌菌株 16SrD-
NA均扩增出 1 500 bp左右的片断 , 通过与 Genbank上已知同源性较高细菌的 16SrDNA部分序列对
比 , 初步确定了这 17个细菌菌株分属于蜡状芽孢杆菌 (Bacillus　cereus)、 巨大芽孢杆菌 (Bacillus　
megaterium)、 枯草芽孢杆菌 (Bacillus　substilis), 其中蜡状芽孢杆菌 (菌株 C2、 R2、 L2、 L3、 L4)
和巨大芽孢杆菌 (菌株 L1、 L4、 R1、 R3、 C1、 B1、 B2、 J1、 J2)集中于葡萄根系和葡萄根瘤蚜虫
体 , 而枯草芽孢杆菌 (菌株 T1、 T2)只在根际土壤中发现 , 说明蜡状芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌为葡
萄根系和葡萄根瘤蚜的共生细菌。
关键词　葡萄　葡萄根瘤蚜　共生细菌　16SrDNA　分离　分子鉴定
　 　葡 萄 根 瘤 蚜 [ Daktulosphairaviticola
(Fitch)] 属同翅目根瘤蚜科 , 是葡萄上的专
性寄生害虫 。 18世纪葡萄根瘤蚜从北美洲传
入欧洲 , 对欧洲葡萄造成了毁灭性危害。 1935
年我国在山东烟台发现并确认有葡萄根瘤蚜。
由于近年来我国葡萄种植业的飞速发展 , 苗
木 、 种条等进口和国内调运频繁 , 2005年在
上海市马陆镇 、 湖南省怀化地区重新发现葡萄
根瘤蚜 , 随后在南北方多个地区发现葡萄根瘤
蚜 , 危害品种以欧美杂交种巨峰系为主[ 1 ] ,
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如不能对其进行有效防控 , 可能对我国葡萄栽
培造成严重危害。
昆虫中的共生细菌根据其在寄主昆虫体内
的分布和与寄主进化关系可以划分为原生共生
细菌和次生共生细菌。原生共生细菌分布于特
化的寄主昆虫细胞即含菌细胞内 , 与寄主协同
进化 , 垂直卵传。 1种昆虫只有 1种原生共生
细菌 。次生共生细菌不局限于含菌细胞 , 而且
还分布于寄主多种细胞内 , 可以垂直卵传和水
平传播 。 1种昆虫可以有多种次生共生细
菌[ 2 ] 。
葡萄根瘤蚜共生细菌研究起始于 20世纪
初 , 基于 PCR和序列分析技术使葡萄根瘤蚜
共生细菌得到了鉴定 [ 3 -4 ] 。尽管这些共生细
菌与葡萄根瘤蚜进化亲缘关系不是特别近 , 但
在葡萄根瘤蚜生长和繁殖 [ 5 ] 、 对寄生蜂的抗
性[ 6 ] 、 对高温环境的适应 [ 7 ] 、 寄主范围[ 8 ]等
方面的研究中具有重要的影响。利用葡萄根瘤
蚜共生细菌 16SrDNA、 18SrDNA序列分析 ,
成团泛菌 (Pantoeaagglomerans)已经被鉴定
存在于葡萄根瘤蚜成虫 、卵和叶瘿部位 [ 9 ] 。
本研究首次从我国温室盆栽葡萄品种巨峰
根系中获得葡萄根瘤蚜共生细菌 , 对从葡萄根
瘤蚜不同时期虫体 、葡萄根系以及根际土壤中
获得的 17个细菌菌株进行分离和 16SrDNA序
列分析鉴定 , 构建系统发育树 , 明确了葡萄根
瘤蚜共生细菌的分类地位及亲缘关系 , 为进一
步研究葡萄根瘤蚜与其共生细菌的相互作用机
制提供理论基础。
1　材料与方法
1.1　供试虫源
本研究所用的葡萄品种为巨峰 , 盆栽 , 接
种的葡萄根瘤蚜为实验室离体根段保存 。
1.2　共生细菌的分离培养
在寄主葡萄根部按成虫 、 若虫 、 卵 (各
20 ～ 25个)和根际土壤 、 病根 、 健康根部 6
份样品进行取样分析 , 除土壤外其他样品先用
无菌水冲洗 2次后再换用 70%酒精进行表面
消毒 5 min(分钟 ), 再用无菌水冲洗 2次
(每次冲洗和消毒后虫体用离心机 12 000 r/
min离心收集), 转到新的 1.5 mL离心管中加
入 100 μLddH2 O, 用枪头捣碎并反复吸打 、
混匀 , 再将其均匀涂到 LB平板培养基上;土
壤样品少量直接用 200 μLddH2O稀释后取上
清液涂板。将上述 2种涂抹后的培养基于 37
℃条件下培养 24小时 , 挑取单菌落进行培养 ,
并记录菌落特征 。
1.3　总 DNA抽提
将培养的单菌落转入装有 15 mLLB液体
培养基的离心管中 , 在 37 ℃条件下 120r/min
震荡培养 24小时 , 离心并弃上清液 , 取下层
沉淀存于 -20 ℃冰箱备用。
用溶菌酶处理样品后采用 SDS法提取细
菌总 DNA。 ①辅助裂解:加 50 μL浓度为 100
μg/mL溶菌酶 , 37 ℃处理 1小时;②裂解:
加入 200 μL裂解缓冲液 (40 mmol/LTris-
HCl, pH值 8.0, 含 20 mmol/L乙酸钠 , 1
mmol/LEDTA, 1%SDS), 用吸管头迅速强烈
抽吸以悬浮和裂解细菌细胞;③加入 66μL浓
度为 5 mol/L氯化钠 , 充分混匀后 , 12 000 r/
min离心 10 min;④将上清液转移到新离心管
中 , 加入等体积的 Tris饱和酚 , 充分混匀后 ,
12 000 r/min离心 3 min;⑤取离心后的上清
液 , 加等体积的氯仿 , 充分混匀后 , 12 000 r/
min离心 3 min;⑥取上清液用 2倍体积预冷
的无水乙醇沉淀 , 15 000 r/min离心 15 min,
弃上清液;⑦用 400 μL70%的乙醇洗涤沉淀
2次;⑧沉淀真空干燥后 , 用 50 μLTE或超
纯水溶解 DNA后于 -20℃冰箱放置备用 。
1.4　共生细菌 16SrDNA部分片段的 PCR
扩增
采用细菌 16SrDNA通用引物 Forward
primer(5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-
3 )和 Reverseprimer(5 -AAGGAGGT-
GATCCAGCCGCA-3 ), 引物 浓 度为 10
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μmol/L。PCR反应体系:25 μL反应体系包括
10×PCR缓冲液 2.5 μL, Mg2+ (2.5 mmol/
L)2μL, dNTP(2.5mmol/L)2.5μL, 模板
DNA2 μL, Taq酶 (5 U/μL)0.4 μL, 正反
引物 (10 mmol/L)2 μL, 加去离子水至 25
μL;PCR反应条件:94 ℃预变性 5 min,接着进
行 35个循环(94 ℃变性 30 s, 55 ℃退火 60 s,
72℃延伸 2 min),最后在 72 ℃反应 5min后结
束。PCR扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测 。
1.5　序列分析
扩增的 16SrDNA特异性片段用 DNA凝胶
回收试剂盒 (上海生物工程技术服务有限公
司)回收并送上海生物工程技术服务有限公
司测序。利用 DNASTAR软件 , 根据 GenBank
中已知部分细菌 16SrDNA部分序列 (表 1)
与测得的未知细菌的序列比较 , 绘制系统发育
树 , 初步确立其系统发育关系和分类地位。
表 1　试验采用的GenBank中已知细菌 16SrDNA序列
菌　　株 编号 序列长度(bp)
Bacillusmegaterium菌株 wn611
Bacillusmegaterium菌株 O-2
Bacillusmegaterium菌株 EI-16
Bacillusmegaterium菌株 SB3112
Bacillusmegaterium菌株 pcwcw5
Bacilluscereus 菌株 HY-2
Bacilluscereus 菌株 Crk20
Bacilluscereus 菌株 G-1
Bacilluscereus 菌株 DS16
Bacilluscereus 菌株 2Y-2
Lactobaciluscurvatus
Bacillussubstilis 菌株 A2
Bacillussubstilis 菌株 HS-A38
DQ275184
GQ870260
FJ613544
GU191918
GQ284474
EU915687
GQ503329
FJ493041
EU834245
FJ493043
AJ621550
EU567068
GQ466597
1 491
1 452
1 222
1 547
1 557
1 822
1 473
1 078
1 460
1 068
1 401
1 437
1 464
2　结果与分析
2.1　葡萄根瘤蚜共生细菌的分离和形态特征
从 6份样品中共分离到 17个细菌菌株 ,
菌落形态及特征见表 2。从葡萄根瘤蚜的卵 、
若虫 、成虫 、 葡萄根系以及根际土壤中分离获
得的 17个细菌菌株 , 由菌落大小 、 颜色 、 菌
体表面突起和菌落边缘特征可以将所获菌株分
成 2个群体 , 其中菌株 L1、 L4、 C1、 R1、
R3、 B1、 B2、 J1、 J2、 T1、 T2、 T3在培养基
上生长速度较慢 , 菌落表面光滑 , 规则圆形;
菌株 L3、 C2、 T4、 L2、 R2在培养基上生长速
度较快 , 菌落表面绒状 , 形状不规则。
表 2　 17个供试细菌菌株菌落部分形态特征
菌株编号 来源 菌落直径(mm) 菌落形态
L1
L2
L3
L4
C1
C2
R1
R2
R3
B1
B2
J1
J2
T1
T2
T3
T4
卵
卵
卵
卵
成虫
成虫
若虫
若虫
若虫
病根
病根
健康根
健康根
土壤
土壤
土壤
土壤
6
10
25
6
5
10
8
5
5
5
5
5
5
6
6
10
10
白色 , 表面光滑 , 圆形
乳白色,表面绒状 ,形状不规则
乳白色,表面绒状 ,形状不规则
白色 , 表面光滑 , 圆形
白色 , 表面光滑 , 圆形
乳白色,表面绒状 ,形状不规则
白色,表面光滑,圆形
乳白色,表面绒状 ,形状不规则
白色 , 表面光滑 , 圆形
白色 , 表面光滑 , 圆形
白色 , 表面光滑 , 圆形
白色 , 表面光滑 , 圆形
白色 , 表面光滑 , 圆形
白色 , 表面光滑 , 圆形
白色 , 表面光滑 , 圆形
乳白色,表面绒状 ,形状不规则
乳白色,表面绒状 ,形状不规则
2.2　葡萄根瘤蚜共生细菌 16SrDNA部分片
段的 PCR扩增
为比较从不同时期虫体 、 葡萄根系及根际
土壤中获得的 17个细菌菌株的亲缘关系和分
类地位 , 采用 1对细菌 16SrDNA通用引物从
17个不同细菌样品中均扩增获得了大小约
1 500 bp的特异性片段 (图 1)。
2.3　共生细菌 16SrDNA序列比较分析和系
统发育树的构建
将测序结果在 GenBank上进行同源性检
索 , 从 Blast的结果中选取 13个相似率在
99%以上的细菌菌株 , 将其序列从 GenBank
中调出 , 与这 17个细菌菌株的 16SrDNA序列
进行对比后构建系统发育树 , 结果如图 2所
示 。供试菌株在 16SrDNA序列同源性上主要
可划分为 4簇 , 第 1簇中菌株 C2、 R2、L2、 L3
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图 1　17个供试细菌菌株 16SrDNAPCR扩增结果
和 T4与蜡状芽孢杆菌同源性为 99% ～ 100%,
由系统发育树可推断菌株 C2、 R2、 L2、 L3和
T4为蜡状芽孢杆菌;第 2簇中葡萄根瘤蚜共
生细菌 L1、 L4、 R1、 R3、 C1和菌株 B1、 B2、
J1、 J2与巨大芽孢杆菌同源性为 99% ～
100%, 可鉴定为巨大芽孢杆菌;第 3簇中菌
株 T1、 T2与枯草芽孢杆菌菌株 A2和 HS-
A38同源性分别为 100%、 99%, 可鉴定为枯
草芽孢杆菌;第 4簇中菌株 T3与乳酸杆菌属
菌株同源性为 87%。
图 2　17个供试细菌菌株的 16SrDNA系统发育树
3　结论和讨论
本研究从国内严格密封温室盆栽葡萄品种
巨峰中寄生的葡萄根瘤蚜虫体 、葡萄根系和根
际土壤中分离获得 17个细菌菌株 , 成功离体
培养 , 研究了 17个共生细菌的菌落形态特征
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并利用细菌菌株的部分 16SrDNA序列分析 ,
初步确定了这 17个细菌菌株的分类地位。结
果表明 , 葡萄根瘤蚜共生细菌属于芽孢杆菌属
中的巨大芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌;被葡萄根
瘤蚜侵染的病根部位所得菌株 B1、 B2也属于
巨大芽孢杆菌;葡萄根际土壤中获得的菌株
T4属于蜡状芽孢杆菌 , 而 T1和 T2属于枯草
芽孢杆菌 。
由葡萄根系与葡萄根瘤蚜虫体部分共生细
菌为相同的种巨大芽孢杆菌推测 , 葡萄根瘤蚜
共生细菌可能与葡萄根系分泌物质有关 , 其与
葡萄根瘤蚜行为习惯可能有密切的联系 , 有待
于进一步研究 。
对葡萄根瘤蚜体内共生细菌的研究已表
明 , 共生细菌为蚜虫提供营养物质和适应新寄
主植物所需的代谢酶是蚜虫生物型形成的主要
原因 [ 10] 。随着生物技术的发展 , 出现 1种新
的害虫防治思路为媒介昆虫 ———共生菌技术
(VIST)。由于共生菌芽孢杆菌属于单细胞生
物 , 在进行基因工程改造时比对宿主昆虫进行
操作要方便很多 , 因而利用基因工程方法转化
这些共生细菌 , 降低其在宿主营养及生殖方面
所起的作用 , 不仅可以降低葡萄根瘤蚜的发生
率 , 而且可以减少植物病毒的传播 。芽孢杆菌
作为常见的基因工程受体菌在生物农药研制中
起重要作用 , 而且其许多种类是昆虫的病原
菌 , 具有杀虫活性 [ 11 ] 。基于 16SrDNA序列分
析技术已经广泛应用于细菌和其他微生物的鉴
定 , 但仍需要结合生物学 、 形态学等手段来具
体区分鉴定细菌及其相关序列 , 仅仅依靠这一
手段尚不具有完全说服力。
目前国内没有开展葡萄根瘤蚜共生细菌相
关研究 , 本文首次针对温室盆栽葡萄品种巨峰
葡萄根瘤蚜进行细菌分离 、 序列分析 , 初步确
定了葡萄根瘤蚜共生细菌的来源 、 种类 。由系
统发育树可知 , 来自葡萄根瘤蚜不同时期虫
体 、 葡萄根系 、根际土壤中的共生细菌有密切
关系 , 虫体内的细菌可能与根系分泌物质或根
系内生细菌有关 , 共生细菌在国内葡萄根瘤蚜
体内是否有共生体器官和其寄生的位置 , 其与
寄主葡萄根瘤蚜共生互作的方式需要进一步研
究 。
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