全 文 ：文章编号:1007-5570(2002)03-0001-04
高梁根质膜K+转运蛋白在人工脂质体上的活性重组

乙　引1 ,汤章城2
(1.贵州师范大学 生物科学技术系 , 贵州 贵阳　550001;2.中国科学院 上海植物生理研究所 , 上海　200032)
摘要:将高粱根质膜中 K+-ATPase活性重组入人工脂质体中 , 并研究了脂蛋白体的性质。 结果表明 , 脂蛋白体
中脂和蛋白质浓度与离子转运活性呈正相关 ,当其含粗提大豆磷脂且脂/蛋白比率为 35 时 , 其 K+转运活性最
大。
关 键 词:K+转运蛋白;脂蛋白体;活性重组
中图分类号:Q945　　文献标识码:A
Active reconstitution into artificial liposome of K+transport protein
from plasma membrane of sorghum roots
YI Yin1 ,TANG Zhang-cheng2
(1.Department of Biological Science and Technology , Guizhou Normal University , Guiyang , Guizhou 550001 , China;
2.Shanghai Institute of Plant Physiology , Academia Sinica , Shanghai 200032 , China)
Abstract:This paper studies the active reconstitution of K+-ATPase into artificial liposome ,which demon-
strated good potassium transport ability.The comcentrations of lipid and protein are positive correlation to the
potassium transport activity.When the soybean lipid is present and the rate of lipid to protein is 35 , the
potassium transport activity reaches the maximum.
Key words:K+transport protein ,proteoliposome , active reconstitution
0　引言
多年来 ,大量阳离子运输特别是对真核细胞
Ca2+ 、H+、Na+和 K+过膜运输的研究使人们认识
到运输 ATP 酶的存在。这些酶有很多共性 ,它们
是一类离子转运 ATP 酶 ,无论是在结构上还是在
功能上均不同于线粒体 、类囊体和细菌 F1F0 类型
的H+转置ATP 酶。迄今 ,从很多真核细胞中都分
离出了离子转运 ATP 酶 ,并得到详细的研究 。它
直接利用 ATP水解的能量完成离子逆浓度梯度的
运输 ,其中以兔肌质网 Ca2+-ATP 酶 、动物质膜
Ca2+-ATP 酶和(Na+-K+)-ATP 酶 、胃分泌液
(K+-H+)-ATP 酶以及真菌质膜 H+-ATP 酶的
研究较为典型[ 1-4] 。在过去几年中 ,大量证据表明
原核生物也具有直接以 ATP 为能源的运输系统 ,
它们是离子转运ATP 酶。在 E.coli 中发现了 2个
K+运输系统 —Kdp系统和 Trk系统 ,它们均可进行
1
收稿日期:2002-01-06
基金项目:国家自然科学基金重点资助项目(3920040)
　第 20 卷 第 3期
2002年 8 月 　　　　　　　
贵州师范大学学报(自然科学版)
Journal of Guizhou Normal University(Natural Sciences)　　　　　　　　
Vol.20.No.3
Aug 2002
细胞质的 K+积累 。Kdp 系统以ATP 为能源 ,具有
高亲和力和低运输速度;Trk系统以ATP 和 PMF为
能源 ,有低亲和力和高运输速度[ 5] 。同样 ,在 Srep-
tococcus faecalis中存在 2个不同的 K+运输系统 Ktr
Ⅰ和 Ktr Ⅱ ,在酵母细胞中则发现高亲和的 TrkⅠ系
统[ 6] 。应用分子技术对其运输活性进行研究 ,已深
入认识了这些运输系统。
在高等植物中 ,大量对离子转运系统的研究集
中于质膜 H+-ATP 酶和 Ca2+-ATP 酶[ 7] 。目前 ,
我们已在高粱根中发现了一种 K+-ATP 酶 ,它受
渗透胁迫诱导 ,具有高 K+亲和力[ 8、9] 。本文报道
该K+-ATP 酶被活性重组到人工脂质体的过程 ,
为进一步进行该转运系统结构和功能的研究打下
基础 。
1　材料和方法
1.1　实验材料
用Hoagland营养液培养 6 d的高粱根。
1.2　实验方法
1.2.1　K+-ATP 酶的提取和纯化　参照乙引等
(2000)的方法[ 10] 。
1.2.2　脂质体的构建　取 100mg大豆磷脂酰胆碱
(IV-S型 ,Sigma公司产品),用氯仿:甲醇(9∶1)溶
解 ,氮气干燥 ,然后用己烷溶解 ,氮气下吹干。加入
含 5ml 10mmol/L TEA/Cl , 100μmol/L KCl , 1mmol/L
EDTA , 20mmol/L Tris -HCl pH7.6 以及 80μmol/L
PBFI的缓冲液 ,冰浴中超声波分散 ,得到脂质体悬
浮液 。
1.2.3　运输系统的重组　用 2ml一次性注射器作
为微型层析柱 ,内装Sephadex G-50-80 ,预先用含
有0.5mmol/L EGTA ,20mmol/L Tris-HCl(pH7.6)的
缓冲液中吸胀 ,平衡 。蛋白重组之前 ,微层析柱先
在 1000 ×g 离心 13 s 去除过量的溶液 , 得到干
Sephadex。将洗脱下的蛋白与 20mg/ml脂质体囊泡
混合 ,使最终体积为 100μl。加入样品到胶的顶部 ,
静置 30 min后 ,在 700×g 离心 45s除去 CHAPS ,流
出液快速冷冻于干冰/丙酮浴 ,得到重组脂蛋白体 。
1.2.4　脂蛋体和蛋白的密度梯度分离　脂质体悬
浮于含 30%50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)缓冲溶液
中 ,分别用含不同浓度蔗糖的 50mmol/L Tris-HCl
(pH7.4)缓冲铺于其上 , 浓度依次为 20%、10%、
5%和 0%。在 4℃下 120 000离心 2 h ,用毛细管从
离心管底部收集 10%～ 15%蔗糖界面组份 ,测定
其磷脂含量。
1.2.5 　电镜观察 　脂质体在 100 000×g 离心
30min ,弃上清液 。沉淀在含有 137mmol/L NaCl ,
2.7mmol/L KCl , 1.5mmol/L KH2PO4 和 19mmol/L
Na2HPO4的 2.5%戊二醛中 4℃过液 ,固定 ,然后 50
000×g 离心 15min。沉淀中加入 10μl甘油 ,室温放
置1h ,液N2 中冰冻蚀刻并复制 ,复制膜用二甲基
甲酰氨(dimethyl formamide)洗 1h ,分别用 50%漂白
粉和 0.1mol/L NaOH轮流漂洗 6 h ,蒸馏水换洗几
次过夜。切片用 200目铜网捞起 ,在电镜下观察 。
1.2.6　蛋白含量测定　参照 Smith 等(1985)的方
法测定蛋白[ 11] ,以 BSA为标准蛋白 。
1.2.7　磷脂含量的测定　吸取 0.1ml抽提液 ,加
入 0.1ml浓 H2SO4 和 0.1mlH2O2 ,加热至样品全部
酸解 ,冷却后加入 1ml 2%钼酸铵 ,0.4ml还原剂(含
0.1%1-氨基-2-萘酚-磺酸 , 0.2%Na2SO4 , 6%
NaHSO4)和 1.5ml H2O ,摇匀静置 3min ,在 700nm 处
比色 。用大豆磷脂作为标准 。
2　结果和讨论
2.1　蛋白质的重组
生物膜物质转运的研究一般是以细胞囊泡和
脂蛋白体的形式进行的。质膜囊泡技术排除了细
胞内各种酶 、代谢中间产物以及其它生物膜的干
扰 ,而且可根据实验所需进行膜两侧运输过程的分
析 ,是研究细胞质膜上运输系统的有用模型 。但
是 ,由于膜囊泡中还含有其它成分 ,对物质转运本
身可能产生的影响 ,因此 ,要真正了解运输系统结
构 、功能和调节等方面的特性 ,必须获得具有活性
转运功能的脂蛋白体 ,该脂蛋白体含有活性质膜内
在蛋白(integal protein),是最简单的类似于细胞膜
的结构。膜重组过程包括 3个方面 ,即膜蛋白的去
垢剂溶解 、脂质体的制备和脂蛋白体的形成 。膜组
分的功能性重组完全避免了细胞内的细胞膜上各
种成份的影响 ,它具有专一性 ,在运输系统的研究
中起到非常重要的角色 ,它不仅可以证实某些多肽
的运输功能 ,鉴定多肽结构中的功能组份 ,而且还
可以研究膜和非膜组份在运输功能中的作用。
表 1　膜蛋白在脂质体上的重组效率
Proteoliposomes
prepared by filtration
Proteoliposomes
prepared by the dialysis
Protein 94±6% 83±6%
2
　　　　　　　　　　　　　　　　　　贵州师范大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　第20卷　
　　虽然生物膜上脂质和蛋白的结构非常复杂 ,但
是不论它是由磷脂 、鞘脂以及胆固醇以何种方式构
成 ,其基本物质的化学性质是相似的 ,由类脂和蛋
白质以非共价形式结合而成 。因此只要在人工脂
质体上嵌入特定的活性分子 ,加上某些必要的条
件 ,就可以进行离体生物膜的模拟实验 。它可以突
出某一分子或因素的作用机制 ,排除完整生物膜整
体反应的各种复杂因素 ,所以可获得整体实验和质
膜囊泡实验难以得到的满意结果 ,这在高等植物离
子运输研究中已得到证实 。
蛋白与脂质体重组的方法很多 ,其中渗析法较
为常用 ,但是该法所需时间长 ,蛋白损失严重 ,重组
效率有限。表 1比较了渗析法和快速离心法脂蛋
白质的重组效率 。结果表明 ,快速离心法可使蛋白
重组效率达到 94%以上 ,而通过透析却只有 83%,
因此 ,快速离心方法是制备能进行 K+转运重组脂
质体的有效方法 ,它不仅速度快 ,操作简便 ,而且重
组效率高 。
图1表明了纯化蛋白在脂质体中的重组情况 。
结果表明大豆卵磷酯制备的脂质体 ,大小均匀 ,同
时 ,可见有蛋白颗粒嵌入脂质体上 。
图 1　重组脂质体的冰冻蚀刻电镜观察
2.2　重组脂蛋白体的性质
K
+-ATP酶在脂质体中的活力受重组条件的
影响 。由多种磷脂混合形成的脂质体 ,其 K+转运
活力比由 PC 由 PE形成的脂质体要高 ,而由粗提
大豆磷脂形成的 ATP 酶 ,其 K+转运活力最高(图
2),这可能是由于其组份与自然膜脂的组份大致相
同的缘故 。同样 ,随着脂/蛋白比率的增加 ,离子转
运活性逐渐提高 ,当脂/蛋白比率升至 35 时 ,离
子转运活性达到最大值 ,随后 ,出现下降趋势(图
图2　不同脂组份对 K+运输的影响
3)。固定脂/蛋白比率为 35不变 ,随着脂和蛋白质
浓度的进一步增加 ,离子转运活性呈线性增长(图
4)。由此可以看出 ,脂组份 、脂/蛋白比率对 K+运
输活性至关重要。
图 3　重组脂质体中磷脂/蛋白比率与
K+转运活性的关系
图 4　脂和蛋白浓度对纯化 ATPase的影响
Triton X-100能溶解脂膜上的膜脂 ,从而增加
脂蛋白体的透性 ,这样 ,ATP 就可结合脂蛋白体内
表面的 ATP 酶催化位 ,使不同朝向 ATP 酶活力得
以显现。由表 2结果可知 ,加入低浓度 Triton X-
100后 ,ATP 酶活力增加一倍 ,说明脂蛋白在形成
过程中蛋白的嵌入是随机的 ,即 K+-ATP 酶在人
3
　第3 期　　　　　乙　引 , 汤章城:高梁根质膜 K+转运蛋白在人工脂质体上的活性重组　　　　　　　　
工脂膜上两种朝向的比例相同 。
ATPase
activity
Triton X-100
stimulation
Latency of
ATPase
μmol/mg·h fold %
-Triton X-100 13.23
+Triton X-100 26.28 0.50 49.9
　　由离子导体对脂质体 K+转运的影响可以判断
脂质体的密闭性 。由图 5可知 ,含 K+脂质体本身
的K+转运活性非常低 ,表明该脂质体的脂双层对
K+通透性很小 。加入 K+/H+导体尼日利亚菌素
(Nigericin)后 ,导致K+快速流出。从这个结果可以
看出脂质体是密闭的 ,当运输蛋白重组入脂质体后
它可以进行K+转运的实验。
图 5　离子载体对 K+运输的影响
综上所述 ,利用快速离心法可以高效率地将
K+-ATP 酶活性重组入人工脂质体中 ,它具有 K+
转运功能。该脂蛋白体可进行转运蛋白结构和功
能的研究 。
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